對(duì)復(fù)發(fā)性難治性慢性淋巴細(xì)胞白血病的持續(xù)緩解

嵌合抗原受體T細(xì)胞對(duì)復(fù)發(fā)性難治性慢性淋巴細(xì)胞白血病的持續(xù)緩解難治性或多次復(fù)發(fā)的慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）的患者預(yù)后較差。靶向CD19的嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤的持續(xù)緩解，具有提高常規(guī)療法低緩解率的潛力。我們?cè)?jīng)報(bào)道過3例難治性CLL治療的初步研究結(jié)果?，F(xiàn)在我們報(bào)道使用CAR-T細(xì)胞治療的14例復(fù)發(fā)性難治性CLL患者的初步試驗(yàn)中成熟的研究結(jié)果。用慢病毒載體導(dǎo)入CD19CAR的自體T細(xì)胞（CTL019），輸注給復(fù)發(fā)/難治性CLL患者，輸注劑量為0.14×108到11×108CTL019細(xì)胞（平均1.6×108細(xì)胞）。對(duì)患者體內(nèi)的CTL019進(jìn)行毒性，應(yīng)答，擴(kuò)增和持續(xù)性進(jìn)行監(jiān)測(cè)。經(jīng)多次治療的CLL患者中，總有效率為8/14(57%)，其中4名患者完全緩解（CR），4名患者部分緩解（PR）。體內(nèi)CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增與臨床應(yīng)答相關(guān)，前2名獲得CR的患者，體內(nèi)CAR-T細(xì)胞功能持久保持超過4年。CR的患者疾病都沒有出現(xiàn)復(fù)發(fā)。所有應(yīng)答的患者出現(xiàn)B細(xì)胞再生障礙和細(xì)胞因子釋放綜合征都與CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增相關(guān)。在獲得CR的患者身上檢測(cè)不到微小殘留病灶，這表明了治愈晚期CLL患者成為可能。前言慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）是成人白血病中最常見的類型。CLL的病程變化很大，總生存期為2年到20年。盡管有很多有效的療法，但傳統(tǒng)療法CLL無法被治愈，病情惡化亦不可避免。雖然可通過同種異體造血干細(xì)胞移植來治愈部分患者，但這也有較高的發(fā)病率和死亡率，并且有許多CLL患者不適合移植治療。難治性或多次復(fù)發(fā)的CLL患者預(yù)后較差，其總生存期由前期的無進(jìn)展生存期決定。CD19嵌合抗原受體（CAR）修飾的T細(xì)胞是CLL和其他B細(xì)胞惡性腫瘤的一個(gè)不錯(cuò)的治療方法。CAR是通過基因改造，由結(jié)合靶向抗體的單鏈可變區(qū)（scFv）與胞內(nèi)信號(hào)和共刺激域組成的分子。早期嘗試使用的CAR修飾的T細(xì)胞靶向惡性腫瘤，受到體內(nèi)擴(kuò)增和最低持續(xù)時(shí)間不足的限制，或因正常組織表達(dá)靶向抗原引起脫靶毒性。CTL019（以前稱CART19）表達(dá)的CAR，由抗-CD19scFv與CD3ζ信號(hào)區(qū)和4-1BB（CD137）共刺激域構(gòu)成，在小鼠模型中，這種CAR分子修飾的T細(xì)胞能持久表達(dá)并保持抗腫瘤活性。由于CD19只表達(dá)在正常和惡性B細(xì)胞表面，不表達(dá)于其他細(xì)胞，所以靶向正常細(xì)胞的毒性有限。我們和其他的研究者在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，有少數(shù)患有復(fù)發(fā)或難治性CLL，急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）的患者，在接受CD19CAR-T治療后能保持長(zhǎng)時(shí)間的完全緩解（CRs）?，F(xiàn)在我們報(bào)告CTL019臨床試驗(yàn)中14例患者成熟的結(jié)果。從我的研究中可以看出，CTL019在體內(nèi)強(qiáng)力擴(kuò)增后，表現(xiàn)出長(zhǎng)期穩(wěn)定的活性，部分復(fù)發(fā)性/難治性CLL患者獲得深度緩解，持續(xù)緩解與活性的持久穩(wěn)定相關(guān)。結(jié)果患者的狀況23例CLL患者納入本次研究，其中14例患者輸注至少一個(gè)劑量的CTL019（見圖S1）。9例沒有進(jìn)行治療的患者中，3名在細(xì)胞輸注前因并發(fā)癥去世，4名主動(dòng)退出，2名沒有通過篩選。14例接受治療的患者詳情列于表1中。14例患者中，12例男性2例女性，平均年齡為66歲（年齡范圍51~78歲）。之前患者平均接受過5次治療（范圍1-11）,8例患者染色體17p（TP53）缺失。1例患者接受2次自體干細(xì)胞移植，1例患者在ibrutinib治療后疾病進(jìn)展。所有患者在輸注CTL019時(shí)處于疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。在10例患者的骨髓活檢報(bào)告中，淋巴細(xì)胞刪除性化療前骨髓中淋巴細(xì)胞比例平均為87%（范圍40%-95%）。淋巴細(xì)胞刪除性化療方案中，氟達(dá)拉濱/環(huán)磷酰胺3例，噴司他丁/環(huán)磷酰胺5例，苯達(dá)莫司汀6例。表1.