免疫原與抗血清制備技術

免疫原和抗血清制備技術第一節(jié)免疫原的制備第二節(jié)免疫血清的制備第三節(jié)抗體的純化和鑒定第一節(jié)免疫原的制備一、細胞性抗原的制備二、可溶性抗原制備及鑒定三、半抗原免疫原的制備四、佐劑

綿羊紅細胞的制備流程圖搖動15-20min

4℃可保存3周取適量NS洗滌3次2000r/min10minNS稀釋至2～5%

細菌細胞抗原的制備流程圖液體培養(yǎng)或斜面培養(yǎng)37℃24h100℃水浴2～2.5h殺菌無菌試驗NS稀釋成8～10億/mlO菌體抗原返回來源:組織和細胞，其成分比較復雜。1.組織和細胞成分混合抗原制備2.蛋白質(zhì)抗原制備3.核酸抗原制備4.類脂多糖抗原制備5.免疫球蛋白片段制備6.純化抗原的鑒定

二、可溶性抗原制備及鑒定可溶性抗原:蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶類、補體、脂多糖、細菌外毒素和核酸二、可溶性抗原制備及鑒定返回

組織和細胞成分混合抗原制備程序上清液澄清所用材料必須是新鮮或低溫保存的去除包膜或結締組織臟器進行灌洗洗去血跡及污物NS內(nèi)含0.5g／LNaN2冷浴中組織剪碎裝入搗碎機簡內(nèi)高速粉碎制成組織勻漿液3000r／min×10min取上清液去除細胞碎片及微小組織離心

細胞破碎技術及評價1.酶處理法2.凍融法3.超聲破碎法4.表面活性劑處理細胞破碎技術及評價

常用酶類：溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶等

1.酶處理法1.酶處理法方法：在一定的條件下，能消化細菌和組織細胞。

特點：①此法適用多種微生物；②具有作用條件溫和；③內(nèi)含物成分不易受到破壞；④細胞壁損壞的程度可以控制。

2.凍融法原理：因突然冷凍，細胞內(nèi)冰晶的形成及胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細胞。2.凍融法完方法：將待破碎的細胞置冰箱內(nèi)凍結，然后緩慢融化，如此反復兩次，大部分組織細胞及細胞內(nèi)的顆?？杀蝗谄?。特點：此法適用于組織細胞，對微生物細胞作用較差。

