子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染課件

病理新技術(shù)在子宮頸CIN的應(yīng)用河南省人民醫(yī)院病理科孔令非病理新技術(shù)在子宮頸CIN的應(yīng)用河南省人民醫(yī)院病理科1病理學(xué)新技術(shù)FISH原位雜交免疫組織化學(xué)生物傳感器病理學(xué)新技術(shù)FISH2熒光原位雜交Fluorescenceinsituhybridization原理利用DNA堿基對的互補(bǔ)性，將直接標(biāo)記了熒光的單鏈DNA(探針)和與其互補(bǔ)的目標(biāo)樣本的DNA(玻片上的標(biāo)本)雜交,通過觀察熒光信號(hào)在染色體上的位置反映相應(yīng)染色體的情況FISH熒光原位雜交FISH3FISH操作樣本預(yù)處理

脫蠟，脫水及水化，消化，探針、樣本變性78℃探針＋樣本雜交45-50℃雜交后洗滌結(jié)果觀察FISH操作樣本預(yù)處理4FISH探針種類CSP著絲粒探針GLP特異性位點(diǎn)探針染色體整臂探針FISH探針種類CSP著絲粒探針GLP特異性位點(diǎn)探針染色5FISH探針的類型

全染色體涂抹探針（WCP）染色體計(jì)數(shù)（著絲粒）探針（CSP）位點(diǎn)特異性探針（GLP）單色特異性探針雙色分離重排探針雙色雙融合易位探針

FISH探針的類型全染色體涂抹探針（WCP）6IgHBcl2IGH/BCL2探針14（灰）號(hào)和18號(hào)（黑）染色體IgH基因Bcl-2基因雜交正常

異常融合基因擴(kuò)增雙色雙融合易位探針(IGH/BCL2）IgHBcl2IGH/BCL2探針14（灰）號(hào)和18號(hào)（黑）7

FISH的特點(diǎn)操作簡單檢測快速結(jié)果易觀察靈敏性和特異性高可檢測樣本種類多空間定位精確FISH的特點(diǎn)操作簡單檢測快速結(jié)果易觀察8FISH檢測在臨床中的應(yīng)用產(chǎn)前診斷血液病檢測實(shí)體瘤檢測FISH檢測在臨床中的應(yīng)用產(chǎn)前診斷9端粒，端粒酶及作用端粒是真核細(xì)胞染色體末端的特殊NDA-蛋白結(jié)構(gòu)，其DNA含大量TTAGGG重復(fù)序列，在進(jìn)化中高度保守DNA酶不能復(fù)制線性DNA（端粒是線性DNA）大多數(shù)體細(xì)胞的端粒會(huì)隨周期性復(fù)制而縮短，最終達(dá)到一個(gè)使染色體完整性喪失的臨界點(diǎn)，細(xì)胞增殖停止；許多腫瘤細(xì)胞端粒酶活性增高，是腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵步驟作用：保護(hù)染色體基因組免受降解或重組為染色體末端提供一種可消耗的非編碼序列，以緩解或取消末端復(fù)制所帶來的染色體DNA進(jìn)行性縮短生殖細(xì)胞具有端粒酶活性，其端粒不隨年齡增加而縮短，故成為永生細(xì)胞端粒，端粒酶及作用端粒是真核細(xì)胞染色體末端的特殊NDA-蛋白10端粒酶由RNA，DNA及蛋白質(zhì)組成，本質(zhì)是一種逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶活性決定于端粒酶RNA（humantelomeraseRNA,hTERC)和端粒酶催化亞單位(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)hTERC是端粒長度穩(wěn)定的直接因素保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細(xì)胞長期有活性和潛在的繼續(xù)增殖能力人端粒酶基因位于3q26.3，該基因的擴(kuò)增可阻止細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生端粒酶由RNA，DNA及蛋白質(zhì)組成，本質(zhì)是一種逆轉(zhuǎn)錄酶11宮頸脫落細(xì)胞及組織學(xué)FISH探針CSP3TERChTERC基因定位于3q26.3

3號(hào)染色體著絲粒信號(hào)宮頸脫落細(xì)胞及組織學(xué)FISH探針CSP3TERChTERC基12AllthethreecentersobtainedsimilarlyincreasingtrendofhTERCpositiveratesaccordingtotheseverityofcervicallesions,forbothcytologicalresultsandpathologicaldiagnosis.Allthethreecentersobtained13中國8350例子宮頸病變TERC擴(kuò)增TBS分級(jí)正常/炎癥ASCUSASC-HLSILHSILTERC基因擴(kuò)增發(fā)生率（%）4.613.528.625.287.7病理分級(jí)正常/炎癥CIN1CIN2CIN3浸潤癌TERC基因擴(kuò)增發(fā)生率（%）4.2-10.626.865.483.193.5中國8350例子宮頸病變TERC擴(kuò)增TBS分級(jí)正常/炎癥AS14hTERC檢測臨床意義伴有hTERC基因擴(kuò)增的癌前病變的病人有52%－96%的惡變可能?？深A(yù)測CIN1/CIN2向CIN3發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素，其靈敏度是100%，特異性是70%.

