vk2研究現(xiàn)狀課件

維生素K2研究進展維生素K2研究進展1CONTENTS維生素k2的研究背景及簡介01維生素k2的用途02生產(chǎn)菌株03維生素k2的代謝途徑04與維生素k2代謝相關(guān)的基因05國內(nèi)外研究的現(xiàn)狀06CONTENTS維生素k2的研究背景及簡介01維生素k2的用2研究背景維生素K2是一類重要的脂溶性凝血類維生素，是罕見的油脂資源。因其在食品中含量極少，素有“鉑金維生素”之稱，具有預防和治療骨質(zhì)疏松川、動脈鈣化、心血管疾病、腫瘤及帕金森癥等多種重要的生理作用。傳統(tǒng)的維生素K2一般采用化學合成法生產(chǎn)，但存在化學前體原料來源限制、化學反應(yīng)產(chǎn)生大量異構(gòu)體、副產(chǎn)物多、產(chǎn)率低、帶來環(huán)境污染等問題，且合成的維生素K2，其異戊二烯側(cè)鏈多是順式結(jié)構(gòu)，活性較低。而活性更高的天然維生素K2僅能通過微生物發(fā)酵法獲得，因此，微生物發(fā)酵法越來越受到人們的歡迎，具有廣闊的應(yīng)用前景。研究背景3維生素k2簡介維生素K2類化合物的結(jié)構(gòu)式（n=1，2，3，....14)維生素k2簡介維生素K2類化合物的結(jié)構(gòu)式（n=1，2，3，.4vk2的用途維生素K2在血液凝固中的作用維生素K2在骨骼代謝中的作用維生素K2的其他生理功能vk2的用途維生素K2在血液凝固中的作用維生素K2在骨骼代謝5維生素k2在血液凝固中的作用

在體內(nèi),維生素K2作為一個輔因子參與某些蛋白質(zhì)中谷氨酸殘基轉(zhuǎn)移后的羧化作用。這些蛋白質(zhì)包括維生素依賴性的凝血因子II(凝血素)、VII(前轉(zhuǎn)化素)、IX(克雷斯馬斯因子)、X(斯圖亞特因子)、蛋白質(zhì)C,蛋白質(zhì)S,蛋白質(zhì)Zv和生長抑制專一因子(Gas6)。和凝血級聯(lián)系統(tǒng)中其他的維生素K依賴性蛋白相比，蛋白質(zhì)C和X扮演者抗凝劑的角色。在凝血過程中,凝血酶原酶在Ca2+的促進下與磷脂質(zhì)體聚合,而當缺乏維生素K2時,凝血酶原就失去了對Ca2+的親和性。維生素k2在血液凝固中的作用在體內(nèi),維生素K26維生素快k2在骨骼代謝中的作用

研究人員己經(jīng)在人體骨骼中發(fā)現(xiàn)兩種維生素依賴性蛋白-------骨鈣素，也被稱之為Y_羧基谷氨酸(骨Gla蛋白或者BGP)和基質(zhì)Gla蛋白(MGP)，y-羧化作用的發(fā)生即是由維生素K依賴性的Y_羧化酶催化的。體內(nèi)和體外實驗表明維生素K可能直接參與骨骼的代謝。體外實驗己經(jīng)證明，維生素K2可以通過抑制前列腺素E2和白細胞介素-6等骨再生物質(zhì)的產(chǎn)生從而抑制骨骼的再吸收，維生素K2還能夠提高成骨細胞誘導的礦化作用水平，并且在類固醇處理的和切除卵巢的大鼠試驗中能夠抑制骨的流失。維生素快k2在骨骼代謝中的作用研究人員己經(jīng)在人7維生素k2的其他生理作用

維生素K2可降低病毒性肝硬化女性患者發(fā)生肝癌的風險。TsangCK等研究發(fā)現(xiàn)維生素K2能夠促進以神經(jīng)生長因子為媒介的PC12D細胞的軸突生長。PC12D細胞在神經(jīng)生長因子的存在下經(jīng)過維生素K2處理，大大增加了神經(jīng)細胞的比例以及乙酞膽堿醋酶的活動。Natural公司宣稱，維生素K2己經(jīng)被證實對白種人的心血管健康有利，原因在于維生素K2能夠協(xié)助調(diào)控Ca2十的利用和促進martxiGla-protein的活性，此蛋白能夠抑制血管的鈣化。維生素k2的其他生理作用維生素K2可降低病毒性8