患者的基本情況摘要（N=14）CharacteristicsStatistics,n(%)N14Ageatinfusion(years)Mean(SD)66.9(8.1)Median(range)66(51–78)GenderMale12(85)Female2(14)No.ofprevioustherapiesMean(SD)5.3(2.8)Median(range)5(1–11)P53or17pdeletionNo8(57)Yes6(43)IGHVmutationNo9(64)Yes4(29)Unknown1(7)Lymphocyte-depletingchemotherapyBendamustine6(43)Fludarabine/cyclophosphamide3(21)Pentostatin/cyclophosphamide5(36)Lymphocytesinbonemarrowatenrollment(%)*Mean(SD)79.5(17.9)Median(range)87.5(40–95)Raistage15(36)49(64)BinetstageA1(7)B4(29)C9(64)*Datanotavailableforfoursubjects.CTL019制備的可行性和產(chǎn)品特性產(chǎn)品特性已在表S1中概括。除了1例患者，其余全部滿足總有核細(xì)胞（TNCs）靶向制品的劑量范圍1.5×107到5×109，患者接受TNCs平均劑量是7.5×108(范圍1.7×108到50×108)。CTL019細(xì)胞是指改造的表達(dá)CAR的T細(xì)胞，14份制品的平均轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為20.1%（范圍：4.7-39.2%），輸注的CTL019總劑量平均為1.6×108細(xì)胞(范圍,0.14×108-11×108)，分3天輸完。8例患者（57%）完成了3天分散劑量輸注方案；3例患者輸注了1天（制備總量的10%），3例患輸注了2天（制備總量的40%），而且在輸注后不到24小時(shí)出現(xiàn)發(fā)燒，這跟輸注細(xì)胞劑量的變化有一些關(guān)系。輸注的細(xì)胞制品中CD4陽性細(xì)胞平均占81%（范圍：68%~95%），CD8陽性細(xì)胞平均占20%（范圍：4.6%~34%）。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)12例患者細(xì)胞制品靶向CD19陽性靶標(biāo)的活性，測(cè)定脫顆粒來衡量細(xì)胞毒性，并檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子的水平。12份制品都顯示了靶向CD19的高細(xì)胞毒性，并高表達(dá)了大部分細(xì)胞因子，這說明了這些患者的CTL019表達(dá)了具有功能的CAR（圖S2）?；颊叩闹委熜Ч函熜Ш蜕媛石熜гu(píng)判以國際研討會(huì)CLL組療效標(biāo)準(zhǔn)為基準(zhǔn)。此外，隨著時(shí)間的推移，對(duì)每例患者進(jìn)行免疫球蛋白重鏈（IGH）基因位深度測(cè)序分析，以用作血液和骨髓的疾病檢測(cè)。最佳的總體應(yīng)答率和療效歸納于表2中。14例接受治療的患者平均隨訪期為19個(gè)月（范圍6~53個(gè)月）。8/14例患者（57%;置信區(qū)間(CI)精確到95%,29~82%）出現(xiàn)應(yīng)答。4例患者完全緩解（CR）?；颊攉@得CR并且沒有出現(xiàn)復(fù)發(fā)平均為40個(gè)月（范圍,21~53個(gè)月，從輸注完畢開始計(jì)算）。緩解包括清除了微小殘余病灶（MRD），對(duì)01、02、09號(hào)受試者在第1個(gè)月和對(duì)10號(hào)受試者在第三個(gè)月進(jìn)行深度測(cè)序分析評(píng)估，在其血液和骨髓中沒有發(fā)現(xiàn)CLL克隆的存在（表3，表S2）。CTL019輸注后，其中3位患者仍然健在，保持疾病無復(fù)發(fā)23到58個(gè)月。09號(hào)受試者也獲得CR，在CTL019輸注后第15個(gè)月接受小腿基底細(xì)胞癌切除術(shù)，在CTL019輸注后的第21個(gè)月,手術(shù)部位發(fā)生感染并導(dǎo)致了致命的綠膿桿菌敗血癥和膿包壞疽。在CTL019輸注后的一個(gè)月內(nèi)4例受試者（03,05,12和22）獲得部分緩解（PR）,4例獲得PR的患者平均應(yīng)答持續(xù)時(shí)間為7個(gè)月（范圍5-13個(gè)月）。其中2例患者（03和05）血象、骨髓和淋巴結(jié)都有好轉(zhuǎn)，但他們?cè)谳斪⒑?個(gè)月疾病進(jìn)展。第12號(hào)受試者骨髓被廣泛浸潤(rùn)，輸血依賴，廣泛淋巴結(jié)腫大，在接受治療后獲得PR。輸注后，他體內(nèi)的CTL019經(jīng)過2次對(duì)數(shù)擴(kuò)增，完全清除了血液和骨髓中的CLL，并且腫大的淋巴結(jié)消退＞50%。這例患者在T細(xì)胞輸注6個(gè)月后死于大規(guī)模肺栓塞并發(fā)癥，但是他的血液和骨髓中都沒檢測(cè)到CLL存在的證據(jù)。表2.受試者的治療與臨床表現(xiàn)（N=14）。DLBCL，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤;NED，沒有疾病的證據(jù);NR，無反應(yīng)。MRD通過深度測(cè)序分析，在材料和方法中表述。表3.血液和骨髓IGH深度測(cè)序分析顯示，受試者01和02CLL細(xì)胞和B細(xì)胞被清除。BM：骨髓；PB：外周血；Mo：月；Yr：年。尸檢發(fā)現(xiàn)，腫大的腹部淋巴結(jié)取樣中有殘余的CLL浸潤(rùn)。22號(hào)受試者也存在廣泛的骨髓浸潤(rùn)，循環(huán)性疾病和嚴(yán)重淋巴結(jié)腫大。CTL019輸注后3個(gè)月，血液和骨髓中CLL被完全清除，腫大的淋巴結(jié)消退＞50%，獲得PR并持續(xù)6個(gè)月。輸注9個(gè)月后，其淋巴結(jié)迅速腫大，淋巴結(jié)活檢顯示為CD19陰性CLL彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（Richter’s征轉(zhuǎn)化）。骨髓活檢顯示約有15%CLL浸潤(rùn)并大量轉(zhuǎn)化為淋巴細(xì)胞。