FISH是早期診斷和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的有效手段(AJPApril2005,Vol.166,No.4)hTERC檢測臨床意義伴有hTERC基因擴(kuò)增的癌前病變的病人15hTERC基因檢測在宮頸癌和宮頸癌前病變診斷中有重要價(jià)值魏麗惠，李亞里，吳瑞芳，陳忠，屠錚，江靜，李靜然北京大學(xué)人民醫(yī)院婦科，北京，中國中國解放軍總醫(yī)院婦科，北京，中國北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科，深圳，中國猶他大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)科，鹽湖城，美國該研究顯示，采用FISH技術(shù)檢測hTERC基因擴(kuò)增可在宮頸細(xì)胞學(xué)玻片上進(jìn)行，具有無創(chuàng)性和客觀性的特點(diǎn)，敏感度和特異度高，在宮頸癌和宮頸癌前病變的診斷中有重要價(jià)值。hTERC基因的異常擴(kuò)增可能成為宮頸病變惡性進(jìn)展的早期標(biāo)記物。北京協(xié)和醫(yī)院郎景和教授點(diǎn)評(píng)：在液基細(xì)胞學(xué)檢查和檢測人乳頭狀瘤病毒篩查宮頸癌的同時(shí)，檢測hTERC基因，有望成為協(xié)助宮頸癌和宮頸癌前病變診斷及預(yù)測癌前病變是否向子宮頸癌發(fā)展的重要指標(biāo)，而造福廣大婦女。hTERC基因檢測在宮頸癌和宮頸癌前病變診斷中有重要價(jià)值北京16細(xì)胞非典型性發(fā)育異常細(xì)胞癌變阻止細(xì)胞正常凋亡高危型HPV持續(xù)性感染人類染色體端粒酶基因(hTERC)擴(kuò)增致癌基因E6/E7編碼的原癌蛋白表達(dá)TERC基因的擴(kuò)增可阻止細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生

P16表達(dá)E7結(jié)合RBE6結(jié)合p53細(xì)胞非典型性發(fā)育異常細(xì)胞癌變阻止細(xì)胞正常凋亡高危型HPV持續(xù)17隨著宮頸病變級(jí)別增加，hTERC的陽性率增加hTERC陽性率正?；蜓装Y組4.2-10.6%CIN1組26.8%

CIN2組69.23%CIN3組83.58%宮頸癌組95.65%正常及CIN1的hTERC基因陽性率明顯低于CIN2及以上者，P<0.01

hTERC診斷CIN2或CIN2以上病變敏感度81.40%特異度95.04%陽性預(yù)測值70.00%陰性預(yù)測值97.29%

隨著宮頸病變級(jí)別增加，hTERC的陽性率增加18子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染課件19HumanPapillomaVirus(HPV)環(huán)狀雙鏈DNA病毒超過120種亞型其中的72種亞型可引起肛門及生殖器疾病Lowrisk(LR-HPV):6,11,40,42,44,54,61,70,72,81Highrisk(HR-HPV):16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,78,82HumanPapillomaVirus(HPV)環(huán)狀雙鏈20

HPV的生物學(xué)狀態(tài):游離或整合在HPV感染的早期或瞬間感染，HPV基因組以游離的環(huán)狀DNA形式存在于宿主細(xì)胞核中。(CondylomaandCIN-1)持續(xù)的HPV感染，使其DNA整合進(jìn)宿主DNA，標(biāo)志著惡性轉(zhuǎn)化。(CIN2＋lesions)HPV的生物學(xué)狀態(tài):游離或整合在HPV感染的早期或瞬間感21持續(xù)性的HPV感染幾乎總是發(fā)生在兩種上皮的交界處（宮頸移行帶、肛門和口咽）HPV通過宮頸鱗腺交界處感染基底細(xì)胞或HPV通過微創(chuàng)傷直接感染基底細(xì)胞臨床治療需要破壞移行帶，而不僅僅是病變本身持續(xù)性的HPV感染幾乎總是發(fā)生在兩種上皮的交界處（宮頸移行帶22HPV檢測及預(yù)后預(yù)測價(jià)值陰性預(yù)測價(jià)值(NPV)約~99%womennotinfectedwithHR-HPVhave<1%chancetohaveHSILlesion陽性預(yù)測價(jià)值(PPV)根據(jù)患者的年齡:<30:PPVisonly20%evenpersistentHPV>30:PPVgraduallyincreasedwithageandpersistentHPVinfectionHPV檢測及預(yù)后預(yù)測價(jià)值陰性預(yù)測價(jià)值(NPV)約~99%23原為雜交法用標(biāo)記的HPV探針在組織上或細(xì)胞上進(jìn)行原位的雜交，并進(jìn)行顯色特異性最強(qiáng)敏感性高直觀可結(jié)合組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)形態(tài)探針有：6/11,16/18,31/33原為雜交法用標(biāo)記的HPV探針在組織上或細(xì)胞上進(jìn)行原位的雜交，24導(dǎo)流雜交法擴(kuò)增所取樣本的DNA放在固定好基因探針的基因芯片上（21種亞型包括13種高危亞型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68及5種低危亞型6,11,42,43,44和3種中國人群常見的亞型53,66,CP8304型進(jìn)行雜交探針標(biāo)記Biotin及堿磷酶用NBT/BCIP進(jìn)行顯色結(jié)果呈藍(lán)紫色導(dǎo)流雜交法擴(kuò)增所取樣本的DNA25判定標(biāo)準(zhǔn)－RLU/Cutoff

