RNAi技術(shù)及其應(yīng)用課件

現(xiàn)在幾乎每天都會(huì)有文章對(duì)各種小RNA與機(jī)體發(fā)育之間關(guān)系的進(jìn)展進(jìn)行報(bào)道。而精明的生物技術(shù)公司也正在以驚人的速度積極地將RNAi的相關(guān)知識(shí)運(yùn)用于藥物篩選研究。借助現(xiàn)現(xiàn)在幾乎每天都會(huì)有文章對(duì)各種小RNA與機(jī)體發(fā)育之間關(guān)系的進(jìn)展1今先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)，人們鑒定出了多種新型小RNA，而隨后，它們的強(qiáng)大功能將會(huì)繼續(xù)吸引我們研究下去，相信研究結(jié)果一定會(huì)讓我們感到驚喜。

雙鏈RNA能夠以序列特異性今先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)，人們鑒定出了多種新型小RNA，而隨后，它們2的方式導(dǎo)致基因沉默的機(jī)制自發(fā)現(xiàn)起就對(duì)生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大影響，它揭示了人們以前未曾注意到的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。這種機(jī)制被稱為RNA干擾（RNAi）或者RNA沉默的方式導(dǎo)致基因沉默的機(jī)制自發(fā)現(xiàn)起就對(duì)生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大影3（RNAsilencing）。其核心內(nèi)容是：一些非編碼小RNA分子（smallnon-codingRNA，20~30nt）進(jìn)入細(xì)胞后與序列互補(bǔ)的信使RNA靶標(biāo)配（RNAsilencing）。其核心內(nèi)容是：一些非編碼小RN4對(duì)，阻止其表達(dá)。2019年9月，《自然》首次刊登了美國(guó)科學(xué)家AndrewZ.Fire與llo等人撰寫的關(guān)于RNA干擾的成果文章。時(shí)隔不久，RNAi技術(shù)取得了非凡對(duì)，阻止其表達(dá)。2019年9月，《自然》首次刊登了美國(guó)科學(xué)家5的成就。人們逐漸意識(shí)到，RNAi將會(huì)對(duì)生物學(xué)的發(fā)展帶來(lái)深遠(yuǎn)的影響。毫無(wú)疑問(wèn)，打開了RNAi這一潘多拉盒子的AndrewFire與CraigMello獲得了200的成就。人們逐漸意識(shí)到，RNAi將會(huì)對(duì)生物學(xué)的發(fā)展帶來(lái)深遠(yuǎn)的66年的生理學(xué)或醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。諾貝爾委員會(huì)成員GoranHansson在該年的頒獎(jiǎng)詞中說(shuō)道：“RNAi為我們了解生命提供了新視角，并為醫(yī)學(xué)發(fā)展提供了新工具?！辈贿^(guò)6年的生理學(xué)或醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。諾貝爾委員會(huì)成員GoranHan7，RNAi的故事才剛剛開始，許多懸念有待人們逐個(gè)解開。

細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的長(zhǎng)dsRNA或外源性長(zhǎng)dsRNA（可以是由正鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配對(duì)而成的結(jié)構(gòu)，也可以，RNAi的故事才剛剛開始，許多懸念有待人們逐個(gè)解開。

細(xì)胞8是ssRNA內(nèi)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)）在Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的雙鏈解開，其中一條鏈被優(yōu)先裝載入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）中；裝載了小RNA是ssRNA內(nèi)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)）在Dicer酶的作用下降解成小9的RISC復(fù)合物就會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積極地“搜索”轉(zhuǎn)錄組，探尋潛在的RNA靶分子。被裝載入RISC復(fù)合物當(dāng)中的向?qū)ф湥╣uidestrand）--ssRNA隨后引導(dǎo)RI的RISC復(fù)合物就會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積極地“搜索”轉(zhuǎn)錄組，探尋潛在的10SC復(fù)合物當(dāng)中的核酸內(nèi)切酶（有時(shí)被稱作“切割機(jī)”，現(xiàn)在人們知道它是Argonaute蛋白）反復(fù)剪切擁有向?qū)ф溚葱蛄械膍RNA靶分子。向?qū)ф溇褪峭ㄟ^(guò)這種方式來(lái)發(fā)SC復(fù)合物當(dāng)中的核酸內(nèi)切酶（有時(shí)被稱作“切割機(jī)”，現(xiàn)在人們知11揮特異性的RNAi作用的；

盡管不同生物體內(nèi)，參與RNAi途徑的蛋白和相關(guān)機(jī)制各有不同，但是它們的干擾策略卻驚人地一致。在所有被研究過(guò)的物種中，RNAi都揮特異性的RNAi作用的；