3.超聲破碎法原理：利用超聲波的機械振動而使細胞破碎。由于超聲波發(fā)生空化作用（cavitation）使得液體形成局部減壓引起液體內(nèi)部發(fā)生流動，漩渦生成與消失時，產(chǎn)生很大的壓力，使細胞破碎。超聲波使用的頻率從1kHz～20kHz不等，間歇進行，避免長期超聲產(chǎn)熱，導致抗原破壞。3.超聲破碎法特點：①操作簡單，重復性較好，節(jié)省時間；②多用于微生物和組織細胞的破碎。4.表表面活活性劑劑處理理原理：：在適當當?shù)臏販囟?、、pH及低低離子子強度度的條條件下，，表面面活性性劑能能與脂脂蛋白白形成成微泡泡，使膜的的滲透透性改改變或或使之之溶解解。4.表表面活活性劑劑處理理常用的的有：：十二烷烷基硫硫酸鈉鈉(SDS,陰陰離子子型)、二乙胺胺十六六烷基基溴（（陽離離子型型）、、聚山山梨酯酯（非離離子型型）、、新潔潔爾滅滅等。。應用：：①破碎碎細菌菌，且且作用用比較較溫和和；②提取取核酸酸時，，常用用此法法破碎碎細胞胞。蛋白質(zhì)質(zhì)抗原原制備備蛋白質(zhì)質(zhì)是良良好的的抗原原，要要制備備特異異性高高的抗血血清通通常需需要純純化。?？刹刹捎茫海?.超超速離離心法法2.選選擇性性沉淀淀法3.凝凝膠層層析法法4.離離子交交換層層析法法5.親親合層層析法法蛋白質(zhì)質(zhì)抗原原制備備1．超超速離離心法法原理:利用各各顆粒粒在梯梯度液液中沉沉降速速度不不同，，使具有有不同同沉降降速度度的顆顆粒,處于于不同同密度度的梯度度層內(nèi)內(nèi)，達達到彼彼此分分離的的目的的。1．超超速離離心法法特點：：用超速速離心心或梯梯度密密度離離心法法純化化抗原，極極難將將某一一抗原原成分分分離離出來來。應用：：用于少少部分分大分分子抗抗原和和一些些比較較輕的抗原原物質(zhì)質(zhì)的分分離，，如IgM、C1q、甲甲狀腺腺球蛋白、、載脂脂蛋白白A、、B等等。2、選選擇性性沉淀淀法原理：：根據(jù)各各蛋白白質(zhì)理理化特特性的的差異異，采采用各種沉沉淀劑劑或改改變某某些條條件促促使蛋蛋白質(zhì)質(zhì)抗原原成分沉沉淀，，從而而達到到純化化的目目的。。2、選選擇性性沉淀淀法常用方方法：：鹽析沉沉淀法法（不不同鹽鹽濃度度則溶溶解度不同同）；；常用用33～50％％飽和和度的的硫酸酸胺。。特點：：簡單方方便，，純度度不高高，粗粗提球球蛋白白。應用：：在大量量制備備中先先用此此法粗粗提，，再純純化。。3．凝凝膠層層析法法（凝凝膠過過濾法法）原理：：凝膠具具有三三維空空間多多孔網(wǎng)網(wǎng)狀結結構的的物質(zhì)質(zhì)，經(jīng)適當當溶液液平衡衡后，，裝入入層析析柱。。當含含有各各種分子大大小不不一的的混合合物加加在凝凝膠床床面時時，大大分子物質(zhì)質(zhì)不能能進入入凝膠膠顆粒粒的網(wǎng)網(wǎng)孔結結構內(nèi)內(nèi)，在在凝膠顆粒粒之間間的空空隙中中很快快地通通過凝凝膠床床，短短時間內(nèi)被被洗脫脫出來來；而而分子子較小小的物物質(zhì)則則進入入凝膠網(wǎng)孔孔結構構內(nèi)，，反復復受到到阻滯滯，洗洗脫較較慢。。分成大、、中、、小三三種類類型。。3．凝凝膠層層析法法（凝凝膠過過濾法法）4．離離子交交換層層析法法原理：：利用帶帶離子子基團團的纖纖維素素或凝凝膠，，吸附附交換換帶相相反電電荷的的蛋白白質(zhì)抗抗原。。各種種蛋白白質(zhì)的的等電電點不不同，，所帶帶電荷荷不同同，與與纖維維素結結合的的能力力有差差別。。當梯梯度洗洗脫時時，逐逐步增增加流流動相相的離離子強強度，，使加加入的的離子子與蛋蛋白質(zhì)質(zhì)競爭爭纖維維素上上的電電荷位位置置，從從而使使血清清中的的蛋白白質(zhì)分分成γγ球蛋蛋白、、α球球蛋白白、ββ球蛋蛋白和和清蛋蛋白等等幾個個部分分而被被洗脫脫下來來，達達到分分離純純化的的目的的。4．離離子交交換層層析法法5．