的比值≥1=陽性,50以內(nèi)的數(shù)值對病情的嚴(yán)重程度并沒有指示性，但>50的數(shù)值對病情的嚴(yán)重程度的估計(jì)有指導(dǎo)意義。＜1=陰性，表示未檢出13種高危型HPVDNA序列或標(biāo)本中不含有高危型HPVDNA序列，又或者其濃度水平在測定方法的檢測限度以下，不能除外潛伏感染；如果接近但小于1.0且被懷疑有高危型HPV感染，應(yīng)該重新采集標(biāo)本。判定標(biāo)準(zhǔn)－RLU/Cutoff

的比值26HC-II的應(yīng)用條件HPVtest不適用的情況：細(xì)胞學(xué)顯示異型增生時(shí)年齡<30歲，除非細(xì)胞學(xué)顯示ASC-US男性外生殖器HPVtest應(yīng)用條件：ASC-US>30歲的女性,細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)合HPVtestHC-II的應(yīng)用條件HPVtest不適用的情況：27HPV檢測方法的比較原位雜交導(dǎo)流雜交基因捕獲HC-II原理在原位進(jìn)行HPVDNA的雜交提取DNA進(jìn)行PCR，進(jìn)行膜雜交DNA分解，DNA-RNA雜交，抗體捕獲，特點(diǎn)組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)涂片上原位顯示分型HPV具體分型顯示HPV,無病毒負(fù)荷的提示只顯示高危病毒感染，不具體分型，可提示病毒的負(fù)荷敏感性及特異性敏感性+特異性+++敏感性+++特異性+敏感性+特異性++取材組織或細(xì)胞涂片陰道分泌物陰道分泌物HPV檢測方法的比較原位雜交導(dǎo)流雜交基因捕獲HC-II原理在28生物傳感器技術(shù)24種HPV亞型，其中低危8種（6,11,40,42,43,44,54,70），高危16種（16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,81）可檢測HPV的載量子宮頸細(xì)胞中HPV的情況

單獨(dú)感染混合感染（2、3，～6種HPV型）生物傳感器技術(shù)24種HPV亞型，其中低危8種（6,11,29子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染HPV檢出率1(導(dǎo)流雜交）病毒種類1HR-HPV檢出率2（HC-II)尖銳濕疣92%6,11,31,52低級(jí)別CIN89%16,31,18,52,33,6,1174.93%高級(jí)別CIN100%16,33,52,1891.72%鱗狀上皮增生33%6,11,16,1843.29%1.北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科2.解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染HPV檢出率1(導(dǎo)流雜交）病30CIN中需注意的問題CIN病變也可表現(xiàn)為鱗狀上皮的表面上皮顯著的不典型增生，而非基底層細(xì)胞，是CINI的病理基礎(chǔ)CIN病變累及腺體一般：鱗狀上皮CINIII，進(jìn)一步向下發(fā)展延伸至腺體，但未突破基底膜少數(shù)：鱗狀上皮CINII，腺體鱗化也呈CINII，這時(shí)為表達(dá)腺體的改變，診斷為CINII累及腺體個(gè)別：在腺體鱗化的基礎(chǔ)上出現(xiàn)不典型增生，甚至出現(xiàn)的不典型增生的程度超過表面鱗狀上皮CIN中需注意的問題CIN病變也可表現(xiàn)為鱗狀上皮的表面上皮顯31絕大多數(shù)的HPV感染可回退SpontaneousregressionSpontaneousregressionCancerHigh-grade

dysplasiaLow-gradedysplasiaSubclinicalHPVinfectionUSCases300,00011,0001,400,00030,000,000

HPVinfectionCervicalCancerSpontaneousregression絕大多數(shù)的HPV感染可回退SpontaneousSponta32持續(xù)性HPV感染導(dǎo)致CIN2-3

LSIL一般由瞬間HPV感染引起HSIL發(fā)生在那些持續(xù)性HR-HPV感染2年以上的患者大多數(shù)年輕的女性(<30yrs)的HPV感染為暫時(shí)性的，將被自體免疫系統(tǒng)清除HPV持續(xù)性感染一般發(fā)生在老年女性持續(xù)性HPV感染導(dǎo)致CIN2-3LSIL一般由瞬間HPV33HPV感染與機(jī)體免疫反應(yīng)陰道分泌物的粘液抗微生物多肽，抗體，酸性環(huán)境及鋅離子等組成第一道防線子宮頸鱗狀上皮（復(fù)層上皮）形成天然屏障，組成第二道防線內(nèi)在的非特異性免疫防御系統(tǒng)即炎癥反應(yīng)，構(gòu)成第三道防線局部的細(xì)胞免疫監(jiān)視，可啟動(dòng)接觸性級(jí)連反應(yīng)，放大傳遞信號(hào)，形成針對殼蛋白L1的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)大多數(shù)的HPV感染細(xì)胞將成為HPVL1抗原遞呈細(xì)胞；細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和輔助T淋巴細(xì)胞可識(shí)別此細(xì)胞，并通過免疫監(jiān)視和免疫清除殺滅細(xì)胞HPV感染與機(jī)體免疫反應(yīng)陰道分泌物的粘液抗微生物多肽，抗體，34