盡管不同生物體內(nèi)，參與RNAi12包含兩種主要的組成成分，即決定干擾特異性的小RNA和發(fā)揮抑制作用的Argonaute蛋白。

根據(jù)RISC復(fù)合物中Argonaute蛋白的天然活性以及小RNA與包含兩種主要的組成成分，即決定干擾特異性的小RNA和發(fā)揮抑制13其靶標(biāo)mRNA之間互補(bǔ)程度的不同，RISC復(fù)合物與靶標(biāo)mRNA結(jié)合后會(huì)發(fā)揮幾種不同的作用，它可以控制mRNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)合成、維持基因組完整性，或產(chǎn)生一系列其靶標(biāo)mRNA之間互補(bǔ)程度的不同，RISC復(fù)合物與靶標(biāo)mRN14特異性的小RNA。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)以及生物信息學(xué)的不斷進(jìn)步，科研人員得以對(duì)小RNA的起源及其靶向機(jī)制開展更深入的研究。他們發(fā)現(xiàn)，在各個(gè)不同的物種當(dāng)中，R特異性的小RNA。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)以及生物信息學(xué)的不15NAi系統(tǒng)獲得了不同程度的改進(jìn)，包括進(jìn)化出“內(nèi)置式的”分子“刻度尺”，用來(lái)控制小RNA的大小和結(jié)構(gòu)，從而挑選出小dsRNA中最合適的那條單鏈分子進(jìn)入下一步驟；或NAi系統(tǒng)獲得了不同程度的改進(jìn)，包括進(jìn)化出“內(nèi)置式的”分子“16進(jìn)化出防止“脫靶”現(xiàn)象出現(xiàn)的機(jī)制等等。

科研人員還發(fā)現(xiàn)RNAi通路的活性會(huì)在各個(gè)水平（從小RNA的生成到RISC復(fù)合物的沉默模式）受到嚴(yán)密調(diào)控。

各種不同的進(jìn)化出防止“脫靶”現(xiàn)象出現(xiàn)的機(jī)制等等。

科研人員還發(fā)現(xiàn)RNA17RNA沉默途徑之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，比如黑腹果蠅中的endo-siRNA和miRNA之間就相互競(jìng)爭(zhēng)LOQS。這種競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制就是RNAi途徑中決定每一個(gè)階段里如何發(fā)生調(diào)RNA沉默途徑之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，比如黑腹果蠅中的endo-s18控的關(guān)鍵步驟。很多植物和動(dòng)物病毒都會(huì)編碼抑制蛋白來(lái)抑制宿主細(xì)胞的RNAi途徑，使得這些調(diào)控機(jī)制無(wú)法在各個(gè)不同階段發(fā)揮正常作用。細(xì)胞的蛋白質(zhì)同樣也能夠調(diào)控RNAi控的關(guān)鍵步驟。很多植物和動(dòng)物病毒都會(huì)編碼抑制蛋白來(lái)抑制宿主細(xì)19。比如，在人體胚胎細(xì)胞中，miRNAlet-7分子（一種抑癌分子，同時(shí)也是一種細(xì)胞周期調(diào)控分子）的生成過(guò)程就是一條轉(zhuǎn)錄后被抑制的過(guò)程，該途徑被多潛能因子LIN2。比如，在人體胚胎細(xì)胞中，miRNAlet-7分子（一種抑癌208所抑制。LIN28蛋白可以阻止pri-let-7分子在微處理器復(fù)合物中的剪切過(guò)程及后續(xù)由Dicer蛋白負(fù)責(zé)的pre-let-7前體分子的處理過(guò)程。不過(guò)，人體同8所抑制。LIN28蛋白可以阻止pri-let-7分子在微處21時(shí)存在另一條路徑。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）和生長(zhǎng)因子家族中的骨形成蛋白（BMP）都能促進(jìn)miR-21這種促癌分子的生成。這是因?yàn)檫@些蛋白能夠促進(jìn)DROSHA時(shí)存在另一條路徑。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）和生長(zhǎng)因子家族22將pri-miR-21轉(zhuǎn)化成pre-miR-21。更確切地說(shuō)，SMAD蛋白家族成員TGF-β和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)換因子與RNA解旋酶p68組成的復(fù)合物一起被招募至pr將pri-miR-21轉(zhuǎn)化成pre-miR-21。更確切地說(shuō)23i-miR-21，促進(jìn)pre-miRNA形成。另外，不均一核糖核酸RNPA1蛋白（heterogeneousnuclearRNPA1，hnRNPA1）這種著名的i-miR-21，促進(jìn)pre-miRNA形成。另外，不均一核24前體mRNA分子剪切調(diào)控因子也會(huì)幫助DROSHA發(fā)揮作用，有效地生成pre-miR-18，這可能是由hnRNPA1蛋白能夠重新折疊發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或者直接與pri-m前體mRNA分子剪切調(diào)控因子也會(huì)幫助DROSHA發(fā)揮作用，有25iRNA結(jié)合，為DROSHA構(gòu)建出一個(gè)酶切位點(diǎn)而造成的。這也說(shuō)明在pri-miRNA分子中，某些發(fā)夾結(jié)構(gòu)可能是在pri-miRNA分子與RNA伴侶蛋白結(jié)合之后才iRNA結(jié)合，為DROSHA構(gòu)建出一個(gè)酶切位點(diǎn)而造成的。這也26會(huì)形成并被剪切的。

RISC復(fù)合體的活性同樣能夠被調(diào)控。在擬南芥中，非編碼基因IPS1中含有的一段基序能夠與miR-399序列互補(bǔ)，但是它們之間的互補(bǔ)配對(duì)過(guò)程會(huì)形成并被剪切的。

