植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)與設(shè)施

關(guān)于植物組織培養(yǎng)的基本技術(shù)與設(shè)施第一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

外植體（Explants）：指植物離體培養(yǎng)的各種接種材料，包括植物體的各種器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體。一、外植體的選擇外植體的選擇依據(jù)優(yōu)良的種質(zhì)健壯的植株大小適宜的外植體適宜的發(fā)育時(shí)期適宜的部位適宜生理狀態(tài)和發(fā)育年齡的器官細(xì)胞培養(yǎng)材料的選擇第二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

（二）外植體滅菌的一般步驟

二、外植體的滅菌（一）常用滅菌劑的使用及其效果（三）各種外植體的滅菌方法第三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（一）常用消毒劑消毒劑使用濃度（％）去除的難易消毒時(shí)間（分）效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過(guò)氧化氫升汞酒精抗菌素硝酸銀9～102飽和溶液1～210～120.1～170～754～5（mg/L）1易易易易最易較難易中較難5~305~305~302~105~152~100.2~230~605~30很好很好很好很好好最好好較好好自:曹孜義第四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（二）外植體滅菌的一般步驟3.將適當(dāng)濃度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸鈉)(含有幾滴活化劑Tween20或Tween80)，使材料完全浸沒(méi)在消毒液中，蓋上蓋，把玻璃瓶置入超凈工作臺(tái)滅菌一定時(shí)間。在滅菌期間須把玻璃瓶搖動(dòng)2～3次。

4．消毒處理后，將瓶蓋打開(kāi)，將消毒液倒出，注入適量的無(wú)菌蒸餾水，再蓋上蓋，搖動(dòng)數(shù)次，將水倒掉，重復(fù)3～4次。1．預(yù)處理，先對(duì)植物組織進(jìn)行修整，去掉不需要的部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料在流水中沖洗干凈。經(jīng)過(guò)預(yù)處理的植物材料，其表面仍有很多細(xì)菌和真菌。

2．將植物組織塊置于一個(gè)有絲蓋的玻璃瓶中，注入75%的酒精溶液埋沒(méi)材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用無(wú)菌水沖洗一次。第五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

1、莖尖、莖段及葉片等的消毒消毒前要經(jīng)自來(lái)水較長(zhǎng)時(shí)間的沖洗。消毒時(shí)要用70%的酒精浸泡數(shù)秒，無(wú)菌水沖洗2～3次，然后用2%～10%的次氯酸鈉溶液浸泡10～25min，若材料有茸毛最好在消毒液中加入幾滴吐溫-80，或者用0.1％～0.2％升汞浸泡消毒5～10分鐘消毒后，用無(wú)菌水沖洗3次后方可接種。2、果實(shí)及種子的消毒用自來(lái)水沖洗10～20分鐘或更長(zhǎng)，用純酒精迅速漂洗一下。果實(shí)用2%次氯酸鈉溶液浸10min后，用無(wú)菌水沖洗2～3次。種子要先用10%次氯酸鈉浸泡20～30min甚至幾小時(shí)。對(duì)難以消毒的還可用0.l%升汞或1%～2%溴水消毒5min。胚或胚乳培養(yǎng)時(shí)，對(duì)種皮太硬的種子，可先去掉種皮，再用4%～10%的次氯酸鈉溶液浸泡8～10min，經(jīng)無(wú)菌水沖洗后，即可取出接種。（三）幾種外植體的滅菌方法第六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

70％酒精擦洗花蕾，或浸泡數(shù)秒鐘飽和漂白粉上清液：浸泡10分鐘；或次氯酸鈉液2％～5％：8～10分鐘無(wú)菌水沖洗幾次后，吸去水分，剝?nèi)』ㄋ幓蚺咧榻臃N。3、花藥的消毒第七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