CytoReact

用敏感的非同位素核酸雜交和免疫組織化學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測子宮頸細(xì)胞中HPVL1蛋白的存在，可用于細(xì)胞學(xué)涂片，組織學(xué)切片的檢測。廣譜的HPVL1抗體可識(shí)別大多數(shù)的HPVL1蛋白（6,11,16,18,31,33,42,51,52,56，58）。

CytoReact

用敏感的非同位素核酸雜交和免疫組織化學(xué)35基本原理特點(diǎn)多聚物微球結(jié)合非同位素標(biāo)記HPVL1DNA探針與多聚酶混合物（固態(tài)雜交液）解鏈及雜交過程與抗原修復(fù)過程合并標(biāo)記物為堿性磷酸酶，底物為AEC原為雜交與免疫組化反應(yīng)顏色重疊，提高敏感性20-30倍可檢測出0.01pgHPVL1蛋白細(xì)胞核陽性表達(dá)（核膜及核）基本原理特點(diǎn)多聚物微球結(jié)合非同位素標(biāo)記HPVL1DNA探針與36HPVL1的存在表明HPV病毒感染處于游離狀態(tài)或瞬時(shí)感染期HPVL1陽性與異常細(xì)胞學(xué)的回退密切相關(guān)在HPV(+)的病人中，HPVL1的缺失，提示存在HPV的持續(xù)感染，并有向高級(jí)別CIN發(fā)展的趨勢特別有意義的是，在HR-HPV(+)的病人中，HPVL1陽性提示HPV以游離狀態(tài)存在，發(fā)生高級(jí)別CIN的機(jī)率極低HPVL1檢測的臨床意義

HPVL1的存在表明HPV病毒感染處于游離狀態(tài)或瞬時(shí)感染期37p16檢測的意義p16是cyclin依賴性激酶抑制劑，抑癌基因，可抑制CDK4、CDK6活性，降低RB的磷酸化，增強(qiáng)RB的功能，抑制E2F-1的釋放，從而抑制細(xì)胞周期E7結(jié)合RB，釋放E2F-1，促使細(xì)胞周期E2F-1的聚集（RB的磷酸化的結(jié)果）導(dǎo)致p16的增加p16的高表達(dá)提示HPVE7的存在p16檢測的意義p16是cyclin依賴性激酶抑制劑，抑癌基38小結(jié)CIN的發(fā)生及發(fā)展與HPV的感染直接相關(guān)HPV≠CINCIN=HPVCIN分為：CINI、II、III；TBS：Ascus,LSIL，HSIL臨床常用的HPV檢測方法（HC-II，導(dǎo)流雜交）陰道小環(huán)境的HPV感染狀況間接代表子宮頸HPV感染狀況不知HPV的生物學(xué)存在狀況生物傳感儀檢測子宮頸組織和細(xì)胞中的HPV類型TERC基因擴(kuò)增表明細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)，提示病變向惡性發(fā)展的原動(dòng)力存在p16的檢測可提示HR-HPV感染，并整合宿主DNA子宮頸組織和細(xì)胞中HPVL1檢測陽性，提示機(jī)體免疫可清除HPV病毒感染細(xì)胞，使CIN病變向良性發(fā)展小結(jié)CIN的發(fā)生及發(fā)展與HPV的感染直接相關(guān)39液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)真空負(fù)壓吸引，膜式采集技術(shù)重力沉降技術(shù)離心沉降技術(shù)其他特點(diǎn)：標(biāo)本保存時(shí)間長，更完整，結(jié)構(gòu)更清晰細(xì)胞數(shù)量更多細(xì)胞平鋪，不重疊更利于觀察，不易漏觀察可重復(fù)制片液基薄層細(xì)胞制片技術(shù)40應(yīng)用范圍：子宮頸細(xì)胞學(xué)檢查體液細(xì)胞學(xué)檢查（胸腔積液、腹腔積液、尿液、腦脊液及灌洗液等）分泌物細(xì)胞學(xué)檢查（痰液）優(yōu)勢：明顯提高陽性細(xì)胞檢出率前提：具備豐富診斷經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師是關(guān)鍵國外細(xì)胞學(xué)醫(yī)師需要獲得醫(yī)師資格證、病理醫(yī)師資格證以后，再經(jīng)過2-3年的專科培訓(xùn)才能從事細(xì)胞學(xué)診斷，并擔(dān)負(fù)相應(yīng)法律責(zé)任國內(nèi)正在規(guī)范，從事細(xì)胞學(xué)診斷必須有醫(yī)師資格證并注冊到病理診斷應(yīng)用范圍：411988年，美國國家癌癥研究所在馬利蘭州的Bethesda召開了病理細(xì)胞學(xué)會(huì)議，提出子宮頸細(xì)胞學(xué)報(bào)告的新分類，即Bethesda報(bào)告系統(tǒng)（TheBethesdaSystem,TBS）1988年，美國國家癌癥研究所在馬利蘭州的Bethesda召42TheBethesdasystemforReportingCervicalCytology(TBS)根據(jù)2001年第三屆國際Bethesda工作會(huì)議要求由著名細(xì)胞病理學(xué)家Solomon和Nayar編著是目前有關(guān)子宮頸細(xì)胞學(xué)分類和診斷標(biāo)準(zhǔn)中最新，最權(quán)威的該系統(tǒng)的3個(gè)基本原則：在不同病理學(xué)家及病理科必須是統(tǒng)一的，可重復(fù)的，并富有靈活性能反映對子宮頸腫瘤的最新認(rèn)識(shí)能將病理的有關(guān)臨床信息傳遞給患者TheBethesdasystemforReport43TBS的改變是基于臨床的進(jìn)展和對宮頸癌生物學(xué)行為研究的進(jìn)展廢棄“診斷(diagnosis)”，而使用“判讀(interpretation)”或“結(jié)果(result)”一詞病人的最終診斷及處理方案不僅依靠細(xì)胞學(xué)結(jié)果，還需整合病史、臨床發(fā)現(xiàn)及其他實(shí)驗(yàn)室結(jié)果（ASCUS,HSIL)細(xì)胞學(xué)結(jié)果只是代表形成最終診斷的一個(gè)重要因素TBS的改變是基于臨床的進(jìn)展和對宮頸癌生物學(xué)行為研究的進(jìn)展44子宮頸細(xì)胞學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)的變遷20世紀(jì)40年代初，巴氏創(chuàng)建了子宮頸細(xì)胞學(xué)檢查方法并提出巴氏分級(jí)報(bào)告系統(tǒng)(以癌為中心)20世紀(jì)50-70年代，認(rèn)識(shí)了原位癌和不典型增生，并分為輕、中、重20世紀(jì)70年代，Richart提出子宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)，認(rèn)為不典型增生的細(xì)胞在本質(zhì)上與原位癌的細(xì)胞無差異，是同一疾病過程在上皮內(nèi)連續(xù)的、不同程度的病變，兩者有共同的病因、生物學(xué)特征和自然病程，具有演變?yōu)榘┑臐撃?，為浸潤癌的前期病變。子宮頸細(xì)胞學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)的變遷20世紀(jì)40年代初，巴氏創(chuàng)建了子宮45子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染課件46子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染課件47TBS的問題TBS與TCT的關(guān)系？AUS-US的發(fā)現(xiàn)率？HPV，滴蟲及霉菌檢出陽性率低？TBS的問題TBS與TCT的關(guān)系？48HPVL1HPVCytologyTestHPVPrecancerCancer