親親和層層析法法（親親和色色譜））原理：：依據(jù)抗抗原抗抗體的的生物物學活活性進進行分分離和和提純純的技技術。。將純純化的的抗IgG附著于于惰性性的固固相基基質(zhì)上上，制制成免免疫吸吸附層層析柱柱。當當樣品品流過過此柱柱時，，待分分離的的IgG可選擇擇性地地與免免疫吸吸附劑劑上的的特異異性配配體(抗IgG)結合；；當改改變洗洗脫條條件可可重新新解離離，將將待分分離的的Ig洗脫下下來，，達到到純化化的目目的。。優(yōu)點：：提取純純度高高、抗抗原抗抗體不不失活活性。。5．親親和層層析法法（親親和色色譜））正常細細胞＋標記細細胞洗滴標記細細胞被酶裂裂解加入特特異性抗體體其它蛋蛋白洗滌流流失SDS分離蛋蛋白親和層層析法法示意意圖核酸抗抗原制制備大分子子的核核酸具具有免免疫原原性。。提取核核酸的的主要要步驟驟：核酸酸抗抗原原制制備備破碎碎細細胞胞核酸酸從從細細胞胞中中游游離離出出來來酸沉沉淀淀核核除去去蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)乙醇醇酚和和氯氯仿仿類脂脂多多糖糖抗抗原原制制備備苯酚酚法法提提取取LPS：：干燥燥菌菌體體或或濕濕菌菌體體水中中混勻勻激烈烈攪攪勻勻加熱熱5min冰水水急冷冷降至至10℃℃以以下下離心心上層層的的水水層層(含含LPS)下層層的的酚酚層層菌體體殘殘渣渣于于底底部部吸取取水層層透析析除酚酚加熱熱超速速離離心心濃縮縮LPS在在上上層層沉沉淀淀的的透透明明膠膠狀狀部部內(nèi)內(nèi)絞出出懸于于水水中中離心心得純純化化LPS類脂脂多多糖糖抗抗原原制制備備同溫溫的的苯苯酚酚免疫疫球球蛋蛋白白片片段段制制備備1．．酶酶裂裂解解法法酶對對免免疫疫球球蛋蛋白白的的水水解解有有極極好好的專專一一性性，，不不同同的的酶酶可可將將免免疫疫球球蛋蛋白白裂裂解解為不不同同的的片片段段。。免疫疫球球蛋蛋白白片片段段制制備備2．．氧氧化化法法和和還還原原法法是將將免免疫疫球球蛋蛋白白輕輕、、重重鏈分分開開的的兩兩種種常常用用方方法法。。3.還可可用用強變變性性劑劑或利利用用改變變pH將免免疫疫球球蛋蛋白亞亞單單位位分分開開。。酶水水解解免免疫疫球球蛋蛋白白示示意意圖圖Fc段段，，用用以以制制備備抗抗重重鏈鏈血血清清F(ab’’)2，常常作作為為抗抗體體試試劑劑用用于于試試驗驗木瓜瓜蛋蛋白白酶酶（papain)胰蛋蛋白白酶酶(pepsin)胃蛋蛋白白酶酶(pepsin)1.氧氧化化法法：：優(yōu)點點是是切切開開后后，，肽肽鏈鏈不不能能重重新新形成成二二硫硫鍵鍵、、便便于于肽肽鏈鏈純純化化；；缺點點是是色色氨氨酸酸側(cè)側(cè)鏈鏈容容易易被被破破壞壞。。氧化化法法和和還原原法法評評價價返回回2.還還原原法法：：將二二硫硫鍵鍵還還原原成成琉琉基基。。但但極極不不穩(wěn)定定，，易易重重新新形形成成二二硫硫鍵鍵，，必必須須及及時時用用碘乙乙酸酸或或碘碘化化酰酰胺胺進進行行羧羧甲甲基基化化。。純化化抗抗原原的的鑒鑒定定1.含含量量鑒鑒定定2.理理化化性性質(zhì)質(zhì)鑒鑒定定①凝凝膠膠層層析析技技術術測測定定②聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝膠膠電電泳泳③凝凝膠膠管管狀狀電電泳泳④超超速速離離心心3.純純度度鑒鑒定定常用用醋醋酸酸纖纖維維膜膜電電泳泳4.免免疫疫活活性性鑒鑒定定常用用雙雙向向瓊瓊脂脂擴擴散散試試驗驗純化化抗抗原原的的鑒鑒定定藍色色1．．含含量量鑒鑒定定在一一定定范范圍圍內(nèi)內(nèi)，，顏顏色色深深淺淺與與蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)濃濃度度呈呈直直線線相相關關。。