雖然在疾病進(jìn)展時(shí)可以在血液和骨髓中通過定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）可以檢測(cè)到CTL019，而在發(fā)生轉(zhuǎn)化和復(fù)發(fā)時(shí)，通過流式細(xì)胞儀在血液，骨髓和淋巴結(jié)活檢中都檢測(cè)不到CTL019。6例受試者在CTL019輸注后沒出現(xiàn)應(yīng)答，6例受試者進(jìn)展期在1到9個(gè)月內(nèi)（平均4個(gè)月），這6例患者T細(xì)胞擴(kuò)增受到阻礙（平均420copies/mg;范圍6.5到13876或總CD3+T細(xì)胞的0.2%）。這些患者的CLL在體外培養(yǎng)不耐受裂解。這6例受試者中有2例已經(jīng)死亡，1例在CTL019輸注8個(gè)月后死于CLL并發(fā)癥和感染，另1例在CTL019輸注9個(gè)月和進(jìn)行其他兩項(xiàng)CLL治療方案（ofatumumab和CHOP）后死于同種異體造血干細(xì)胞移植的并發(fā)癥。其他4例受試者在CTL019輸注9到15個(gè)月后仍然健在，他們都接受了其他替代治療。14例患者白血病對(duì)CTL019的應(yīng)答都通過IGH深度測(cè)序來評(píng)估（表3和表S2），有4例患者被確定產(chǎn)生響應(yīng)：(i)CTL019輸注后白血病克隆快速持續(xù)消失，MRD被清除(受試者01，02和09)。在輸注后，對(duì)受試者01，02和09外周血DNA檢測(cè)分別長(zhǎng)達(dá)4年，2年和1年，在任何一次檢測(cè)中都未發(fā)現(xiàn)白血病克?。?ii)CTL019輸注后3個(gè)月通過深度測(cè)序可確定隨著分子水平緩解，CTL019輸注會(huì)有MRD完全清除的延時(shí)性；(iii)有些患者會(huì)出現(xiàn)白血病克隆短暫的完全(受試者22)或不完全(受試者03，05，12，17和25)消失；(iv)在06，07,14和18受試者中CTL019未能導(dǎo)致IGH序列數(shù)和白血病克隆的降低。14例受試者總生存期平均約為29個(gè)月，總生存期18個(gè)月占71%(95%CI,40.6to88.2%)。無進(jìn)展生存期平均約為7個(gè)月，無進(jìn)展生存期18個(gè)月占28.6%(95%CI,8.8to52.4%)(圖1和表S6).然而1例獲得CR的受試者在輸注21個(gè)月后死于感染并發(fā)癥，獲得CR的患者疾病沒有再出現(xiàn)進(jìn)展。其他所有患者在輸注1到10個(gè)月后出現(xiàn)疾病進(jìn)展或死于疾病復(fù)發(fā)引起的并發(fā)癥。如圖S1所示，這項(xiàng)研究篩選了23例患者，其中9例未接受治療。5名患者未能入組，因?yàn)樗麄兾茨芡ㄟ^篩查或拒絕加入。因此，共18例患者加入，其中4例患者未接受治療，因?yàn)樗麄冊(cè)诮邮苤委熐安∏檠杆賽夯停ɑ颍┧劳觯╪=3），或有找到有利的替代治療主動(dòng)退出研究（n=1）。因?yàn)檫@種細(xì)胞治療方式從入選到開始治療會(huì)有延時(shí)，我們對(duì)18例入選者全部進(jìn)行PFS分析。確認(rèn)18例受試者中位PFS為9個(gè)月(95%CI,3~13.6)。圖圖1：總生存率和PFS。（A和B）總生存期（A）和PFS（B）的Kaplan-Meier曲線評(píng)估14例受試者。陰影區(qū)表示95CI。受試者風(fēng)險(xiǎn)數(shù)每隔3個(gè)月標(biāo)記一次。縱向標(biāo)刻度表示審查數(shù)據(jù)的時(shí)間點(diǎn)（源數(shù)據(jù)，表S6。）患者的年齡，既往治療的次數(shù)，入組階段，染色體17p的缺失，IGHV突變量和CTL019細(xì)胞劑量與應(yīng)答之間沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(所有P>0.05，表S3)。因?yàn)樗械幕颊叨际峭砥?，不能確定疾病負(fù)荷與應(yīng)答之間的關(guān)聯(lián)。在治療前我們對(duì)CLL上CD19的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，出現(xiàn)應(yīng)答與沒有出現(xiàn)應(yīng)答的受試者CD19熒光強(qiáng)度均值沒有區(qū)別，這說明靶標(biāo)密度不能對(duì)應(yīng)答進(jìn)行預(yù)測(cè)。CTL019在體內(nèi)的擴(kuò)增與持久性用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CTL019細(xì)胞的持久性和定量檢測(cè)（轉(zhuǎn)導(dǎo)和CAR表達(dá)）來確定T細(xì)胞抗-CD19CAR的表達(dá)，通過qPCR來識(shí)別基因修飾的T細(xì)胞。擴(kuò)增的程度和持久性的持續(xù)時(shí)間與應(yīng)答呈正相關(guān)（圖2和表S7）。在大多數(shù)情況下CTL019的擴(kuò)增與細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）相一致（后述），全部有應(yīng)答的患者CAR-T細(xì)胞都擴(kuò)增到了較高的水平。4名獲得CR的患者，通過qPCR測(cè)得CTL019擴(kuò)增峰值達(dá)25070到409645(均值73237)拷貝數(shù)/mg；在這些受試者中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CTL019細(xì)胞中CD3+細(xì)胞最高比例為34.3%，外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中CD3+細(xì)胞最高比例為81.9%。