子宮頸癌的預(yù)防策略Currently:Future??HPVDNATest

VaccineCytologyTestHPVL1HPVCytologyTestHPVPrec49謝謝！謝謝！50病理新技術(shù)在子宮頸CIN的應(yīng)用河南省人民醫(yī)院病理科孔令非病理新技術(shù)在子宮頸CIN的應(yīng)用河南省人民醫(yī)院病理科51病理學(xué)新技術(shù)FISH原位雜交免疫組織化學(xué)生物傳感器病理學(xué)新技術(shù)FISH52熒光原位雜交Fluorescenceinsituhybridization原理利用DNA堿基對的互補(bǔ)性，將直接標(biāo)記了熒光的單鏈DNA(探針)和與其互補(bǔ)的目標(biāo)樣本的DNA(玻片上的標(biāo)本)雜交,通過觀察熒光信號(hào)在染色體上的位置反映相應(yīng)染色體的情況FISH熒光原位雜交FISH53FISH操作樣本預(yù)處理

脫蠟，脫水及水化，消化，探針、樣本變性78℃探針＋樣本雜交45-50℃雜交后洗滌結(jié)果觀察FISH操作樣本預(yù)處理54FISH探針種類CSP著絲粒探針GLP特異性位點(diǎn)探針染色體整臂探針FISH探針種類CSP著絲粒探針GLP特異性位點(diǎn)探針染色55FISH探針的類型

全染色體涂抹探針（WCP）染色體計(jì)數(shù)（著絲粒）探針（CSP）位點(diǎn)特異性探針（GLP）單色特異性探針雙色分離重排探針雙色雙融合易位探針

FISH探針的類型全染色體涂抹探針（WCP）56IgHBcl2IGH/BCL2探針14（灰）號(hào)和18號(hào)（黑）染色體IgH基因Bcl-2基因雜交正常