方法法：：酚酚試試劑劑法法鑒鑒定定主要要試試劑劑：：磷磷鉬鉬酸酸-鎢鎢酸酸的的混混合合酸酸原理理：：蛋白白質(zhì)質(zhì)中中的的酪酪氨氨酸酸、、半半胱胱氨氨酸酸、、色色氨氨酸酸等等能能鎢酸酸、、鉬鉬酸酸還原原3H2OP205·13WO3·5MoO3·10H20和3H2P205·14WO3·4MoO3·10H20絡合合物物的的雙雙縮縮脲脲法法蛋白白質(zhì)質(zhì)＋＋Ca2+堿性性加深深含量量鑒鑒定定藍色色理化化性性質(zhì)質(zhì)鑒鑒定定已知知分分子子量量的的標標準準品品測未未知知分分子子量量：：將樣樣品品在在同同一一凝凝膠膠柱柱上上，，同同一一條條件下下層層析析、、洗洗脫脫、、測測保保留留體體積積，，并并查查出出分分子子量量。。此法法簡簡便便、、樣樣品品用用量量少少，，有有一一定定的的實實用用價價值值。。凝膠膠柱柱保留留體體積積分子子量量的的對對數(shù)數(shù)2.理理化化性性質(zhì)質(zhì)鑒鑒定定繪制制標標準準曲曲線線①凝凝膠膠層層析析技技術術進進行行測測定定垂直直電電泳泳聚合合成成大大分分子子凝凝膠膠②聚丙烯酰酰胺凝膠膠電泳（（PAGE）有分子篩篩效應、、電荷效效應及濃濃縮效應應，能精精確地分離離和鑒定定高分子子物質(zhì)。。PAG的的分子篩篩效應測測定蛋白白質(zhì)抗原原的分子子量。原理：雙丙烯酰酰胺N,N-methylenebisacrylamide,Bis丙烯酰胺胺(acrylamide,Acr)催化劑3.純純度鑒定定方法：醋酸纖維維膜電泳泳進行鑒鑒定。返回純度鑒定定原理：蛋白質(zhì)在在一定pH下都都帶有電電荷，由由于各種蛋白白質(zhì)等電電點不同同、分子子量也異異，因此此所帶電量量也各不不相同，，在外加加直流電電場的作作用下，它它們泳動動的速度度不同，，經(jīng)一段段時間后后即可彼此此分開，，形成電電泳譜；；從而判判斷蛋白白質(zhì)抗原的的純度。。特點：快速簡便便。三、半抗抗原免疫疫原的制制備1.半抗抗原：低分子量量的化學學物質(zhì)。。例如多多糖、多肽、甾甾族激素素、脂肪肪胺、類類脂質(zhì)、、核苷、、某些藥物物(包括括抗生素素）及其其他化學學物品等等。三、半抗抗原免疫疫原制備備2.載體體：蛋白質(zhì)類類多肽聚合合物大分子聚聚合物3.半抗抗原-載載體連接接方法:載體類型型1.蛋白白質(zhì)：人血清白白蛋白、、牛血清白白蛋白、兔血清白蛋蛋白、牛牛甲狀腺腺球蛋白白等。載體類型型2.多肽肽聚合物物：人工合成成的，常常見的有有多聚賴賴氨酸，其其分子量量大（可可達十幾幾萬到幾幾十萬)，這種多聚聚物和半半抗原結結合后，，可刺激激免疫動動物產(chǎn)生高高效價、、高親和和力的抗抗體。3.大聚聚合物：：羧甲基纖纖維素、、聚乙烯烯吡咯烷烷酮等，可與與半抗原原結合，，加入弗弗氏完全全佐劑亦亦可誘發(fā)動動物產(chǎn)生生抗體。。半抗原-載體連連接方法法1碳化二亞亞胺法：：R-NH=CH-R’’半抗原＋＋載體蛋蛋白質(zhì)攪拌1～～2h室溫24h透吸除去去未反應應的半抗抗原人工免疫疫原半抗原載載體連接接方法1混合混合半抗原-載體連連接方法法2戊二醛法法:半抗原-NH2載體蛋白白-NH2半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-載載體蛋白白OHC-(CH2)3-CHO*戊二醛醛是常用用的帶有有兩個活活性基團團的雙功能聯(lián)接接劑半抗原載載體連接接方法2半抗原-載體連連接方法法3氯甲酸異異丁脂法法：半抗原-COOH載體蛋白白-NH2Cl-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-CO-NH-載體蛋白白半抗原載載體連接接方法3簡便，用用于類固固醇抗原原制備HO-CH2CH(CH3)2＋半抗原-載體連連接方法法4琥珀酸酐酐法：用于不含含羧基衍衍生物半半抗原制制備半抗原原-CH2OHCH2-COCH2-CO帶羧基基的半半抗原原琥珀珀酸衍衍生物物半抗原原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH返回吡啶再經(jīng)氯氯甲酸酸異丁丁脂法法或碳碳化二亞胺胺法制制備載載體半半抗原原半抗原原載體體連接接方法法4四、佐佐劑*概概念：：與抗原原同時時或預預先注注射于于機體體，能能增加機體體免疫疫應答答或改改變免免疫應應答類類型的的物質(zhì)質(zhì)。