高效液相色譜簡介及操作課件

高效液相色譜

High-PerformanceLiquidChromatography，HPLC高效液相色譜概述及原理主要注意事項基本操作步驟高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)主要內(nèi)容1234一、高效液相色譜概述及原理高效液相色譜法（HPLC）是在20世紀(jì)70年代在經(jīng)典液相色譜和氣相色譜的基礎(chǔ)上迅速發(fā)展起來的一種高效、快速的分離分析技術(shù)。漸漸地，人們以傳統(tǒng)色譜為藍本開發(fā)了氣相色譜氣相色譜示意圖經(jīng)典的柱色譜高效液相色譜：效仿氣相色譜，用高壓輸液泵將流動相輸入高柱效色譜柱，使其在柱內(nèi)快速流動，并在柱末端附加檢測器檢測分離情況。高效液相色譜就這樣誕生了。高效液相色譜儀就這樣誕生了LCGCHPLC填料顆粒?。?~10μm），受到的阻力較大，為了能迅速地通過色譜柱，必須對載液施加15~30MPa的高壓。由于采用高壓，載液在色譜柱內(nèi)的流速可達l~10mL／min，因而所需分析時間少。

使用細、規(guī)則、孔淺的顆粒做為固定相，分離效率大大提高。采用紫外、熒光、蒸發(fā)激光散射、電化學(xué)、質(zhì)譜等檢測器，檢測靈敏度高。紫外檢測器檢測限可達0.01ng；熒光和電化學(xué)檢測器可達0.1pg。2.為什么叫高效液相色譜???3.高效液相色譜法的分類通常將液相色譜法按分離機理分成吸附色譜法、分配色譜法、離子色譜法和凝膠色譜法四大類。定性分析：在同一色譜系統(tǒng)中相同物質(zhì)具有相同的保留值定量分析：組分含量與其響應(yīng)值（峰高或面積）成正比（a）柱效和分離度都不好；（b）分離度高，柱效低；（c）理想色譜峰用分離度R可以描述選擇性和柱效的總效能R值越大，表明兩組分的分離程度越高，R=1.0時，分離程度可達98%，R<1.0時兩峰有部分重疊，R=1.5時，分離程度達到99.7%.所以，通常用R=1.5作為相鄰兩色譜峰完全分離的指標(biāo).分析未知物質(zhì)------聯(lián)用技術(shù)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜-核磁共振聯(lián)用色譜-傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀聯(lián)用二、高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)液相色譜儀由高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)以及檢測和記錄系統(tǒng)四大部分組成。此外，可根據(jù)需要配置流動相在線脫氣裝置、梯度洗脫裝置、自動進樣系統(tǒng)、柱后反應(yīng)系統(tǒng)和全自動控制系統(tǒng)等。高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)流程圖（2）高壓輸液泵主要部件之一，泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性，常用的壓力范圍：(150～350)×105Pa。

輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定；②流量范圍寬；

③輸出壓力高；④液缸容積小；⑤密封性能好，耐腐蝕。高壓泵的分類往復(fù)式柱塞泵分類恒流泵恒壓泵螺旋注射泵柱塞往復(fù)泵隔膜往復(fù)泵六通閥的結(jié)構(gòu)：色譜柱是高效液相色譜的心臟。柱管多用不銹鋼制成。兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，防止填料漏出。填料的粒度多為0.2-20μm(5-10μm)。

發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

常規(guī)分析柱：內(nèi)徑2~5mm(常用4.6mm，3.9mm)，柱長10~30cm(15cm，25cm居多）。

3分離系統(tǒng)包括色譜柱、恒溫器和連接管等部件。原理：朗伯-比爾定律a.紫外檢測器(UVD)：應(yīng)用最廣泛的檢測器。特點：使用面廣；

靈敏度高（檢測下限為10-10g／ml）；

線性范圍寬；

對溫度和流速變化不敏感；

可檢測梯度溶液洗脫的樣品。缺點：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動相的截止波長應(yīng)小于檢測波長。b.示差折光檢測器(RID)原理：監(jiān)測參比池和測量池中溶液的折射率之差來測量試樣濃度。特點：通用性檢測器；對溫度變化比較敏感，要保持在±0.001℃；靈敏度低(10-6g)；對溶劑變化敏感，不適用于梯度洗脫。凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統(tǒng)。c.熒光檢測器(FLD)原理:某些溶質(zhì)在紫外光激發(fā)后能發(fā)射可見光(熒光)的性質(zhì)檢測。

特點:選擇性檢測器，靈敏度比紫外檢測器高2-3個數(shù)量級，可達到10-12g；選擇性好，對流量和溫度敏感性低。缺點：只適合于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的檢測。只適用于具有熒光的有機化合物（如多環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質(zhì)等）的測定。5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)該系統(tǒng)可對測試數(shù)據(jù)進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。三、高效液相色譜基本操作步驟（1）檢查電源線連接是否正確后打開電源開關(guān)（2）泵體及流路內(nèi)的氣泡排除（3）正確連接色譜柱

注意流向標(biāo)志，切勿反接（4）系統(tǒng)平衡第一步：先用甲醇或乙腈沖洗流路約20分鐘，平衡活化色譜柱，并趕走管路中的雜質(zhì)和水分。第二步：平衡色譜柱方法一：若流動相為有機相與水相的混合物，則第一步完成后，按照分析樣品的需要調(diào)節(jié)有機相與水相的比例后沖洗流路約30分鐘后，待基線走平后即可進樣。方法二：若流動相中含有緩沖鹽溶液、有機/無機酸，則第一步完成后，先用95%的去離子水沖洗流路約20分鐘后，再按照分析樣品的需要調(diào)節(jié)流動相的比例，沖洗流路約30分鐘，待基線走平后即可進樣。（5）色譜柱平衡后，打開檢測器（開燈）（6）測定樣品（7）清洗儀器

色譜柱及流路清洗進樣閥清洗進樣針清洗

四、主要注意事項1泵使用的注意事項防止任何固體微粒進入泵體（用0.22

um或0.45um的微孔濾膜過濾）流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖鹽的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)更不允許留在柱內(nèi)。泵工作時防止溶劑瓶內(nèi)的流動相用完，否則空泵運轉(zhuǎn)一是會使大量空氣進入柱內(nèi)柱床崩塌、也會磨損柱塞、密封圈，最終產(chǎn)生漏液。輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力。流動相應(yīng)先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性和分析結(jié)果。2色譜柱使用的注意事項3其他注意事項色譜柱在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動。當(dāng)分析柱長