異常融合基因擴(kuò)增雙色雙融合易位探針(IGH/BCL2）IgHBcl2IGH/BCL2探針14（灰）號(hào)和18號(hào)（黑）57

FISH的特點(diǎn)操作簡單檢測快速結(jié)果易觀察靈敏性和特異性高可檢測樣本種類多空間定位精確FISH的特點(diǎn)操作簡單檢測快速結(jié)果易觀察58FISH檢測在臨床中的應(yīng)用產(chǎn)前診斷血液病檢測實(shí)體瘤檢測FISH檢測在臨床中的應(yīng)用產(chǎn)前診斷59端粒，端粒酶及作用端粒是真核細(xì)胞染色體末端的特殊NDA-蛋白結(jié)構(gòu)，其DNA含大量TTAGGG重復(fù)序列，在進(jìn)化中高度保守DNA酶不能復(fù)制線性DNA（端粒是線性DNA）大多數(shù)體細(xì)胞的端粒會(huì)隨周期性復(fù)制而縮短，最終達(dá)到一個(gè)使染色體完整性喪失的臨界點(diǎn)，細(xì)胞增殖停止；許多腫瘤細(xì)胞端粒酶活性增高，是腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵步驟作用：保護(hù)染色體基因組免受降解或重組為染色體末端提供一種可消耗的非編碼序列，以緩解或取消末端復(fù)制所帶來的染色體DNA進(jìn)行性縮短生殖細(xì)胞具有端粒酶活性，其端粒不隨年齡增加而縮短，故成為永生細(xì)胞端粒，端粒酶及作用端粒是真核細(xì)胞染色體末端的特殊NDA-蛋白60端粒酶由RNA，DNA及蛋白質(zhì)組成，本質(zhì)是一種逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶活性決定于端粒酶RNA（humantelomeraseRNA,hTERC)和端粒酶催化亞單位(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)hTERC是端粒長度穩(wěn)定的直接因素保持端粒穩(wěn)定、基因組完整、細(xì)胞長期有活性和潛在的繼續(xù)增殖能力人端粒酶基因位于3q26.3，該基因的擴(kuò)增可阻止細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生端粒酶由RNA，DNA及蛋白質(zhì)組成，本質(zhì)是一種逆轉(zhuǎn)錄酶61宮頸脫落細(xì)胞及組織學(xué)FISH探針CSP3TERChTERC基因定位于3q26.3

3號(hào)染色體著絲粒信號(hào)宮頸脫落細(xì)胞及組織學(xué)FISH探針CSP3TERChTERC基62AllthethreecentersobtainedsimilarlyincreasingtrendofhTERCpositiveratesaccordingtotheseverityofcervicallesions,forbothcytologicalresultsandpathologicaldiagnosis.Allthethreecentersobtained63中國8350例子宮頸病變TERC擴(kuò)增TBS分級(jí)正常/炎癥ASCUSASC-HLSILHSILTERC基因擴(kuò)增發(fā)生率（%）4.613.528.625.287.7病理分級(jí)正常/炎癥CIN1CIN2CIN3浸潤癌TERC基因擴(kuò)增發(fā)生率（%）4.2-10.626.865.483.193.5中國8350例子宮頸病變TERC擴(kuò)增TBS分級(jí)正常/炎癥AS64hTERC檢測臨床意義伴有hTERC基因擴(kuò)增的癌前病變的病人有52%－96%的惡變可能?？深A(yù)測CIN1/CIN2向CIN3發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素，其靈敏度是100%，特異性是70%.

FISH是早期診斷和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的有效手段(AJPApril2005,Vol.166,No.4)hTERC檢測臨床意義伴有hTERC基因擴(kuò)增的癌前病變的病人65hTERC基因檢測在宮頸癌和宮頸癌前病變診斷中有重要價(jià)值魏麗惠，李亞里，吳瑞芳，陳忠，屠錚，江靜，李靜然北京大學(xué)人民醫(yī)院婦科，北京，中國中國解放軍總醫(yī)院婦科，北京，中國北京大學(xué)深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科，深圳，中國猶他大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)科，鹽湖城，美國該研究顯示，采用FISH技術(shù)檢測hTERC基因擴(kuò)增可在宮頸細(xì)胞學(xué)玻片上進(jìn)行，具有無創(chuàng)性和客觀性的特點(diǎn)，敏感度和特異度高，在宮頸癌和宮頸癌前病變的診斷中有重要價(jià)值。hTERC基因的異常擴(kuò)增可能成為宮頸病變惡性進(jìn)展的早期標(biāo)記物。北京協(xié)和醫(yī)院郎景和教授點(diǎn)評(píng)：在液基細(xì)胞學(xué)檢查和檢測人乳頭狀瘤病毒篩查宮頸癌的同時(shí)，檢測hTERC基因，有望成為協(xié)助宮頸癌和宮頸癌前病變診斷及預(yù)測癌前病變是否向子宮頸癌發(fā)展的重要指標(biāo)，而造福廣大婦女。hTERC基因檢測在宮頸癌和宮頸癌前病變診斷中有重要價(jià)值北京66細(xì)胞非典型性發(fā)育異常細(xì)胞癌變阻止細(xì)胞正常凋亡高危型HPV持續(xù)性感染人類染色體端粒酶基因(hTERC)擴(kuò)增致癌基因E6/E7編碼的原癌蛋白表達(dá)TERC基因的擴(kuò)增可阻止細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生

P16表達(dá)E7結(jié)合RBE6結(jié)合p53細(xì)胞非典型性發(fā)育異常細(xì)胞癌變阻止細(xì)胞正常凋亡高危型HPV持續(xù)67隨著宮頸病變級(jí)別增加，hTERC的陽性率增加hTERC陽性率正?；蜓装Y組4.2-10.6%CIN1組26.8%