通過qPCR檢測(cè)，4例獲得PR的患者細(xì)胞擴(kuò)增度相對(duì)要低(范圍：1607到130,258;均值33,453拷貝數(shù)/mg)，CD3+比例均值為18.3%。沒有響應(yīng)的患者擴(kuò)增度最低(范圍6.5到13876，均值420拷貝數(shù)/mg)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)總CD3+比例平均為0.2%。CTL019的峰值與響應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(圖3和表S8)(qPCR，P=0.013；流式細(xì)胞術(shù)，P=0.008)。通過流式細(xì)胞術(shù)和qPCR，對(duì)4例獲得CR的患者進(jìn)行14到49個(gè)月的CTL019持久性的觀察(圖4A和表S9)。直至最后一次持續(xù)性檢測(cè)，4例患者一直都有B細(xì)胞再生障礙，這表明通過B細(xì)胞再生障礙可以反映CTL019功能的持續(xù)存在。此外，CTL019持久存在的直接證據(jù)是，在細(xì)胞輸注后3年，02號(hào)受試者體內(nèi)提取到了CAR修飾的T細(xì)胞；這些CTL019仍然保持對(duì)CD19+靶標(biāo)的特異性和直接殺傷能力，這至少彰顯了輸注數(shù)年后，這些細(xì)胞沒有耗竭并且仍保持功能。毒性CTL019輸注的耐受性良好。輸液反應(yīng)罕見并且溫和（等級(jí)<2），主要包括低燒和輕度寒戰(zhàn)。在CTL019輸注過程中沒有患者發(fā)生顯著不適。最常見的相關(guān)性事件是中心粒細(xì)胞減少并發(fā)癥（包括發(fā)燒）和與體內(nèi)CTL擴(kuò)增相關(guān)的遲發(fā)性CRS。有2例腫瘤溶解綜合征記錄。1例獲得緩解的患者在細(xì)胞輸注21個(gè)月后死亡，皮膚活檢顯示，傷口感染了假單胞菌引發(fā)了致命性膿瘡壞疽。細(xì)胞因子釋放綜合征和巨噬細(xì)胞活化綜合征CRS癥狀從輕微到嚴(yán)重并常有自限性。CRS癥狀包括發(fā)燒，肌肉酸痛和惡心，在嚴(yán)重的情況下會(huì)出現(xiàn)低血壓，毛細(xì)血管滲漏和缺氧。CTCAE（不良反應(yīng)通用術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)）3.0版將CRS定義為急性輸液毒性反應(yīng)，但是不能對(duì)CTL019給藥幾天后發(fā)生的遲發(fā)性CRS進(jìn)行解釋。因此我們?cè)O(shè)計(jì)了一份CRS新評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（表S4中，A和B）。此外在CRS中我們也注意到，并發(fā)血細(xì)胞減少癥，凝血功能障礙，CD163染色法病理診斷巨噬細(xì)胞高度活化，有1例患者在CRS高峰期，骨髓活檢發(fā)現(xiàn)噬血現(xiàn)象。在鐵蛋白，C-反應(yīng)蛋白（CRP）和可溶性白介素-2受體（sIL-2R）顯著升高的CRS患者中，都會(huì)出現(xiàn)巨噬細(xì)胞活化綜合征（MAS）或噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增多癥（HLH）。9例患者在CTL019輸注1~14天（平均7天）后發(fā)生CRS，包括1例1級(jí)，2例2級(jí)，2例3級(jí)和4例4級(jí)。在輸注后平均9.5天（范圍9~55天），有5例患者的CRS需要用抗細(xì)胞因子定向治療，4例患者重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)護(hù)理CRS相關(guān)的并發(fā)癥，如低血壓和缺氧，ICU護(hù)理平均6天（范圍4~9天）。圖2：qPCR檢測(cè)頭12個(gè)月CTL019的擴(kuò)增。通過qPCR檢測(cè)14例受試者基因組DNA每微克拷貝數(shù)，來衡量外周血中CTL019的擴(kuò)增。低于檢測(cè)下限值（<25拷貝數(shù)/毫克DNA）用空心圓表示（源數(shù)據(jù)，表S7）。圖圖3：擴(kuò)增高峰與應(yīng)答之間的關(guān)系。對(duì)11例受試者用流式細(xì)胞術(shù)（A）和對(duì)14例受試者用定量PCR（B）測(cè)定前3個(gè)月CTL019的擴(kuò)增高峰。未能用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)01,02,03號(hào)受試者進(jìn)行檢測(cè)，因?yàn)樵谒麄冎委熎陂g沒有可用的抗體。提供非參檢驗(yàn)P值（源數(shù)據(jù)，表S8）。之前我們?cè)赋鯝LL患者在輸注CTL019后IL-6顯著升高出現(xiàn)嚴(yán)重CRS，可用IL-6受體阻斷抗體tocilizumab迅速逆轉(zhuǎn)。在這之前，1名患者（受試者03）接受糖皮質(zhì)激素治療后成功逆轉(zhuǎn)CRS。對(duì)于后續(xù)患者，tocilizumab被納入對(duì)CLL患者嚴(yán)重CRS的處置。4例患者接受tocilizumab治療（有2名加用類固醇）后，得到迅速退燒，血壓回穩(wěn)以及巨噬細(xì)胞活化相關(guān)的生化異常（鐵蛋白和CRP）迅速改善的效果。使用tocilizumab后鐵蛋白的生化指標(biāo)列于圖S3中。CTL019擴(kuò)增的峰值與CRS的相關(guān)性，CRS與臨床應(yīng)答的相關(guān)性（P<0.05）列在圖S4中。與沒有或者輕微CRS（0~1級(jí)）患者相比，有嚴(yán)重CRS（2~4級(jí)）的患者IL-6峰值水平更高（平均峰值,269比34pg/ml;P=0.014），2~4級(jí)CRS患者的sIL-2R水平更高（平均峰值,10962比4177pg/ml;P=0.008），而血清中INF-γ和IL-2無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖5和表S11)。