RISC復(fù)合體的活性同樣能夠被調(diào)控。在擬27卻被該miRNA分子中酶切位點(diǎn)處的一段錯(cuò)配形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)給破壞了。這樣，IPS1基因的mRNA產(chǎn)物不僅沒(méi)能被miR-399降解，反而還大量“扣押了”miR-39卻被該miRNA分子中酶切位點(diǎn)處的一段錯(cuò)配形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)給破289分子。因此，如果IPS1基因大量表達(dá)會(huì)使得胞內(nèi)“積聚”大量miR-399分子的靶標(biāo)--PHO2基因mRNA。這種靶標(biāo)之間的相似性會(huì)給RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)帶來(lái)不可預(yù)料9分子。因此，如果IPS1基因大量表達(dá)會(huì)使得胞內(nèi)“積聚”大量29的復(fù)雜性。我們預(yù)測(cè)，最近在人體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的大量mRNA樣非編碼RNA分子（mRNA-likenon-codingRNA）可能會(huì)在小RNA-Argonaute蛋白的復(fù)雜性。我們預(yù)測(cè)，最近在人體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的大量mRNA樣非編30復(fù)合體調(diào)控過(guò)程中起到“減速器（attenuator）”的作用。

RNAi機(jī)制中最引人注目的亮點(diǎn)就是僅由20~30nt組成的小dsRNA。它們是由RNaseII復(fù)合體調(diào)控過(guò)程中起到“減速器（attenuator）”的作用31I酶（可以是Dicer單獨(dú)發(fā)揮作用，也可以是Drosha和Dicer共同發(fā)揮作用）剪切長(zhǎng)RNA得到的產(chǎn)物。按照小RNA的來(lái)源前體的不同，我們可以將其分為兩大類：I酶（可以是Dicer單獨(dú)發(fā)揮作用，也可以是Drosha和D32一是小干擾RNA（siRNA），它是細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)病毒感染或者其它人工導(dǎo)入分子而剪切外源性長(zhǎng)dsRNA前體而生成；二是miRNA，它由細(xì)胞運(yùn)用其自身基因組編碼的莖一是小干擾RNA（siRNA），它是細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)病毒感染或者33環(huán)結(jié)構(gòu)加工而來(lái)。借助高通量測(cè)序技術(shù)，人們發(fā)現(xiàn)了好幾種內(nèi)源性小RNA，包括最近發(fā)現(xiàn)的PIWI相互作用RNA（PIWI-interactingRNA,piRNA）和環(huán)結(jié)構(gòu)加工而來(lái)。借助高通量測(cè)序技術(shù)，人們發(fā)現(xiàn)了好幾種內(nèi)源性小34內(nèi)源性siRNA（esiRNA）。

不過(guò)，這些小RNA子都有一個(gè)共同的特征，那就是它們都能與Argonaute蛋白相結(jié)合，從而發(fā)揮它們的靶向作用。

簡(jiǎn)述內(nèi)源性siRNA（esiRNA）。

不過(guò)，這些小RNA子都有35小RNA分子的形成過(guò)程以及RNA沉默的機(jī)制

a、能夠形成dsRNA結(jié)構(gòu)或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)的天然轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是形成小RNA分子的前體物質(zhì)。這些雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA分子經(jīng)由Dr小RNA分子的形成過(guò)程以及RNA沉默的機(jī)制

a、能夠形成ds36osha或Dicer等RNaseIII處理之后就能得到小dsRNA分子。如果這些小dsRNA分子之間的配對(duì)情況非常好，如圖中左側(cè)所示，那么就會(huì)經(jīng)由Argonauosha或Dicer等RNaseIII處理之后就能得到小ds37te蛋白的酶切活性進(jìn)行進(jìn)一步處理，生成小ssRNA產(chǎn)物。如果像圖中右側(cè)所示的那樣，小dsRNA分子之間的配對(duì)情況不是非常好，比如出現(xiàn)了錯(cuò)配或者有環(huán)狀凸出，那么它te蛋白的酶切活性進(jìn)行進(jìn)一步處理，生成小ssRNA產(chǎn)物。如果38們就不能被Argonaute蛋白酶切處理，只能經(jīng)由一種不依賴酶切活性的方式生成最終的小ssRNA產(chǎn)物。目前，我們對(duì)于究竟是哪種蛋白參與其中來(lái)發(fā)揮解鏈活性還不得而們就不能被Argonaute蛋白酶切處理，只能經(jīng)由一種不依賴39知。生成的小ssRNA分子隨后會(huì)與Argonaute蛋白結(jié)合，但究竟是哪一條單鏈分子（正鏈或負(fù)鏈）結(jié)合到Argonaute蛋白上則取決于它們的熱力學(xué)穩(wěn)定性。結(jié)合知。生成的小ssRNA分子隨后會(huì)與Argonaute蛋白結(jié)合40了單鏈小RNA分子的Argonaute蛋白會(huì)根據(jù)單鏈RNA分子的序列尋找能夠與其互補(bǔ)配對(duì)的mRNA分子，并與之結(jié)合，然后抑制它的表達(dá)。而究竟采用哪種機(jī)制沉默該基了單鏈小RNA分子的Argonaute蛋白會(huì)根據(jù)單鏈RNA分41因的表達(dá)，比如是直接降解目的mRNA還是僅僅抑制其表達(dá)，在很大程度上取決于mRNA和小RNA分子之間的互補(bǔ)程度。