CIN2組69.23%CIN3組83.58%宮頸癌組95.65%正常及CIN1的hTERC基因陽性率明顯低于CIN2及以上者，P<0.01

hTERC診斷CIN2或CIN2以上病變敏感度81.40%特異度95.04%陽性預(yù)測值70.00%陰性預(yù)測值97.29%

隨著宮頸病變級(jí)別增加，hTERC的陽性率增加68子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染課件69HumanPapillomaVirus(HPV)環(huán)狀雙鏈DNA病毒超過120種亞型其中的72種亞型可引起肛門及生殖器疾病Lowrisk(LR-HPV):6,11,40,42,44,54,61,70,72,81Highrisk(HR-HPV):16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,63,78,82HumanPapillomaVirus(HPV)環(huán)狀雙鏈70

HPV的生物學(xué)狀態(tài):游離或整合在HPV感染的早期或瞬間感染，HPV基因組以游離的環(huán)狀DNA形式存在于宿主細(xì)胞核中。(CondylomaandCIN-1)持續(xù)的HPV感染，使其DNA整合進(jìn)宿主DNA，標(biāo)志著惡性轉(zhuǎn)化。(CIN2＋lesions)HPV的生物學(xué)狀態(tài):游離或整合在HPV感染的早期或瞬間感71持續(xù)性的HPV感染幾乎總是發(fā)生在兩種上皮的交界處（宮頸移行帶、肛門和口咽）HPV通過宮頸鱗腺交界處感染基底細(xì)胞或HPV通過微創(chuàng)傷直接感染基底細(xì)胞臨床治療需要破壞移行帶，而不僅僅是病變本身持續(xù)性的HPV感染幾乎總是發(fā)生在兩種上皮的交界處（宮頸移行帶72HPV檢測及預(yù)后預(yù)測價(jià)值陰性預(yù)測價(jià)值(NPV)約~99%womennotinfectedwithHR-HPVhave<1%chancetohaveHSILlesion陽性預(yù)測價(jià)值(PPV)根據(jù)患者的年齡:<30:PPVisonly20%evenpersistentHPV>30:PPVgraduallyincreasedwithageandpersistentHPVinfectionHPV檢測及預(yù)后預(yù)測價(jià)值陰性預(yù)測價(jià)值(NPV)約~99%73原為雜交法用標(biāo)記的HPV探針在組織上或細(xì)胞上進(jìn)行原位的雜交，并進(jìn)行顯色特異性最強(qiáng)敏感性高直觀可結(jié)合組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)形態(tài)探針有：6/11,16/18,31/33原為雜交法用標(biāo)記的HPV探針在組織上或細(xì)胞上進(jìn)行原位的雜交，74導(dǎo)流雜交法擴(kuò)增所取樣本的DNA放在固定好基因探針的基因芯片上（21種亞型包括13種高危亞型16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68及5種低危亞型6,11,42,43,44和3種中國人群常見的亞型53,66,CP8304型進(jìn)行雜交探針標(biāo)記Biotin及堿磷酶用NBT/BCIP進(jìn)行顯色結(jié)果呈藍(lán)紫色導(dǎo)流雜交法擴(kuò)增所取樣本的DNA75判定標(biāo)準(zhǔn)－RLU/Cutoff

的比值≥1=陽性,50以內(nèi)的數(shù)值對病情的嚴(yán)重程度并沒有指示性，但>50的數(shù)值對病情的嚴(yán)重程度的估計(jì)有指導(dǎo)意義。＜1=陰性，表示未檢出13種高危型HPVDNA序列或標(biāo)本中不含有高危型HPVDNA序列，又或者其濃度水平在測定方法的檢測限度以下，不能除外潛伏感染；如果接近但小于1.0且被懷疑有高危型HPV感染，應(yīng)該重新采集標(biāo)本。判定標(biāo)準(zhǔn)－RLU/Cutoff

的比值76HC-II的應(yīng)用條件HPVtest不適用的情況：細(xì)胞學(xué)顯示異型增生時(shí)年齡<30歲，除非細(xì)胞學(xué)顯示ASC-US男性外生殖器HPVtest應(yīng)用條件：ASC-US>30歲的女性,細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)合HPVtestHC-II的應(yīng)用條件HPVtest不適用的情況：77HPV檢測方法的比較原位雜交導(dǎo)流雜交基因捕獲HC-II原理在原位進(jìn)行HPVDNA的雜交提取DNA進(jìn)行PCR，進(jìn)行膜雜交DNA分解，DNA-RNA雜交，抗體捕獲，特點(diǎn)組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)涂片上原位顯示分型HPV具體分型顯示HPV,無病毒負(fù)荷的提示只顯示高危病毒感染，不具體分型，可提示病毒的負(fù)荷敏感性及特異性敏感性+特異性+++敏感性+++特異性+敏感性+特異性++取材組織或細(xì)胞涂片陰道分泌物陰道分泌物HPV檢測方法的比較原位雜交導(dǎo)流雜交基因捕獲HC-II原理在78生物傳感器技術(shù)24種HPV亞型，其中低危8種（6,11,40,42,43,44,54,70），高危16種（16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,81）可檢測HPV的載量子宮頸細(xì)胞中HPV的情況