輸注后1個(gè)月內(nèi)的鐵蛋白（8例受試者）和CPR（5例受試者）數(shù)據(jù)有限，這阻礙了對(duì)CRS分級(jí)的權(quán)威性分析。CRS2~4級(jí)患者比CRS0~1級(jí)患者有更高峰值的鐵蛋白均值21,502比1980)和C-反應(yīng)蛋白（均值160比42)；盡管還有少數(shù)患者樣本沒有進(jìn)行詳細(xì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，但這些有限的數(shù)據(jù)表明鐵蛋白和（或）C-反應(yīng)蛋白可作為CRS活動(dòng)和對(duì)治療有應(yīng)答的生物標(biāo)志物。癥狀和患者的具體特點(diǎn)不能對(duì)CRS進(jìn)行預(yù)測(cè)，如年齡，治療史，遺傳風(fēng)險(xiǎn)和細(xì)胞劑量（表S5）.所有接受tocilizumab治療CRS的患者在輸注tocilizumab時(shí)T細(xì)胞正在持續(xù)擴(kuò)增。Tocilizumab使用后，癥狀迅速改善，盡管至少給藥2次，在給藥后的幾天T細(xì)胞擴(kuò)增達(dá)到頂峰，這表明Tocilizumab不能完全抑制T細(xì)胞的持續(xù)擴(kuò)增。因?yàn)樗谢颊哂谐志么嬖诘募?xì)胞，很顯然tocilizumab不會(huì)影響T細(xì)胞的長(zhǎng)期存活。與CRS相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)有5例患者，包括1或2級(jí)幻覺、意識(shí)模糊、高燒引發(fā)的譫妄，需ICU護(hù)理或藥物治療。出現(xiàn)1例持續(xù)2天的4度精神錯(cuò)亂，這至少與T細(xì)胞治療部分相關(guān)。B細(xì)胞再生障礙和低丙種球蛋白血癥B細(xì)胞再生障礙和低丙種球蛋白血癥比較常見。全部獲得CR的患者和2例獲得PR的患者檢測(cè)不到B細(xì)胞。對(duì)CTL019沒有應(yīng)答的患者不會(huì)出現(xiàn)B細(xì)胞再生障礙。根據(jù)免疫球蛋白水平靜脈注射足量的免疫球蛋白來處置低丙種球蛋白血癥。在最初治療的患者中B細(xì)胞再生障礙持續(xù)了4年，進(jìn)一步表明了持續(xù)存在的T細(xì)胞可保持功能。討論使用CAR改造的T細(xì)胞靶向癌癥的研究已超過20年，但在初期受限于基因改造的T細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)增能力低，持久性差。在早期報(bào)告中我們發(fā)現(xiàn)，CTL019在3例CLL患者體內(nèi)有臨床活性。我們現(xiàn)在報(bào)告入選的18例患者中，總應(yīng)答率為8/18，這些應(yīng)答是持久的，并且獲得CR的患者沒有復(fù)發(fā)。不需要進(jìn)一步治療就能持續(xù)清除惡性克隆。CTL019的高度擴(kuò)增，長(zhǎng)期的持久性以及輸注后數(shù)年的B細(xì)胞再生障礙都與應(yīng)答響應(yīng)相關(guān)。我們尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)患者或疾病進(jìn)行預(yù)先相關(guān)分析可以預(yù)測(cè)哪些患者最可能出現(xiàn)應(yīng)答反應(yīng)，盡管這項(xiàng)研究沒有涉及這項(xiàng)關(guān)聯(lián)的調(diào)查。接受治療的患者人數(shù)有限，但是獲得應(yīng)答與沒有應(yīng)答的患者在年齡，既往治療和遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素之間沒有關(guān)聯(lián)。通過測(cè)定平均熒光強(qiáng)度，應(yīng)答者與無應(yīng)答者之間的CD19的表達(dá)水平?jīng)]有差異。T細(xì)胞劑量和應(yīng)答之間沒有關(guān)聯(lián)，細(xì)胞制品也沒有顯著的特點(diǎn)可預(yù)測(cè)應(yīng)答，如表型，體外抗CD19+靶標(biāo)的活性或premanufacturing端粒長(zhǎng)度。但是我們確定T細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)增的水平和應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。另外，無應(yīng)答者的CLL細(xì)胞在體外易受到裂解，為不應(yīng)答是由于體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)增受阻這一假設(shè)提供支持。第二代CARs顯示了對(duì)CD19+淋巴瘤的強(qiáng)大活性，包括B細(xì)胞ALL，據(jù)報(bào)道成人和兒童ALL完全緩解率達(dá)66%到90%。在一些ALL患者中，CAR改造的T細(xì)胞在體內(nèi)高度擴(kuò)增，消除了大部分白血病負(fù)荷，在某些情況下能保持長(zhǎng)期的持續(xù)性功能。目前還不清楚為什么不同疾病完全緩解率不一樣。在我們機(jī)構(gòu)，ALL和CLL使用的CTL019是一樣的。本組接受治療的CLL患者年齡往往大于ALL患者，并且CLL患者和ALL患者既往治療方案也不一樣。CLL和ALL患者的自體T細(xì)胞的活性可能會(huì)不同。CLL和ALL的腫瘤微環(huán)境很可能也不一樣。CLL患者局部免疫抑制的許多機(jī)制已被確定，包括T細(xì)胞識(shí)別白血病細(xì)胞無能，微環(huán)境中免疫抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生和免疫檢查點(diǎn)過表達(dá)，這些都會(huì)減弱和阻斷免疫反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)說明使用CTL019和免疫檢查點(diǎn)抑制劑或其他方法增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤的識(shí)別很合適。