預(yù)先用自來(lái)水洗滌，再用軟毛刷刷洗，且用刀切去損傷及污染嚴(yán)重部位，吸水紙吸干后，再用酒精漂洗?？刹捎?.1%～0.2%升汞浸5～10min或2%次氯酸鈉溶液浸10～15min，然后以無(wú)菌水沖洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干后可接種。

4、根及地下部器官的消毒第八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

三、外植體的接種和培養(yǎng)

（一）無(wú)菌操作（二）外植體的培養(yǎng)第九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

植物組織培養(yǎng)的接種：把經(jīng)過(guò)表面消毒后的植物材料切碎或分離出器官、組織細(xì)胞，并把它們轉(zhuǎn)放到無(wú)菌培養(yǎng)基上的全部操作過(guò)程，是一種無(wú)菌技術(shù)。在操作過(guò)程中引起的污染來(lái)源：主要是由材料本身帶菌和工作人員本身引起的。

（一）無(wú)菌操作第十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

污染的主要來(lái)源是空氣中的細(xì)菌和真菌孢子每次接種前半小時(shí)地面：用70％酒精噴霧使空氣的灰塵沉降。紫外線燈照射20分鐘。工作臺(tái)面要用新潔爾滅或酒精擦洗。

1、接種室的消毒第十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

入無(wú)菌室前，要洗手。l%新潔爾滅溶液內(nèi)5分鐘入室時(shí)要穿上經(jīng)過(guò)消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要經(jīng)常用酒精擦洗手。不準(zhǔn)講話，以免微生物污染材料、培養(yǎng)基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。必須在酒精燈火焰處進(jìn)行操作，如打開(kāi)瓶口，轉(zhuǎn)接材料。蓋瓶蓋前應(yīng)將瓶口在火焰上燒一下，再將蓋子也在火焰上燒一下，然后蓋上。2、工作人員要求第十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

切取和接種較大的材料肉眼觀察即可操作分離，較小的材料需在雙筒解剖鏡下操作。分離工具一定要放好，切割動(dòng)作要快，防止擠壓使材料損傷而失敗。

接種時(shí)要防止交叉污染的發(fā)生3、材料的切取第十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日酒精擦拭手外植體消毒浸泡5min器械消毒酒精燈灼燒4、接種的具體操作第十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日旋轉(zhuǎn)灼燒取外植體接種蓋好瓶塞第十五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

1、培養(yǎng)條件：

溫度：常保持在23±2℃，夜溫低1—2℃

光照時(shí)數(shù)：大多數(shù)情況下為16h（暗培養(yǎng)不需要光照，例如起始培養(yǎng)的前幾天不需要光照）

光照強(qiáng)度：1000—3000lx，白色熒光燈，光的作用是滿足形態(tài)建成的需要（誘導(dǎo)）

相對(duì)濕度：培養(yǎng)室的相對(duì)濕度一般不控制。根據(jù)需要適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)間濕度（二）外植體培養(yǎng)第十六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

接種后3～7天內(nèi)，主要是檢查其污染情況。增殖、繼代培養(yǎng)，建立了無(wú)菌培養(yǎng)系。細(xì)胞學(xué)觀察：一般每隔3～5天觀察一次。及時(shí)記錄。觀察方法根據(jù)培養(yǎng)方式靈活掌握：可用顯微鏡進(jìn)行定點(diǎn)觀察如平板培養(yǎng)可用倒置顯微鏡觀察如液體培養(yǎng)2、定期檢查和細(xì)胞學(xué)觀察第十七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

1．外植體先形成愈傷組織，再分化成完整的植株。四、外植體的成苗途徑2．胚狀體發(fā)生3．外植體經(jīng)誘導(dǎo)后直接形成根與芽，發(fā)育成完整的植株4．原球莖型---圖片第十八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日石斛蘭的原球莖第十九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日外植體愈傷組織

根、芽芽根根芽胚狀體根、芽試管苗外植體的成苗途徑第二十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

不定芽形成---多細(xì)胞參與胚狀體形成過(guò)程--單細(xì)胞參與體細(xì)胞胚的發(fā)育過(guò)程第二十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