b、在秀麗隱桿線蟲和某些植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，某些因的表達(dá)，比如是直接降解目的mRNA還是僅僅抑制其表達(dá)，在很42小RNA分子還可以通過(guò)RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）來(lái)合成。有一些天然轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（通常它們都是異常的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）都是這種依賴RdRP途徑合成的小RNA分子的前小RNA分子還可以通過(guò)RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）來(lái)43體來(lái)源物質(zhì)。因此，缺乏RdRP活性的物種，比如哺乳動(dòng)物和黑腹果蠅等物種體內(nèi)是不會(huì)發(fā)現(xiàn)這種小RNA合成機(jī)制的。經(jīng)過(guò)這種途徑生成的小RNA分子隨后同樣也是與Argo體來(lái)源物質(zhì)。因此，缺乏RdRP活性的物種，比如哺乳動(dòng)物和黑腹44naute蛋白相結(jié)合，發(fā)揮抑制靶基因表達(dá)的作用。

c、有一類Argonaute蛋白只存在于生殖細(xì)胞當(dāng)中，它們被稱作PIWI亞科蛋白，它們可以與piRNA結(jié)合，naute蛋白相結(jié)合，發(fā)揮抑制靶基因表達(dá)的作用。

c、有一類45隨后形成的復(fù)合物能夠沉默轉(zhuǎn)座子。單鏈前體RNA分子在未知蛋白的作用下經(jīng)過(guò)初步處理過(guò)程形成piRNA。在生殖細(xì)胞內(nèi)，PIWI蛋白在沉默轉(zhuǎn)座子的同時(shí)還能大量擴(kuò)增pi隨后形成的復(fù)合物能夠沉默轉(zhuǎn)座子。單鏈前體RNA分子在未知蛋白46RNA分子，這個(gè)過(guò)程被稱作進(jìn)一步處理過(guò)程，或者叫ping-pong擴(kuò)增環(huán)路反應(yīng)，這種反應(yīng)在包括小鼠和斑馬魚在內(nèi)的多個(gè)物種體內(nèi)都廣泛存在，非常保守。在這步反應(yīng)當(dāng)中RNA分子，這個(gè)過(guò)程被稱作進(jìn)一步處理過(guò)程，或者叫ping-p47，PIWI蛋白的剪切活性會(huì)不斷剪切轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（即piRNA的前體物質(zhì)）形成piRNA的5端，但是piRNA的3端是由什么蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)生成的，我們現(xiàn)在還不清楚。，PIWI蛋白的剪切活性會(huì)不斷剪切轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（即piRN48

siRNA作為一種新興的治療技術(shù)，卻已經(jīng)以一種前所未有的速度邁進(jìn)了臨床試驗(yàn)階段。下面，我們將介紹幾種已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的人體疾病RNAi療法。

第一個(gè)被

siRNA作為一種新興的治療技術(shù)，卻已經(jīng)以一種前所未有的速49siRNA治療指南批準(zhǔn)獲得臨床研究新藥（investigationalnewdrug，IND）資格，并且進(jìn)入了臨床試驗(yàn)的就是Bevasiranib，它是美國(guó)AcsiRNA治療指南批準(zhǔn)獲得臨床研究新藥（investigat50uity制藥公司生產(chǎn)的針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的siRNA類藥物。該藥主要用于治療滲出性老年性黃斑變性。所謂滲出性老年性黃斑變性，主要是因?yàn)橐暰W(wǎng)膜后uity制藥公司生產(chǎn)的針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的51血管大量生長(zhǎng)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不可逆性視力損傷。在小鼠試驗(yàn)中對(duì)Bevasiranib進(jìn)行的臨床前研究表明，直接眼部注射該藥能夠下調(diào)Vegf基因的表達(dá)，有效減少血管大量生長(zhǎng)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不可逆性視力損傷。在小鼠試驗(yàn)52新生血管數(shù)量。

還有兩家公司也專注于用siRNA治療黃斑變性疾病，他們分別是美國(guó)的Merck’sSirnaTherapeutics公司（主要產(chǎn)品是針對(duì)VEGF新生血管數(shù)量。

還有兩家公司也專注于用siRNA治療黃斑變性53受體VEGFR1蛋白的Sirna-027）和Quark制藥公司。他們和倫敦及柏林的SilenceTherapeutics公司（即以前的SR制藥公司）合作，主要生受體VEGFR1蛋白的Sirna-027）和Quark制藥公54產(chǎn)靶定RTP801基因（又名DDIT4基因，該基因與黃斑變性疾病的進(jìn)展有關(guān)）這種缺氧誘導(dǎo)基因的siRNA產(chǎn)品RTP801i-14。RTP801i-14已經(jīng)被授權(quán)產(chǎn)靶定RTP801基因（又名DDIT4基因，該基因與黃斑變性55給英國(guó)的Prizer制藥公司，進(jìn)行I/IIA期臨床試驗(yàn)。Quark制藥公司也已經(jīng)獲得了IND資格可以進(jìn)行另一項(xiàng)臨床前試驗(yàn)，他們目前正在為這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)招募志愿者。這項(xiàng)給英國(guó)的Prizer制藥公司，進(jìn)行I/IIA期臨床試驗(yàn)。Qu56實(shí)驗(yàn)的藥物靶定TP53基因的siRNA。該藥通過(guò)抑制p53蛋白的表達(dá)能夠阻礙細(xì)胞凋亡通路，從而有望避免手術(shù)后出現(xiàn)的急性腎衰竭。