圖4：獲得CR的患者CTL019細(xì)胞的持續(xù)性和功能保持。（A）輸注12個(gè)月后流式細(xì)胞術(shù)（實(shí)心圓）和qPCR（實(shí)心三角）檢測(cè)CTL019的長(zhǎng)期持續(xù)性。所得結(jié)果都高于流式細(xì)胞術(shù)限定值（0.1%）和qPCR的定量限定值（<25拷貝數(shù)/mgDNA）。（B和C）在輸注后純化患者UPCC04409-02外周血單個(gè)核細(xì)胞，與CD19APC或?qū)φ湛乖?間皮素)刺激6小時(shí)，并檢測(cè)檢查脫粒作用（CD107a）和細(xì)胞因子的表達(dá)。（B）等值線圖顯示CD8+CAR-T細(xì)胞受到表達(dá)對(duì)照抗原或CD19K562細(xì)胞刺激，CD107a相對(duì)于MIP-1b(上兩行)或IL-2相對(duì)于IFN-g的表達(dá)(最下行)。(C)隨著時(shí)間的推移，CAR19+CD8T細(xì)胞在CD19+靶細(xì)胞刺激下應(yīng)答功能的概要圖。數(shù)據(jù)來源于（B），并且去除本子集本底頻率（源數(shù)據(jù)，表S9和S10）。圖5：輸注后首月細(xì)胞因子峰值。（A到D）IL-6的峰值。(A)：IFN-γ(B)：IL-2受體拮抗劑(IL-2RA)(C)：IL-2(D)：CRS等級(jí)顯示?；疑?hào)代表無反應(yīng)；黑色符號(hào)代表取得了完全或部分緩解。個(gè)位數(shù)表示CRS反應(yīng)等級(jí)（1到4）。Wilcoxonrank-sum檢驗(yàn)P值。缺少1例4級(jí)CRS獲得CR受試者的細(xì)胞因子值（n=13）。（源數(shù)據(jù)，表S11）。與CAR-T細(xì)胞治療相關(guān)的最嚴(yán)重的毒性是CRS。CRS是全身性的炎癥反應(yīng)，由高度增殖和活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的高水平的炎性細(xì)胞因子引起。CRS可能會(huì)是溫和的有自限性的癥狀，包括發(fā)燒，肌肉痛，關(guān)節(jié)痛，食欲減退和疲勞。CRS可進(jìn)展為嚴(yán)重的致命的并發(fā)癥如高燒，低血壓，毛細(xì)血管滲漏，缺氧，血細(xì)胞減少和凝血功能障礙。腎功能不全很可能與低血壓相關(guān)。CTCAE評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)只適用于靜脈滴注毒性，對(duì)CTL019治療后產(chǎn)生的CRS不適用。我們和其他人員開發(fā)的CRS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)CAR-T治療引發(fā)的CRS產(chǎn)生的臨床參數(shù)有更好的體現(xiàn)。CRS患者的臨床與生化指標(biāo)與HLH或MAS一致。MAS臨床和生化指標(biāo)的改變會(huì)伴有噬血現(xiàn)象，彌漫性血管內(nèi)凝血和血細(xì)胞減少癥，這和我們治療ALL患者的經(jīng)歷類似。在CRS高峰期至少采集一份骨髓樣本，可以看到噬血現(xiàn)象和CD163標(biāo)記的巨噬細(xì)胞活化，鐵蛋白，CRP和sIL-2R顯著升高是MAS/HLH的標(biāo)志。2~4級(jí)CRS患者的鐵蛋白，CRP和sIL-2R峰值顯著高于0~1級(jí)CRS患者，且與嚴(yán)重CRS相關(guān)。這些改變的生化指標(biāo)是有用的診斷標(biāo)志物，但不用于確定是否對(duì)CRS進(jìn)行干預(yù)；CRS的治療只基于臨床表現(xiàn)。其他研究者也觀察到在ALL患者的CRS中CRP的升高，并指出CRP將預(yù)測(cè)CRS的進(jìn)展。雖然收集的數(shù)據(jù)有限，但它表明鐵蛋白和/或CRP可作為CRS和對(duì)治療應(yīng)答的生物標(biāo)志物，而不需要不常用的檢測(cè)方法如對(duì)IL-6水平和對(duì)CAR改造的T細(xì)胞的檢測(cè)。CAR-T細(xì)胞直接相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)不常見。在5例患者中與CRS并發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)由6項(xiàng)紀(jì)錄，包括可逆性的1或2級(jí)幻覺，精神錯(cuò)亂或與高燒相關(guān)的譫妄，一般可通過ICU護(hù)理，鎮(zhèn)靜治療或其他藥物治療。有1例患者發(fā)生3級(jí)CRS并持續(xù)了2天高燒相關(guān)的可逆性4級(jí)精神錯(cuò)亂，對(duì)其進(jìn)行了ICU護(hù)理和鎮(zhèn)靜催眠治療。在這期間對(duì)患者進(jìn)行了計(jì)算機(jī)斷層掃描，未發(fā)現(xiàn)明顯異常。在其他研究中發(fā)現(xiàn)了更嚴(yán)重的CAR-T治療相關(guān)性神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，尤其是在ALL和NHL患者中，包括嚴(yán)重遲鈍，腦病和癲癇發(fā)作。神經(jīng)毒性的病因尚不清除，但我們推測(cè)它可能與T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子水平增高有關(guān)。目前還不清楚CLL患者的毒性和ALL和NHL患者是否不同；在發(fā)生CRS的少數(shù)接受治療的患者中可發(fā)現(xiàn)有限的神經(jīng)毒性反應(yīng)。