單獨(dú)感染混合感染（2、3，～6種HPV型）生物傳感器技術(shù)24種HPV亞型，其中低危8種（6,11,79子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染HPV檢出率1(導(dǎo)流雜交）病毒種類1HR-HPV檢出率2（HC-II)尖銳濕疣92%6,11,31,52低級(jí)別CIN89%16,31,18,52,33,6,1174.93%高級(jí)別CIN100%16,33,52,1891.72%鱗狀上皮增生33%6,11,16,1843.29%1.北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科2.解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科子宮頸鱗狀上皮病變中HPV感染HPV檢出率1(導(dǎo)流雜交）病80CIN中需注意的問題CIN病變也可表現(xiàn)為鱗狀上皮的表面上皮顯著的不典型增生，而非基底層細(xì)胞，是CINI的病理基礎(chǔ)CIN病變累及腺體一般：鱗狀上皮CINIII，進(jìn)一步向下發(fā)展延伸至腺體，但未突破基底膜少數(shù)：鱗狀上皮CINII，腺體鱗化也呈CINII，這時(shí)為表達(dá)腺體的改變，診斷為CINII累及腺體個(gè)別：在腺體鱗化的基礎(chǔ)上出現(xiàn)不典型增生，甚至出現(xiàn)的不典型增生的程度超過表面鱗狀上皮CIN中需注意的問題CIN病變也可表現(xiàn)為鱗狀上皮的表面上皮顯81絕大多數(shù)的HPV感染可回退SpontaneousregressionSpontaneousregressionCancerHigh-grade

dysplasiaLow-gradedysplasiaSubclinicalHPVinfectionUSCases300,00011,0001,400,00030,000,000

HPVinfectionCervicalCancerSpontaneousregression絕大多數(shù)的HPV感染可回退SpontaneousSponta82持續(xù)性HPV感染導(dǎo)致CIN2-3

LSIL一般由瞬間HPV感染引起HSIL發(fā)生在那些持續(xù)性HR-HPV感染2年以上的患者大多數(shù)年輕的女性(<30yrs)的HPV感染為暫時(shí)性的，將被自體免疫系統(tǒng)清除HPV持續(xù)性感染一般發(fā)生在老年女性持續(xù)性HPV感染導(dǎo)致CIN2-3LSIL一般由瞬間HPV83HPV感染與機(jī)體免疫反應(yīng)陰道分泌物的粘液抗微生物多肽，抗體，酸性環(huán)境及鋅離子等組成第一道防線子宮頸鱗狀上皮（復(fù)層上皮）形成天然屏障，組成第二道防線內(nèi)在的非特異性免疫防御系統(tǒng)即炎癥反應(yīng)，構(gòu)成第三道防線局部的細(xì)胞免疫監(jiān)視，可啟動(dòng)接觸性級(jí)連反應(yīng)，放大傳遞信號(hào)，形成針對殼蛋白L1的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)大多數(shù)的HPV感染細(xì)胞將成為HPVL1抗原遞呈細(xì)胞；細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和輔助T淋巴細(xì)胞可識(shí)別此細(xì)胞，并通過免疫監(jiān)視和免疫清除殺滅細(xì)胞HPV感染與機(jī)體免疫反應(yīng)陰道分泌物的粘液抗微生物多肽，抗體，84

CytoReact

用敏感的非同位素核酸雜交和免疫組織化學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測子宮頸細(xì)胞中HPVL1蛋白的存在，可用于細(xì)胞學(xué)涂片，組織學(xué)切片的檢測。廣譜的HPVL1抗體可識(shí)別大多數(shù)的HPVL1蛋白（6,11,16,18,31,33,42,51,52,56，58）。

CytoReact

用敏感的非同位素核酸雜交和免疫組織化學(xué)85基本原理特點(diǎn)多聚物微球結(jié)合非同位素標(biāo)記HPVL1DNA探針與多聚酶混合物（固態(tài)雜交液）解鏈及雜交過程與抗原修復(fù)過程合并標(biāo)記物為堿性磷酸酶，底物為AEC原為雜交與免疫組化反應(yīng)顏色重疊，提高敏感性20-30倍可檢測出0.01pgHPVL1蛋白細(xì)胞核陽性表達(dá)（核膜及核）基本原理特點(diǎn)多聚物微球結(jié)合非同位素標(biāo)記HPVL1DNA探針與86HPVL1的存在表明HPV病毒感染處于游離狀態(tài)或瞬時(shí)感染期HPVL1陽性與異常細(xì)胞學(xué)的回退密切相關(guān)在HPV(+)的病人中，HPVL1的缺失，提示存在HPV的持續(xù)感染，并有向高級(jí)別CIN發(fā)展的趨勢特別有意義的是，在HR-HPV(+)的病人中，HPVL1陽性提示HPV以游離狀態(tài)存在，發(fā)生高級(jí)別CIN的機(jī)率極低HPVL1檢測的臨床意義

HPVL1的存在表明HPV病毒感染處于游離狀態(tài)或瞬時(shí)感染期87p16檢測的意義p16是cyclin依賴性激酶抑制劑，抑癌基因，可抑制CDK4、CDK6活性，降低RB的磷酸化，增強(qiáng)RB的功能，抑制E2F-1的釋放，從而抑制細(xì)胞周期E7結(jié)合RB，釋放E2F-1，促使細(xì)胞周期E2F-1的聚集（RB的磷酸化的結(jié)果）導(dǎo)致p16的增加p1