原核生物的細胞呼吸作用發(fā)生在細胞膜上，泛醌（COQ和萘醌(MK)是兩類在原核生物的膜結(jié)合蛋白復合體中傳遞電子的脂溶性化合物，與菌體的呼吸代謝緊密相關(guān)。電子供體在酶的作用下傳遞2個電子給MK,MK再在另一個酶的作用下將這2個電子傳遞給電子受體，在這一過程中，主要依賴MK與MKH:之間的不斷循環(huán)，從而為呼吸鏈源源不斷地傳遞電子，因此這一過程也被成為維生素K循環(huán)，它在需氧和厭氧呼吸系統(tǒng)中的電子傳遞鏈上均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其電子傳遞示意圖如圖所示。維生素k循環(huán)與菌體呼吸原核生物的細胞呼吸作用發(fā)生在細胞膜上，泛醌（9維生素K循環(huán)維生素K循環(huán)10合成維生素K2的微生物有黃桿菌屬(Flavobacteriumsp.)、分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)、諾卡氏菌屬(Nocardiumsp.)、乳酸菌(Lacto—

bacillus)、鏈霉菌(Streptomyces)、納豆芽抱桿菌(Bacillussubtilisnatto)生產(chǎn)菌種合成維生素K2的微生物有黃桿菌屬(Flavobacteriu11維生素k2的代謝途徑

維生素K2由萘醌環(huán)和異戊二烯側(cè)鏈組成，合成途徑主要包括糖酵解(EMP)途徑、磷酸戊糖(HMP)途徑、甲羥戊酸(MVA)途徑、甲萘醌合成(MK)途徑4個部分，微生物以甘油為底物時，首先在甘油激酶(CK)作用下形成3-磷酸甘油，隨后在磷酸甘油脫氫(NAD(P)十)作用下氧化形成磷酸二羥丙酮，由此進入糖酵解途徑（EMP途徑)生成丙酮酸，丙酮酸脫羧形成乙酞-CoA，進人三羧酸循環(huán)途徑(TCA途徑)。同時，乙酞-CoA進人甲羥戊酸途徑(MVA途徑)形成聚異戊二烯焦磷酸(OPP);3-磷酸甘油進入磷酸戊糖途徑(PPP途徑)，維生素k2的代謝途徑維生素K2由萘醌環(huán)和異戊二12在轉(zhuǎn)酮酶作用下形成4一磷酸赤鮮糖，通過合成、脫水、脫氫形成莽草酸，最后反應(yīng)生成分支酸;由此進入MK途徑，menF,D,C,E,B基因簇編碼的6種關(guān)鍵酶和水解酶作用下形成醌骨架1,4一二羚基一2-萘甲酸(DHNA),最后與MVA途徑形成的聚異戊二烯焦磷酸在，men.A,UbiE/menG編碼的轉(zhuǎn)移酶脫作用下脫羧、甲基化形成甲萘醌(MK)。在轉(zhuǎn)酮酶作用下形成4一磷酸赤鮮糖，通過合成、脫水、脫氫形成莽13維生素k2的合成途徑維生素k2的合成途徑14維生素k2合成過程中各基因參與作用位置與vk2代謝相關(guān)的基因維生素k2合成過程中各基因參與作用位置與vk2代謝相關(guān)的基因15