與此同時(shí)，美國(guó)的Calando實(shí)驗(yàn)的藥物靶定TP53基因的siRNA。該藥通過(guò)抑制p53蛋57制藥公司也開始了新藥的臨床試驗(yàn)項(xiàng)目。他們實(shí)驗(yàn)的新藥是用于治療實(shí)體瘤的靶定核糖核苷酸還原酶RRM2（該酶參與DNA的合成）亞基的siRNA。值得一提的是，這是第一制藥公司也開始了新藥的臨床試驗(yàn)項(xiàng)目。他們實(shí)驗(yàn)的新藥是用于治療58項(xiàng)使用受體介導(dǎo)遞送方式的siRNA臨床試驗(yàn)，該產(chǎn)品被連接有轉(zhuǎn)鐵蛋白的環(huán)糊精顆粒包裹。這樣，藥物就只會(huì)被細(xì)胞表面表達(dá)有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)胞攝取，而轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在腫瘤項(xiàng)使用受體介導(dǎo)遞送方式的siRNA臨床試驗(yàn)，該產(chǎn)品被連接有轉(zhuǎn)59細(xì)胞表面表達(dá)量就非常高。

Acuity制藥公司與Merck公司旗下的SirnaTherapeutics公司合作進(jìn)行的臨床藥物試驗(yàn)成功地穩(wěn)定了患者的病情，阻止了細(xì)胞表面表達(dá)量就非常高。

Acuity制藥公司與Merck公60病情進(jìn)一步加重，明顯改善了患者的視力，而且還沒(méi)有副作用和不良反應(yīng)。這些成果讓我們對(duì)玻璃體內(nèi)注射siRNA這種治療方法充滿了信心。但是，Kleinman等人的報(bào)道病情進(jìn)一步加重，明顯改善了患者的視力，而且還沒(méi)有副作用和不良61給我們當(dāng)頭潑了一盆冷水。Kleinman等人認(rèn)為，患者新生血管數(shù)量的減少并不是因?yàn)閟iRNA特異性的基因沉默作用，而是因?yàn)樗翘禺愋缘丶せ盍薚LR3受體，繼而導(dǎo)給我們當(dāng)頭潑了一盆冷水。Kleinman等人認(rèn)為，患者新生血62致γ干擾素和白介素12活化，從而下調(diào)了VEGF因子的表達(dá)。換句話來(lái)說(shuō)，特異性的siRNA藥物和非特異性的siRNA對(duì)照藥物都能因?yàn)閟iRNA與TLR3之間的相互致γ干擾素和白介素12活化，從而下調(diào)了VEGF因子的表達(dá)。換63作用而產(chǎn)生這種非特異性的血管生成抑制作用。而且，這種非特異性的效應(yīng)與細(xì)胞對(duì)siRNA分子的攝取作用無(wú)關(guān)，同時(shí)由于TLR3蛋白參與細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路，因此這也讓我作用而產(chǎn)生這種非特異性的血管生成抑制作用。而且，這種非特異性64們對(duì)siRNA療法的安全性問(wèn)題感到了擔(dān)憂。

美國(guó)Alnylam制藥公司是一家專業(yè)的siRNA制藥公司，他們的主打產(chǎn)品ALN-RSV01主要針對(duì)呼吸道合胞病們對(duì)siRNA療法的安全性問(wèn)題感到了擔(dān)憂。

美國(guó)Alnyl65毒感染（在美國(guó)每年有大約30萬(wàn)人會(huì)感染呼吸道合胞病毒）。它可以沉默病毒復(fù)制過(guò)程中必需的病毒核衣殼蛋白編碼基因N基因。ALN-RSV01也是第一款進(jìn)入臨床試驗(yàn)的抗毒感染（在美國(guó)每年有大約30萬(wàn)人會(huì)感染呼吸道合胞病毒）。它可66病毒siRNA產(chǎn)品，目前人們已經(jīng)計(jì)劃將試驗(yàn)對(duì)象擴(kuò)展到兒科患者。就現(xiàn)有的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，ALN-RSV01的療效非常好，而且志愿者對(duì)它的耐受性也非常高。最近，Aln病毒siRNA產(chǎn)品，目前人們已經(jīng)計(jì)劃將試驗(yàn)對(duì)象擴(kuò)展到兒科患者67ylam制藥公司又與KyowaHakkoKogyo結(jié)成了獨(dú)家合作關(guān)系，共同在日本和其他亞洲國(guó)家研發(fā)商業(yè)化的ALN-RSV01產(chǎn)品。