在出現(xiàn)和沒有出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患者腦脊液中可發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞，這表明CAR-T細(xì)胞不會(huì)直接造成神經(jīng)毒性。中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性也與其他T細(xì)胞增強(qiáng)治療相關(guān)，例如blinatumomab，為T細(xì)胞活化可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)這一概念提供支持。有4例患者的CRS為自限性，5例患者血流動(dòng)力學(xué)紊亂，包括低血壓和缺氧，需要進(jìn)行干預(yù)。高劑量糖皮質(zhì)激素對(duì)1例嚴(yán)重CRS患者對(duì)有效。這例患者讓人關(guān)注，雖然輸注CTL019后獲得了部分緩解，但在使用類固醇后檢測(cè)到了T細(xì)胞丟失。在治療后續(xù)的CLL患者之前，我們觀察到1例兒童ALL患者IL-6顯著升高并且發(fā)生嚴(yán)重CRS。該患者接受抗-IL-6受體拮抗劑tocilizumab治療，嚴(yán)重CRS迅速得到改善，并且T細(xì)胞沒有受到損失。因此在隨后的患者中，使用tocilizumab被納入了對(duì)CRS的處置。未來的研究可進(jìn)一步確定CRS的預(yù)測(cè)因子，tocilizumab使用的最佳時(shí)機(jī)，替代抗細(xì)胞因子療法的作用和是否可以對(duì)CRS進(jìn)行預(yù)處理。我們的數(shù)據(jù)顯示即使在使用tocilizumab癥狀改善后，T細(xì)胞依然可以擴(kuò)增，至少在一些患者中是這樣（數(shù)據(jù)未指明）。例如12號(hào)受試者，在使用tocilizumab5天后測(cè)到T細(xì)胞擴(kuò)增高峰，盡管不是每天進(jìn)行檢測(cè)。在另一個(gè)案例中（22號(hào)受試者），在tocilizumab使用當(dāng)天測(cè)到T細(xì)胞初次擴(kuò)增高峰，然后降低，在第28天再次擴(kuò)增。這2例患者都出現(xiàn)了應(yīng)答。在使用tocilizumab后這些細(xì)胞能否保持功能尚不可知。我們希望在未來能收集更多的數(shù)據(jù)來證明使用tocilizumab和其他IL-6拮抗后對(duì)T細(xì)胞增殖的后續(xù)活力的影響。目前我們數(shù)據(jù)的另一個(gè)局限就是，還不清楚預(yù)防性使用IL-6拮抗劑是否能防止CRS，以及這是否會(huì)對(duì)臨床抗腫瘤效應(yīng)產(chǎn)生不良影響。獲得CR并出現(xiàn)B細(xì)胞再生障礙和低丙種球蛋白血癥的患者，可通過靜脈注射飽和劑量的丙種球蛋白來處置。1例患者獲得緩解，在輸注21月后死于傷口假單胞菌感染引發(fā)的膿瘡壞疽并發(fā)癥。他曾接受靜脈注射免疫球蛋白來治療低丙種球蛋白血癥；目前還不清楚是B細(xì)胞再生障礙還是的丙種球蛋白血癥導(dǎo)致了他的死亡，但我們提議對(duì)所有接受CAR-T治療的低丙種球蛋白血癥患者都需要靜脈注射飽和劑量的免疫球蛋白。我們?cè)噲D找出入選的沒有經(jīng)過有效治療的高死亡風(fēng)險(xiǎn)的CLL患者。共有10名患者沒有獲得CR，在輸注后的1到10個(gè)月中疾病進(jìn)展或死亡，這為晚期和高風(fēng)險(xiǎn)患者提供了一個(gè)佐證。盡管出現(xiàn)了許多令人振奮的治療CLL新藥，但能出現(xiàn)完全應(yīng)答的很少見，并且會(huì)如預(yù)期一樣進(jìn)入進(jìn)展期；對(duì)新的更有效的療法有迫切的需求。值得注意的是，我們的數(shù)據(jù)顯示，一些患者通過一次CTL019治療便可獲得深度持續(xù)性緩解。是否可以利用CTL019治療更早期的腫瘤患者，或CTL019聯(lián)合其他療法如免疫調(diào)節(jié)，來提高臨床應(yīng)答和遠(yuǎn)期療效仍待待確定。細(xì)胞長(zhǎng)期可持續(xù)性能否超過4年尚不清楚；長(zhǎng)期隨訪的患者數(shù)量有限，并且我們不清楚如果CTL019消失會(huì)不會(huì)引起CLL復(fù)發(fā)。從我們治療CLL和ALL經(jīng)驗(yàn)來看，T細(xì)胞的持久性和白血病的無病生存率呈正相關(guān)。最終，我們需要更多的長(zhǎng)期隨訪的患者來確定是否CTL019可以完全消除CLL，CAR-T細(xì)胞能否被不同的方法消除。這一方法的局限是需要從經(jīng)過多次治療的患者身上采集足夠量的T細(xì)胞，并且要花費(fèi)2~3周來制備CTL019。在此期間患者必須保持臨床穩(wěn)定以便接受治療，并且如圖S1高亮標(biāo)出，有些患者想要接受治療但卻不合適這種療法。在一部分患者中CTL019清除白血病克隆的能力表示達(dá)到深度緩解，這使CTL019有別于其他靶向藥物如ibrutinib和idelalisib，MRD的根除只出現(xiàn)在異基因造血干細(xì)胞移植后，說明這可能是治療白血病的唯一方式，盡管非復(fù)發(fā)死亡率還很高。CTL019能否最終治愈CLL還要通過更久的隨訪來判斷。CTL019治療CLL的劑量?jī)?yōu)化研究正在進(jìn)行，繼續(xù)研究來明確產(chǎn)生應(yīng)答的機(jī)制也很有必要。材料和方法研究的設(shè)計(jì)與監(jiān)管成人年滿18周歲，至少經(jīng)過2次治療方案后失敗的復(fù)發(fā)性或難治性CD19+CLL患者；最后一次二線化療和進(jìn)展之間不超過2年，不適合或主動(dòng)放棄異基因造血干細(xì)胞移植。如果之前的治療方案中沒有獲得CR或者治療后不足2年疾病進(jìn)展，17p染色體缺失或TP53突變的高?；颊咭嗫扇脒x。腫瘤重新分期后，單采收集外周血T細(xì)胞用于制備CTL019。