從上圖中可以看出，共有八個酶分別控制從異分支酸開始的甲萘醌母環(huán)的合成以及從異戊烯焦磷酸開始的側(cè)鏈的合成，共有9個基因參與這一過程，它們分別是menA,menB,menC,menD,menE,menG,menH,hepT和hepS，其中hepT和hepS分別控制側(cè)鏈上同一個酶的兩個亞基的合成。根據(jù)測序結(jié)果，維生素K2合成途徑中的9個基因大小如下表。從上圖中可以看出，共有八個酶分別控制從異分支酸16維生素k2合成途徑中基因menA序列維生素k2合成途徑中基因menA序列17維生素k2合成途徑中基因menB序列維生素k2合成途徑中基因menB序列18維生素k2合成途徑中基因menC序列維生素k2合成途徑中基因menC序列19vk2研究現(xiàn)狀課件20LOREMIPSUMDOLOR維生素k2合成途徑中基因menD序列LOREMIPSUMDOLOR維生素k2合成途徑中基因m21LOREMIPSUMDOLORLOREMIPSUMDOLOR22LOREMIPSUMDOLOR維生素k2合成途徑中基因menE序列LOREMIPSUMDOLOR維生素k2合成途徑中基因m23LOREMIPSUMDOLORLOREMIPSUMDOLOR24維生素k2合成途徑中基因menG序列維生素k2合成途徑中基因menG序列25維生素k2合成途徑中基因menH序列維生素k2合成途徑中基因menH序列26維生素k2合成途徑中基因hepT序列維生素k2合成途徑中基因hepT序列27vk2研究現(xiàn)狀課件28維生素k2合成途徑中基因hepS序列維生素k2合成途徑中基因hepS序列29基于各個基因的上下游序列設(shè)計的引物基于各個基因的上下游序列設(shè)計的引物30國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀31MK-7FermentationProceduresFermentationwasconductedina3-Lfermentor(BioFlo/CelliGen115,NewBrunswickScientificCo.,USA).Thefermentorwasequippedwithatop-drivenstirrerwithtwosix-bladeRushtonimpellers(i.e.diameter45mm,width14mm,length14mm)andfourbaffles(i.e.width14mm).Filteredairwasinjectedthroughaperforatedpipespargerlocatedunderthebottomimpeller.Themaximumadjustablelevelsforaerationandstirrercontrollerswere5vvmand1,000rpm,respectively.Fermentationmediaconsistedof5%(w/v)yeastextract,5%(w/v)glycerol,18.9%(w/v)soypeptoneand0.06%(w/v)K2HPO4.B.subtilisnattosporesolutionwasaddedtothefermentationmediausinganinoculumsizeof2%(v/v).MK-7FermentationProceduresFe32LOREMIPSUMDOLORThefermentationmediaweremixedwithvegetable(soybean)oildropletsduringthefermentationperiodwhichwasusedastheanti-foamingagentwiththefinalratioof1/6(media/oil,v/v).Aftereachrun,themixtureofoilandmediawerecentrifugedat6,000rpmfor10mintoseparatetwophases.TheconcentrationofMK-7ineachphasewasthenmeasured.Allthefermentationexperimentswereconductedat40°C.LOREMIPSUMDOLORThefermentat33Thanks!Thanks!34維生素K2研究進展維生素K2研究進展35CONTENTS維生素k2的研究背景及簡介01維生素k2的用途02生產(chǎn)菌株03維生素k2的代謝途徑04與維生素k2代謝相關(guān)的基因05國內(nèi)外研究的現(xiàn)狀06CONTENTS維生素k2的研究背景及簡介01維生素k2的用36研究背景維生素K2是一類重要的脂溶性凝血類維生素，是罕見的油脂資源。因其在食品中含量極少，素有“鉑金維生素”之稱，具有預防和治療骨質(zhì)疏松川、動脈鈣化、心血管疾病、腫瘤及帕金森癥等多種重要的生理作用。傳統(tǒng)的維生素K2一般采用化學合成法生產(chǎn)，但存在化學前體原料來源限制、化學反應(yīng)產(chǎn)生大量異構(gòu)體、副產(chǎn)物多、產(chǎn)率低、帶來環(huán)境污染等問題，且合成的維生素K2，其異戊二烯側(cè)鏈多是順式結(jié)構(gòu)，活性較低。而活性更高的天然維生素K2僅能通過微生物發(fā)酵法獲得，因此，微生物發(fā)酵法越來越受到人們的歡迎，具有廣闊的應(yīng)用前景。研究背景37維生素k2簡介維生素K2類化合物的結(jié)構(gòu)式（n=1，2，3，....14)維生素k2簡介維生素K2類化合物的結(jié)構(gòu)式（n=1，2，3，.38vk2的用途維生素K2在血液凝固中的作用維生素K2在骨骼代謝中的作用維生素K2的其他生理功能vk2的用途維生素K2在血液凝固中的作用維生素K2在骨骼代謝39維生素k2在血液凝固中的作用