Alnylam制藥公司同時(shí)ylam制藥公司又與KyowaHakkoKogyo結(jié)成了獨(dú)家68也在開發(fā)一系列治療高膽固醇血癥、亨廷頓舞蹈?。ㄅc美國(guó)Medtronic共同開發(fā)）、丙型肝炎病毒（與美國(guó)Isis制藥公司共同開發(fā)）、進(jìn)行性多病灶腦白質(zhì)?。ㄅc美國(guó)B也在開發(fā)一系列治療高膽固醇血癥、亨廷頓舞蹈?。ㄅc美國(guó)Medt69iogenIdec公司共同開發(fā)）以及流感（與瑞士Novartis制藥公司共同開發(fā)）等疾病的siRNA產(chǎn)品。

國(guó)際雅-雷二氏綜合征協(xié)會(huì)（TheInternatiiogenIdec公司共同開發(fā)）以及流感（與瑞士Novart70onalPachyonychiaCongenitaConsortium，IPCC）也正與美國(guó)TransDerm公司合作，共同開發(fā)治療雅-雷二氏綜合征的siRNAonalPachyonychiaCongenitaConso71產(chǎn)品。他們希望該產(chǎn)品能夠“糾正”患者角蛋白的合成，從而達(dá)到治療這種罕見的皮膚疾病的目的。

美國(guó)希望之城醫(yī)療中心（TheCityofHopeNationalMe產(chǎn)品。他們希望該產(chǎn)品能夠“糾正”患者角蛋白的合成，從而達(dá)到治72dicalCenter）正在與澳大利亞Benitec公司合作開發(fā)一款治療艾滋病淋巴瘤的藥物。該藥物是一款使用了PolIII啟動(dòng)子載體的shRNA類藥物，主要靶定dicalCenter）正在與澳大利亞Benitec公司合作73HIV病毒的tat基因和rev基因的共有外顯子序列。它使用的載體是基于HIV病毒的一種慢病毒載體，同時(shí)在載體上還插入了另外兩個(gè)RNA抗HIV基因，最后通過(guò)該載體HIV病毒的tat基因和rev基因的共有外顯子序列。它使用的74將shRNA基因?qū)胙焊杉?xì)胞。在臨床試驗(yàn)中，通過(guò)自體骨髓移植方式將這種經(jīng)過(guò)基因改造的血液干細(xì)胞輸入HIV病毒感染患者體內(nèi)，看看是否能夠起到治療艾滋病相關(guān)骨髓瘤將shRNA基因?qū)胙焊杉?xì)胞。在臨床試驗(yàn)中，通過(guò)自體骨髓移75的作用。到目前為止已經(jīng)有四位患者接受了這種治療。

正如前面提到的那樣，在siRNA藥物研發(fā)領(lǐng)域合作已成為非常普遍的現(xiàn)象。通過(guò)合作可以獲得更多的好處，比如獲得更的作用。到目前為止已經(jīng)有四位患者接受了這種治療。

正如前面提76多的科研資金，縮短最后藥物成品上市的時(shí)間等等。

有一些公司，比如美國(guó)RegulusTherapeutics公司等則將目光投向了miRNA。丹麥Santaris多的科研資金，縮短最后藥物成品上市的時(shí)間等等。

有一些公司，77制藥公司最近也開始為他們靶定人體miRNA分子（miR-122）的新藥開始了I期臨床試驗(yàn)項(xiàng)目。在該項(xiàng)藥物試驗(yàn)里，miR-122是被下調(diào)的靶標(biāo)，被試驗(yàn)的藥物是抗m制藥公司最近也開始為他們靶定人體miRNA分子（miR-1278iRNA的鎖核酸藥物SPC3649。鎖核酸是一種骨架被修飾過(guò)的寡核苷酸分子，經(jīng)過(guò)修飾之后它能更好地與底物雜交，避免底物被核酸酶降解。SPC3649最終的目的是希iRNA的鎖核酸藥物SPC3649。鎖核酸是一種骨架被修飾過(guò)79望能夠治療丙型肝炎患者，因?yàn)閙iR-122可以促進(jìn)丙型肝炎病毒復(fù)制。下調(diào)miR-122分子還能用于治療高膽固醇血癥患者。直接靶定在心臟里表達(dá)的miRNA分子，比望能夠治療丙型肝炎患者，因?yàn)閙iR-122可以促進(jìn)丙型肝炎病80如miR-208（它能夠調(diào)控心臟肥大和纖維化）等也會(huì)達(dá)到治療目的，因?yàn)樵卺t(yī)療實(shí)踐中早就發(fā)現(xiàn)直接往靶器官里給藥是可行的。