低CTK/IAA外植體愈傷組織芽根脫分化再分化低CTK/IAA根

完整植株生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)控制器官分化的模式芽高CTK/IAA低CTK/IAA第二十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日五、污染的原因及其預(yù)防措施

污染

概念：是指在組織培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。原因：細(xì)菌菌斑呈黏液狀物。除材料帶菌或培養(yǎng)基滅菌不徹底會(huì)造成成批接種材料被細(xì)菌污染外，操作人員的不慎也是造成細(xì)菌污染的重要原因。因此接種人員的手應(yīng)經(jīng)常用70％酒精擦凈，鑷子和接種針在使用前必須在火焰上燒紅。真菌污染部分長(zhǎng)有不同顏色的霉菌，在接種后3～10d才能發(fā)現(xiàn)，造成真菌污染的原因多為周圍環(huán)境的不清潔、超凈工作臺(tái)的過(guò)濾裝置失效、培養(yǎng)瓶的口徑過(guò)大、操作不慎等途徑：

外植體帶菌；培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底；操作人員未遵守操作規(guī)程等。第二十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

防止材料帶菌的措施

用莖尖作外植體時(shí)，可在室內(nèi)或無(wú)菌條件下對(duì)枝條先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。避免陰雨天在田間采取外植體。對(duì)于材料內(nèi)部污染的材料采取特殊方法。

外植體的滅菌

多次滅菌法多種藥液交替浸泡法金屬器械的滅菌一般用火焰滅菌法，即把金屬器械放在95％的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃燒滅菌。這一步驟應(yīng)當(dāng)在無(wú)菌操作過(guò)程中反復(fù)進(jìn)行。金屬器械也可以用干熱滅菌法滅菌，即將拭凈或烘干的金屬器械用紙包好，盛在金屬盒內(nèi)，放在烘箱中滅菌。布質(zhì)制品的滅菌:工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品均用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的布質(zhì)品，放入高壓滅菌器中，在壓力為108kPa，溫度為121℃的情況下，滅菌20～30min無(wú)菌操作室的滅菌:

無(wú)菌操作室的地面、墻壁和工作臺(tái)的滅菌可用2％的新潔爾滅或70％的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20min。使用前用70％的酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期一二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。操作人員

污染的預(yù)防措施第二十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日六、外植體的褐變及其防止措施

（一）褐變的原因

1.基因型

2.外植體的生理狀態(tài)

3.培養(yǎng)基的成分無(wú)機(jī)鹽濃度；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)；外植體脫分化條件；轉(zhuǎn)移時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

（二）褐變的防止措施

1.選擇適宜的外植體2.最佳培養(yǎng)基3.連續(xù)轉(zhuǎn)移

4.加抗氧化劑5.活性炭

第二十五頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日七、培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預(yù)防措施

（一）玻璃化現(xiàn)象葉、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小腫脹，失綠，葉片皺縮成縱向卷曲，脆弱易碎；葉表皮缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒(méi)有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織；體內(nèi)含水量高，但干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素含量低。第二十六頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

激素濃度激素濃度增加尤其是細(xì)胞分裂素濃度提高（或細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比例高)。瓊脂濃度瓊脂濃度低時(shí)玻璃化苗比例增加，水浸狀嚴(yán)重。溫度：適宜的溫度可以使試管苗生長(zhǎng)良好。光照時(shí)間多數(shù)植物在10～12h光照下都生長(zhǎng)良好，大于15h時(shí)，玻璃化苗明顯增加。通風(fēng)條件愈傷組織和試管苗生長(zhǎng)越快，越容易形成玻璃化苗。愈傷組織和試管苗長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，不能及時(shí)轉(zhuǎn)移，容易出現(xiàn)玻璃化苗。組織培養(yǎng)所用瓶蓋棉塞、濾紙、封口紙、牛皮紙通氣較好，玻璃化苗的比例較低。離子水平培養(yǎng)基中離子種類及其比例不適宜該種植物，玻璃化苗的比例就會(huì)增加。