在體內(nèi),維生素K2作為一個輔因子參與某些蛋白質(zhì)中谷氨酸殘基轉(zhuǎn)移后的羧化作用。這些蛋白質(zhì)包括維生素依賴性的凝血因子II(凝血素)、VII(前轉(zhuǎn)化素)、IX(克雷斯馬斯因子)、X(斯圖亞特因子)、蛋白質(zhì)C,蛋白質(zhì)S,蛋白質(zhì)Zv和生長抑制專一因子(Gas6)。和凝血級聯(lián)系統(tǒng)中其他的維生素K依賴性蛋白相比，蛋白質(zhì)C和X扮演者抗凝劑的角色。在凝血過程中,凝血酶原酶在Ca2+的促進下與磷脂質(zhì)體聚合,而當缺乏維生素K2時,凝血酶原就失去了對Ca2+的親和性。維生素k2在血液凝固中的作用在體內(nèi),維生素K240維生素快k2在骨骼代謝中的作用

研究人員己經(jīng)在人體骨骼中發(fā)現(xiàn)兩種維生素依賴性蛋白-------骨鈣素，也被稱之為Y_羧基谷氨酸(骨Gla蛋白或者BGP)和基質(zhì)Gla蛋白(MGP)，y-羧化作用的發(fā)生即是由維生素K依賴性的Y_羧化酶催化的。體內(nèi)和體外實驗表明維生素K可能直接參與骨骼的代謝。體外實驗己經(jīng)證明，維生素K2可以通過抑制前列腺素E2和白細胞介素-6等骨再生物質(zhì)的產(chǎn)生從而抑制骨骼的再吸收，維生素K2還能夠提高成骨細胞誘導的礦化作用水平，并且在類固醇處理的和切除卵巢的大鼠試驗中能夠抑制骨的流失。維生素快k2在骨骼代謝中的作用研究人員己經(jīng)在人41維生素k2的其他生理作用

維生素K2可降低病毒性肝硬化女性患者發(fā)生肝癌的風險。TsangCK等研究發(fā)現(xiàn)維生素K2能夠促進以神經(jīng)生長因子為媒介的PC12D細胞的軸突生長。PC12D細胞在神經(jīng)生長因子的存在下經(jīng)過維生素K2處理，大大增加了神經(jīng)細胞的比例以及乙酞膽堿醋酶的活動。Natural公司宣稱，維生素K2己經(jīng)被證實對白種人的心血管健康有利，原因在于維生素K2能夠協(xié)助調(diào)控Ca2十的利用和促進martxiGla-protein的活性，此蛋白能夠抑制血管的鈣化。維生素k2的其他生理作用維生素K2可降低病毒性42

原核生物的細胞呼吸作用發(fā)生在細胞膜上，泛醌（COQ和萘醌(MK)是兩類在原核生物的膜結(jié)合蛋白復合體中傳遞電子的脂溶性化合物，與菌體的呼吸代謝緊密相關(guān)。電子供體在酶的作用下傳遞2個電子給MK,MK再在另一個酶的作用下將這2個電子傳遞給電子受體，在這一過程中，主要依賴MK與MKH:之間的不斷循環(huán)，從而為呼吸鏈源源不斷地傳遞電子，因此這一過程也被成為維生素K循環(huán)，它在需氧和厭氧呼吸系統(tǒng)中的電子傳遞鏈上均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其電子傳遞示意圖如圖所示。維生素k循環(huán)與菌體呼吸原核生物的細胞呼吸作用發(fā)生在細胞膜上，泛醌（43維生素K循環(huán)維生素K循環(huán)44合成維生素K2的微生物有黃桿菌屬(Flavobacteriumsp.)、分枝桿菌屬(Mycobacteriumsp.)、諾卡氏菌屬(Nocardiumsp.)、乳酸菌(Lacto—

bacillus)、鏈霉菌(Streptomyces)、納豆芽抱桿菌(Bacillussubtilisnatto)生產(chǎn)菌種合成維生素K2的微生物有黃桿菌屬(Flavobacteriu45維生素k2的代謝途徑