miRNA功能的獲得或缺失與各種疾病的如miR-208（它能夠調(diào)控心臟肥大和纖維化）等也會(huì)達(dá)到治療81發(fā)生發(fā)展都有著密切的關(guān)系。蛋白質(zhì)功能既可以直接也可以間接地受miRNA分子的調(diào)控，因此，miRNA表達(dá)水平的些許改變也會(huì)對(duì)基因表達(dá)調(diào)控帶來(lái)巨大的影響。在因?yàn)閙i發(fā)生發(fā)展都有著密切的關(guān)系。蛋白質(zhì)功能既可以直接也可以間接地受82RNA表達(dá)水平改變而造成的疾病中，我們可以設(shè)想是否如此，如果能使miRNA表達(dá)水平恢復(fù)正常，那么就應(yīng)該能夠治愈該疾病呢？那么如果是這樣，當(dāng)miRNA表達(dá)水平過(guò)高RNA表達(dá)水平改變而造成的疾病中，我們可以設(shè)想是否如此，如果83時(shí)我們就對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性下調(diào)，如果表達(dá)水平過(guò)低我們就往細(xì)胞內(nèi)注入一些類似的miRNA模擬物。不過(guò)要達(dá)到這個(gè)目的，我們現(xiàn)有的小RNA遞送系統(tǒng)的特異性和有效性都還有待時(shí)我們就對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性下調(diào)，如果表達(dá)水平過(guò)低我們就往細(xì)胞內(nèi)注84提高。另外，要想對(duì)目標(biāo)miRNA分子表達(dá)水平進(jìn)行精細(xì)、準(zhǔn)確的調(diào)控并非一件容易的工作，而且人們現(xiàn)在還不清楚能否精確地只對(duì)一個(gè)miRNA分子施加影響而不會(huì)“傷及”同提高。另外，要想對(duì)目標(biāo)miRNA分子表達(dá)水平進(jìn)行精細(xì)、準(zhǔn)確的85一miRNA分子家族中的其它成員。

在實(shí)際治療時(shí)，不論是上調(diào)還是下調(diào)miRNA的功能，我們都還應(yīng)該考慮到miRNA分子調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜程度。要知道一個(gè)miRNA一miRNA分子家族中的其它成員。

在實(shí)際治療時(shí)，不論是上調(diào)86分子就可以調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，因此我們哪怕對(duì)一個(gè)miRNA分子進(jìn)行調(diào)控也要特別小心。

將siRNA分子用于臨床治療會(huì)產(chǎn)生很多安全性問(wèn)題。完成了最初分子就可以調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，因此我們哪怕對(duì)一個(gè)mi87的試驗(yàn)之后，有很多報(bào)道都指出了這種新興療法可能存在很多潛在的安全問(wèn)題。最早報(bào)道的是在一項(xiàng)小鼠試驗(yàn)中，使用PolIII啟動(dòng)子載體在肝臟中表達(dá)shRNA進(jìn)行治療，結(jié)的試驗(yàn)之后，有很多報(bào)道都指出了這種新興療法可能存在很多潛在的88果導(dǎo)致試驗(yàn)小鼠死亡。具體的致死機(jī)制現(xiàn)在還不清楚，但是至少有部分原因可能是因?yàn)樨?fù)責(zé)將miRNA分子從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運(yùn)因子輸出蛋白5（exportin5）出現(xiàn)果導(dǎo)致試驗(yàn)小鼠死亡。具體的致死機(jī)制現(xiàn)在還不清楚，但是至少有部89了飽和?，F(xiàn)在其它試驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明很多參與RNAi處理過(guò)程的因子在細(xì)胞大量表達(dá)外源性siRNA時(shí)都會(huì)被這些小RNA分子所飽和，因此就無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)正常的細(xì)胞內(nèi)源性miRN了飽和?，F(xiàn)在其它試驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明很多參與RNAi處理過(guò)程的因子90A分子。由于每一個(gè)細(xì)胞miRNA都能夠調(diào)控上百種基因的表達(dá)，因此對(duì)miRNA途徑哪怕只帶來(lái)一點(diǎn)小小的擾動(dòng)也會(huì)造成非常嚴(yán)重的后果。

要解決這個(gè)問(wèn)題有一種辦法就是A分子。由于每一個(gè)細(xì)胞miRNA都能夠調(diào)控上百種基因的表達(dá)，91設(shè)計(jì)能被Dicer酶切割的外源性siRNA（即增加siRNA的長(zhǎng)度），這樣就能在達(dá)到同樣治療效果的前提下使用最低劑量的siRNA藥物。這些RNA分子經(jīng)過(guò)Dice設(shè)計(jì)能被Dicer酶切割的外源性siRNA（即增加siRNA92r酶切割之后就進(jìn)入了RNAi途徑，這樣相比直接使用外源性的21nt的siRNA藥物通常都能夠以更低的劑量達(dá)到更好的基因沉默效果。雖然少量的siRNA分子應(yīng)該不足r酶切割之后就進(jìn)入了RNAi途徑，這樣相比直接使用外源性的293以飽和整個(gè)RNAi體系，但是它們也能夠與其它miRNA競(jìng)爭(zhēng)RISC復(fù)合體進(jìn)入位點(diǎn)。這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)造成什么樣的遠(yuǎn)期結(jié)果現(xiàn)在還不清楚。