（二）產(chǎn)生玻璃化苗的因素第二十七頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

適當(dāng)控制培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分；適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度；適當(dāng)降低細(xì)胞分裂素和赤霉素的濃度；增加自然光照，控制光照時(shí)間；控制好溫度；改善培養(yǎng)器皿的氣體交換狀況在培養(yǎng)基中添加其他物質(zhì)，加入間苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地減輕或防治試管苗玻璃化。如添加馬鈴薯汁液法可降低油菜玻璃苗的產(chǎn)生頻率；0.5mg／L多效唑或10mg／L的矮壯素可減少重瓣絲石竹試管苗玻璃化的發(fā)生；1.5～2.5g/L的聚乙烯醇防治蘋果砧木玻璃化。加入0.3％的活性炭還可降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率。（三）預(yù)防措施第二十八頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

試管苗的特點(diǎn)試管苗的馴化試管苗的移栽提高試管苗移栽成活率的途徑

八、試管苗的馴化與移栽第二十九頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（一）、試管苗的特點(diǎn)

試管苗的生態(tài)環(huán)境高溫且恒溫；高濕；弱光；無(wú)菌。試管苗的特點(diǎn)

試管苗生長(zhǎng)細(xì)弱，莖、葉表面角質(zhì)層不發(fā)達(dá)；試管苗莖、葉雖呈綠色，但葉綠體的光合作用較差；試管苗的葉片氣孔數(shù)目少，活性差；試管苗根的吸收功能弱。

試管苗和普通苗的根解剖比較藍(lán)莓第三十頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（二）、試管苗的馴化

馴化的目的:在于提高試管苗對(duì)外界環(huán)境條件的適應(yīng)性，提高其光合作用的能力，促使試管苗健壯，最終達(dá)到提高試管苗的移栽成活率。馴化的原則：應(yīng)從溫度、濕度、光照及有無(wú)菌態(tài)等環(huán)境要素進(jìn)行，馴化開(kāi)始數(shù)天內(nèi)，應(yīng)和培養(yǎng)時(shí)的環(huán)境條件相似；馴化后期，則要與預(yù)計(jì)的栽培條件相似，從而達(dá)到逐步適應(yīng)的目的。馴化的方法:煉苗由培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到半遮蔭的自然光下鍛煉，在自然光下恢復(fù)植物體內(nèi)葉綠體的光合作用能力和健壯度打開(kāi)瓶蓋注入少量自來(lái)水使幼苗逐漸降低溫度，轉(zhuǎn)向有菌，這樣幼苗周圍的環(huán)境就會(huì)逐步與自然環(huán)境相似。

第三十一頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

試管苗的馴化第三十二頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（三）、試管苗的移栽

常規(guī)移栽法直接移栽法嫁接移栽法指選取生長(zhǎng)良好的同一植物的實(shí)生苗或幼苗作砧木，用試管苗作接穗進(jìn)行嫁接的方法。第三十三頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日（四）、提高試管苗移栽成活率的途徑

試管苗的生理狀況植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)無(wú)機(jī)鹽濃度活性炭環(huán)境因子移栽過(guò)程中試管苗從無(wú)菌向有菌逐漸過(guò)渡第三十四頁(yè)，共四十九頁(yè)，2022年，8月28日

1．進(jìn)行植物組織培養(yǎng)需要哪些設(shè)備？各有何作用?2．植物組織培養(yǎng)主要包括哪些環(huán)節(jié)?各環(huán)節(jié)的主要工作內(nèi)容是什么?3．培養(yǎng)基包括哪些基本成分?其作用是什么?如何配制?4．如何對(duì)外植體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)器皿、接種器械進(jìn)行滅菌？

5．離體培