受試者均給予一個(gè)療程的常規(guī)化療進(jìn)行淋巴細(xì)胞刪除，在細(xì)胞輸注前4天完成。淋巴細(xì)胞刪除性化療包括CLL常規(guī)治療方案和主治醫(yī)師自行選擇方案。這項(xiàng)試驗(yàn)的主要目的是確定治療的安全性和從分離患者血液制備CTL019的可行性。次要目的包括評(píng)價(jià)輸注的基因修飾的T細(xì)胞功能和持久性，應(yīng)答率，患者生存率和其他相關(guān)點(diǎn)。該方案通過賓夕法尼亞大學(xué)倫理審查委員會(huì)，美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）和重組DNA咨詢委員會(huì)批準(zhǔn)，并在FDA批準(zhǔn)的新藥研究申請(qǐng)下進(jìn)行。按照赫爾辛基宣言所有患者給予知情同意。這項(xiàng)研究已在ClinicalT上注冊(cè)(標(biāo)識(shí)號(hào)NCT01029366)。隨訪截止2014年12月31號(hào)。所有作者討論解釋了研究結(jié)果，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了證實(shí)和分析。所有圖的源數(shù)據(jù)補(bǔ)充材料可提供(表S6到S11)。載體生產(chǎn)CD19-BB-ζ轉(zhuǎn)基因(GeMCRIS0607-793)的設(shè)計(jì)與構(gòu)造已作介紹。慢病毒載體按照目前Lentigen公司或費(fèi)城兒童醫(yī)院三質(zhì)粒制作方法的生產(chǎn)程序制備。T細(xì)胞采集和CTL019細(xì)胞代數(shù)通過白細(xì)胞分離收集自體T細(xì)胞，通過CD3和CD28單抗磁珠刺激T細(xì)胞。用抗-CD19scFv連接4-1BB和CD3-ζ信號(hào)域的慢病毒載體轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，并在體外擴(kuò)增10~12天。平均轉(zhuǎn)染效率20.1%（范圍4.7%到39.2%）。產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)之前已介紹。應(yīng)答評(píng)估在方案設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)，并基于國際研討會(huì)CLL組客觀影像學(xué)評(píng)價(jià)療效標(biāo)準(zhǔn)，完成疾病反應(yīng)的評(píng)估。此外用深度測(cè)序分析進(jìn)行MRD研究性評(píng)估。相關(guān)性研究如上所述，進(jìn)行了樣本處理，流式細(xì)胞術(shù)，細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體分析，qPCR分析。此外還進(jìn)行了以下研究。免疫球蛋白重鏈重排的下一代測(cè)序。利用iPrep(Invitrogen)從制備的細(xì)胞產(chǎn)品和輸注后外周血中提取基因組DNA。對(duì)IGH位點(diǎn)的第三互補(bǔ)決定區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，并利用特異性引物和插入基因片段進(jìn)行深度測(cè)序(AdaptiveBiotechnologies)。利用免疫組化SEQ對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行審查。每例患者的白血病克隆經(jīng)過基準(zhǔn)校正，并通過隨訪患者的骨髓和外周血樣本來評(píng)估白血病克隆對(duì)CTL019的應(yīng)答。每個(gè)樣本檢測(cè)值都建立統(tǒng)一獨(dú)立的編碼，并對(duì)每個(gè)樣本白血病克隆頻率進(jìn)行計(jì)算。IGHV突變狀態(tài)。在輸注CTL019之前，收集外周血提取基因組DNA，用來評(píng)估IGHV位點(diǎn)的突變狀態(tài)(CancerGenetics公司)。多色流式細(xì)胞術(shù)抗體。購買使用對(duì)應(yīng)下列抗原的抗體：(i)購自eBioscience：CD3異硫氰酸熒光素（FITC），CD8藻紅蛋白（PE）和花青5.5PE（Cy5.5PE），CD14Cy7PE，CD16Cy7PE，CD5別藻藍(lán)蛋白（APC），CD19Cy7PE和APC,CD20FITC,CD45PE,CD10Cy7PE,CD34Cy7PE,andTNF–αAlexaFluor700；(ii)購自BioLegend：CD4亮紫羅蘭色605(BV605)和BV785,CD8Cy5PE,D45ROBV570以及IFN-γBV570；(iii)購自BectonDickinson：CD14V500,CD3BV605,IL-2CF594PE,CD107aCy5PE,粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子BV421以及巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)–1bPE；(iv)購自BeckmanCoulter：CD27Cy7PE;(v)購自R&Dsystems：MIP-1aFITC。用AlexaFluor47–conjugatedmAb來檢測(cè)CAR19分子已作介紹。研究中所有用到的抗體在使用前都進(jìn)行了滴定。如前所述，CTL019的擴(kuò)增與持久性和CLL細(xì)胞的例行評(píng)估，都是用4色6參數(shù)的AccuriC6流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。CTL019抗-CD19活性。為評(píng)估對(duì)CD19+靶細(xì)胞的響應(yīng)，將輸注的制品和輸注后的樣品分別加入含有莫能菌素，布雷菲德菌素A和抗-CD107aCy5PE單抗的表達(dá)CD19+的K562細(xì)胞中，在37℃下孵育