維生素K2由萘醌環(huán)和異戊二烯側(cè)鏈組成，合成途徑主要包括糖酵解(EMP)途徑、磷酸戊糖(HMP)途徑、甲羥戊酸(MVA)途徑、甲萘醌合成(MK)途徑4個部分，微生物以甘油為底物時，首先在甘油激酶(CK)作用下形成3-磷酸甘油，隨后在磷酸甘油脫氫(NAD(P)十)作用下氧化形成磷酸二羥丙酮，由此進入糖酵解途徑（EMP途徑)生成丙酮酸，丙酮酸脫羧形成乙酞-CoA，進人三羧酸循環(huán)途徑(TCA途徑)。同時，乙酞-CoA進人甲羥戊酸途徑(MVA途徑)形成聚異戊二烯焦磷酸(OPP);3-磷酸甘油進入磷酸戊糖途徑(PPP途徑)，維生素k2的代謝途徑維生素K2由萘醌環(huán)和異戊二46在轉(zhuǎn)酮酶作用下形成4一磷酸赤鮮糖，通過合成、脫水、脫氫形成莽草酸，最后反應(yīng)生成分支酸;由此進入MK途徑，menF,D,C,E,B基因簇編碼的6種關(guān)鍵酶和水解酶作用下形成醌骨架1,4一二羚基一2-萘甲酸(DHNA),最后與MVA途徑形成的聚異戊二烯焦磷酸在，men.A,UbiE/menG編碼的轉(zhuǎn)移酶脫作用下脫羧、甲基化形成甲萘醌(MK)。在轉(zhuǎn)酮酶作用下形成4一磷酸赤鮮糖，通過合成、脫水、脫氫形成莽47維生素k2的合成途徑維生素k2的合成途徑48維生素k2合成過程中各基因參與作用位置與vk2代謝相關(guān)的基因維生素k2合成過程中各基因參與作用位置與vk2代謝相關(guān)的基因49

從上圖中可以看出，共有八個酶分別控制從異分支酸開始的甲萘醌母環(huán)的合成以及從異戊烯焦磷酸開始的側(cè)鏈的合成，共有9個基因參與這一過程，它們分別是menA,menB,menC,menD,menE,menG,menH,hepT和hepS，其中hepT和hepS分別控制側(cè)鏈上同一個酶的兩個亞基的合成。根據(jù)測序結(jié)果，維生素K2合成途徑中的9個基因大小如下表。從上圖中可以看出，共有八個酶分別控制從異分支酸50維生素k2合成途徑中基因menA序列維生素k2合成途徑中基因menA序列51維生素k2合成途徑中基因menB序列維生素k2合成途徑中基因menB序列52維生素k2合成途徑中基因menC序列維生素k2合成途徑中基因menC序列53vk2研究現(xiàn)狀課件54LOREMIPSUMDOLOR維生素k2合成途徑中基因menD序列LOREMIPSUMDOLOR維生素k2合成途徑中基因m55LOREMIPSUMDOLORLOREMIPSUMDOLOR56LOREMIPSUMDOLOR維生素k2合成途徑中基因menE序列LOREMIPSUMDOLOR維生素k2合成途徑中基因m57LOREMIPSUMDOLORLOREMIPSUMDOLOR58維生素k2合成途徑中基因menG序列維生素k2合成途徑中基因menG序列59維生素k2合成途徑中基因menH序列維生素k2合成途徑中基因menH序列60維生素k2合成途徑中基因hepT序列維生素k2合成途徑中基因hepT序列61vk2研究現(xiàn)狀課件62維生素k2合成途徑中基因hepS序列維生素k2合成途徑中基因hepS序列63基于各個基因的上下游序列設(shè)計的引物基于各個基因的上下游序列設(shè)計的引物64國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀65MK-7FermentationProceduresFermentationwasconductedina3-Lfermentor(BioFlo/CelliGen115,NewBrunswickScientificCo.,USA).Thefermentorwasequippedwithatop-drivenstirrerwithtwosix-bladeRushtonimpellers(i.e.diameter45mm,width14mm,length14mm)andfourbaffles(i.e.widt