四、佐佐劑條件：：①增加加抗原原的表表面積積；②改變變抗原原的活活性基基團構構型；；③佐劑劑與抗抗原混混合能能延長長抗原原在局局部組織的的存留留時間間；④可直直接或或間接接激活活免疫疫活性性細胞胞；⑤無毒毒性或或無副副作用用。（二））常用用佐劑劑的種種類和和制備備1.氫氫氧化化鋁佐佐劑：：5%硫硫酸鋁鋁5%氫氫氧化化鈉氫氧化化鋁沉沉淀制成懸懸液即為佐佐劑強烈攪攪拌NS洗洗二次NS等體積積抗原原免疫接接種（二））常用用佐劑劑的種種類和和制備備2.明明礬佐佐劑10%硫酸酸鉀鋁鋁氫氧化化鈉校校正pH值值至6.5沉淀乳狀懸懸液*明礬佐佐劑抗抗原常常用用用于肌肌肉注注射，，皮下下注射射易引起起肉芽芽種和和膿腫腫。NS攪攪拌NS洗洗二次離心抗原備用防腐劑劑作用大大于不不完全全佐劑劑局部形形成肉肉芽種種和潰潰瘍不能用用于人人體弗氏完完全佐佐劑3.弗弗氏佐佐劑(Freundadjuvant)液體石石蠟完全乳乳化備用＋高壓滅菌加熱抗原弗氏不不完全全佐劑劑卡介苗苗羊毛脂脂鑒定一滴乳劑乳劑不不散浮浮于液液面水中混合4.佐佐劑應應用原原則和和評價價目的:①增強強抗原原對機機體的的免疫疫原性性；②增強強抗體體的產(chǎn)產(chǎn)生能能力；；③為制制備出出高效效價的的免疫疫血清清；④增強強可溶溶性抗抗原的的免疫疫原性性；⑤在某某種情情況下下，改改變Ag免免疫應應答類類型；；⑥延長長抗原原在免免疫動動物的的時間間；⑦改變變抗原原的分分布；；⑧增強強局部部對變變應原原的超超敏反反情況況；4.佐佐劑應應用原原則和和評價價應用佐佐劑的的缺點點①佐劑常?；煊杏形⒘苛科渌镔|(zhì)質(zhì)，這這些物物質(zhì)進進入體內(nèi)內(nèi)后也也可引引起抗抗體的的產(chǎn)主主，影影響抗抗血清的的特異異性；；應用佐佐劑的的缺點點②注射佐佐劑可可引起起局部部形成成肉芽芽腫和和無菌菌性膿腫腫；③反復注注射，，易發(fā)發(fā)生超超敏反反應，，使局局部組組織壞死死，甚甚至引引起動動物死死亡。。第二節(jié)節(jié)免免疫疫血清清的制制備1.免免疫動動物選選擇2.免免疫方方法3.動動物采采血法法4.免免疫血血清的的分離離及保保存一、免免疫動動物選選擇能作免免疫接接種用用的動動物主主要是是哺乳乳類和和禽類類。兔、綿綿羊、、豚鼠鼠、雞雞、山山羊和和馬。。一、免免疫動動物選選擇1.抗抗原與與免疫疫動物物種屬屬差異異越遠遠越好好；2.動動物必必須適適齡、、健壯壯、無無感染染的正正常動動物、、體重合合乎要要求；；3.不不同動動物種種類對對同一一免疫疫原有有不同同的免免疫應答；；4.按按需要要量選選擇大大小不不同的的動物物。二、免免疫方方法3.免免疫方方案①全量量免疫疫法：：弗氏氏佐劑劑抗原原多次次注射射②微量量免疫疫法：：卡介介苗7天弗氏佐佐劑1月抗原③混合合免疫疫法：：綜合合皮下下、淋淋巴結結和靜靜脈二、免免疫方方法1.免免疫原原的注注射劑劑量2.免免疫途途徑：：免疫疫反應應產(chǎn)生生速度度依次次為靜靜脈＞＞腹腔＞＞肌肉肉＞皮皮下＞＞皮內(nèi)內(nèi)＞淋淋巴結結＞足足掌三、動動物采采血法法1.頸頸動脈脈放血血法：：最常常用的的方法法2.心心臟采采血法法：要要求操操作熟熟練3.靜靜脈采采血法法：1.4℃保保存：：可保保存3～6個月月2.低低溫保保存：：-20～～-40℃℃，可可保存存2～～3年年3.冰冰凍干干燥保保存：：可保保存3～5年三、動動物采采血法法四、免免疫血血清的的分離離和保保存第三節(jié)節(jié)抗抗體體的純純化和和鑒定定1.抗抗體特特異性性的純純化2.特特異性性IgG類類抗體體的純純化3.特特異性性抗體體的鑒鑒定一、抗抗體特特異性性的純純化1.親親合層層析法法：將交叉叉抗原原交聯(lián)聯(lián)到Sepharose4B上上，裝裝柱后后，將將預吸吸收的的抗體體通過過親合合層析柱，，雜抗抗體吸吸附在在柱上上，流流出液液則是是特異異性抗體體。一、抗抗體特特異性性的純純化2.吸吸附法法：利用不不含特特異性性抗原原的抗抗原液液，直直接加到到免疫疫血清清中，，抗原原則與與抗體體結合合，上上清液則則為無無雜抗抗體的的單價價特異異性抗抗體。。二、特特異性性IgG類類抗體體的純純化1.鹽鹽吸沉沉淀法法：經(jīng)硫酸酸銨鹽鹽吸提提取γγ球蛋蛋白3次，，基本本為IgG類抗抗體，，但不不純。。二、特特異性性IgG類類抗體體的純純化2.A蛋白白親和和層析析：SPA與IgG的Fc段段有很很強的的特異性性的親親和力力，細細菌表表面不不同位位點獨獨立地地與抗體體結合合，一一個A蛋白白至少少可以以結合合二個個IgG分子子。適適合純純化細細胞培培養(yǎng)上上清中中的McAb。。3.其其它：：凝膠過過濾、、離子子交換換層析析等三、特特異性性抗體體的鑒鑒定1.抗抗體效效價的的鑒定定：即為抗抗體活活性滴滴定三、特特異性性抗體體的鑒鑒定2.抗抗體特特異性性鑒定定：①細菌菌類抗抗原的的抗體體用凝凝集試試驗②可溶溶性抗抗原的的抗體體用雙雙向瓊瓊脂擴擴散試試驗3.抗抗體的的純度度鑒定定：免疫電電泳分分析法法4.抗抗體親親和力力鑒定定：親和力力高則則靈敏敏度好好第四節(jié)節(jié)單單克克隆抗抗體技技術單克隆隆抗體體：由B細細胞雜雜交瘤瘤產(chǎn)生生的只只識別別抗原原分子上上一種種抗原原決定定簇的的抗體體分子子。多克隆隆抗體體：識別抗抗原分分子上上各種種抗原原決定定簇的多種種抗體體的混混合制制劑。。一、雜雜交瘤瘤技術術的原原理及及流程程二、單單克隆隆抗體體的應應用返回一、雜交瘤瘤技術術的原原理及及流程程二、單單克隆隆抗體體的應應用1.醫(yī)醫(yī)學檢檢驗試試劑：：①傳染染病的的快速速診斷斷②尋找找TSA及及檢測測TAA③免疫疫細胞胞抗原原檢測測④激素素測定定⑤血中中藥物物濃度度監(jiān)測測⑥HLA分分型監(jiān)監(jiān)測二、單單克隆隆抗體體的應應用2.導導向治治療作作用3.抗抗原物物質(zhì)的的分離離和提提純9、靜夜四無無鄰，荒居居舊業(yè)貧。。。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、雨雨中中黃黃葉葉樹樹，，燈燈下下白白頭頭人人。。。。03:52:3503:52:3503:5212/29/20223:52:35AM11、以我獨沈沈久，愧君君相見頻。。。12月-2203:52:3503:52Dec-2229-Dec-2212、故人人江海海別，，幾度度隔山山川。。。03:52:3503:52:3503:52Thursday,December29,202213、乍見翻翻疑夢，，相悲各各問年。。。12月-2212月-2203:52:3503:52:35December29,202214、他鄉(xiāng)生白白發(fā)，舊國國見青山。。。29十二二月20223:52:35上上午03:52:3512月-2215、比不不了得得就不不比，，得不不到的的就不不要。。。。十二月月223:52上上午午12月月-2203:52December29,202216、行行動動出出成成果果，，工工作作出出財財富富。。。。2022/12/293:52:3503:52:3529December202217、做前前，能能夠環(huán)環(huán)視四四周；；做時時，你你只能能或者者最好好沿著著以腳腳為起起點的的射線線向前前。。。3:52:35上上午3:52上上午午03:52:3512月月-229、沒有有失敗敗，只只有暫暫時停停止成成功！！。12月月-2212月月-22Thursday,December29,202210、很多事事情努力力了未必必有結果果，但是是不努力力卻什么么改變也也沒有。。。03:52:3503:52:3503:5212/29/20223:52:35AM11、成功就是是日復一日日那一點點點小小努力力的積累。。。12月-2203:52:3503:52Dec-2229-Dec-2212、世世間間成成事事，，不不求求其其絕絕對對圓圓滿滿，，留