使用微陣列芯片可以很明顯地發(fā)現(xiàn)以飽和整個(gè)RNAi體系，但是它們也能夠與其它miRNA競(jìng)爭(zhēng)R94，往胞內(nèi)導(dǎo)入外源性siRNA分子之后會(huì)改變靶基因的表達(dá)水平，但同時(shí)也能改變其它非靶基因的表達(dá)狀況，因?yàn)閮H憑6、7個(gè)核苷酸互補(bǔ)序列的結(jié)合就會(huì)通過(guò)一種miRNA樣機(jī)，往胞內(nèi)導(dǎo)入外源性siRNA分子之后會(huì)改變靶基因的表達(dá)水平，95制產(chǎn)生特異性的脫靶效應(yīng)。不過(guò)，微陣列芯片只能夠反映mRNA水平的改變，不能夠反映翻譯水平的改變，因此我們還不能明確這種脫靶效應(yīng)會(huì)造成多大的影響。由于使用人工合成制產(chǎn)生特異性的脫靶效應(yīng)。不過(guò)，微陣列芯片只能夠反映mRNA水96的siRNA只能短期抑制細(xì)胞基因的表達(dá)，因此在臨床實(shí)踐中，這種特異性的脫靶效應(yīng)可能還不是一個(gè)大問(wèn)題。不過(guò)無(wú)論如何，在進(jìn)行適當(dāng)?shù)亩拘栽囼?yàn)時(shí)我們都應(yīng)該考慮siRNA的siRNA只能短期抑制細(xì)胞基因的表達(dá)，因此在臨床實(shí)踐中，這97與非靶基因mRNA3端UTR區(qū)域結(jié)合后可能出現(xiàn)的問(wèn)題。

在進(jìn)行siRNA設(shè)計(jì)的時(shí)候可以采取一些策略，盡量減少這種脫靶情況的發(fā)生。比如，在siRNA雙鏈分子中引與非靶基因mRNA3端UTR區(qū)域結(jié)合后可能出現(xiàn)的問(wèn)題。

在進(jìn)98入2’-O-Me修飾或者進(jìn)行DNA替換都能夠明顯降低脫靶現(xiàn)象的發(fā)生率。改變熱穩(wěn)定性或者封閉正義鏈5端的磷酸化位點(diǎn)，這都能改善反義鏈選擇過(guò)程，這對(duì)于降低脫靶率也是入2’-O-Me修飾或者進(jìn)行DNA替換都能夠明顯降低脫靶現(xiàn)象99非常有幫助的。

RNAi機(jī)制是一條非常保守的作用機(jī)制，它最初的作用可能是幫助物種抵抗病毒的感染。如果是這樣，我們也就不會(huì)感到奇怪，為什么在某些情況下siRNA非常有幫助的。

RNAi機(jī)制是一條非常保守的作用機(jī)制，它最初100能夠起到Toll樣受體激動(dòng)劑的作用；某些序列，比如富含尿嘧啶的序列或者富含鳥嘌呤及尿嘧啶的序列能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的免疫應(yīng)答。siRNA能夠刺激細(xì)胞出現(xiàn)免疫應(yīng)答不僅是因能夠起到Toll樣受體激動(dòng)劑的作用；某些序列，比如富含尿嘧啶101為它的序列，還可能是因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)、所使用的遞送系統(tǒng)或者細(xì)胞類型等等因素。雖然這種免疫刺激在某些情況下可能會(huì)有所幫助，但是通常來(lái)說(shuō)我們都不希望它發(fā)生。上面提到的T為它的序列，還可能是因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)、所使用的遞送系統(tǒng)或者細(xì)胞類102LR3反應(yīng)對(duì)VEGF或VEGF受體起到的非序列特異性調(diào)控作用，以及另一起報(bào)道中提到的在鼠類動(dòng)物模型中，靶定巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（migrationinhibitLR3反應(yīng)對(duì)VEGF或VEGF受體起到的非序列特異性調(diào)控作用103oryfactor，Mif）的siRNA和非特異性的對(duì)照siRNA分子都能夠通過(guò)能激活蛋白激酶（PKR）的dsRNA的活性增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。上述無(wú)一不提oryfactor，Mif）的siRNA和非特異性的對(duì)照si104示我們，在解釋siRNA體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)一定要倍加仔細(xì)。

雖然我們還沒(méi)能找到一種方法可以避免所有的脫靶效應(yīng)，但是可以預(yù)見，使用恰當(dāng)?shù)腞NA修飾方法和遞送途徑，從示我們，在解釋siRNA體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)一定要倍加仔細(xì)。

雖然105而使RNA分子避免接觸天然免疫系統(tǒng)的受體，我們就一定能夠解決脫靶這個(gè)問(wèn)題。

所謂基因療法(genetherapy)通常是指為病人補(bǔ)充他所缺乏的基因產(chǎn)物(一般是而使RNA分子避免接觸天然免疫系統(tǒng)的受體，我們就一定能夠解決106蛋白質(zhì))。某些情況下補(bǔ)充過(guò)量的某種蛋白質(zhì)可以起到穩(wěn)定和改善病情的作用。然而，在用基因療法治療某些疾病--例如由于病毒感染或是由于病毒基因組編碼的外源基因侵入機(jī)體蛋白質(zhì))。某些情況下補(bǔ)充過(guò)量的某種蛋白質(zhì)可以起到穩(wěn)定和改善病107而導(dǎo)致的疾病時(shí)--適當(dāng)關(guān)閉或是下調(diào)某個(gè)基因的表達(dá)也十分重要。癌癥就是個(gè)典型的例子，體內(nèi)正?；虻牟徽_表達(dá)或是發(fā)生功能獲得性突變(gain-of-functio而導(dǎo)致的疾病時(shí)--適當(dāng)關(guān)閉或是下調(diào)某個(gè)基因的表達(dá)也十分重要。108nmutation)都有可能改變細(xì)胞周期、加劇細(xì)胞增殖失控，從而引發(fā)癌變。

miRNA/RNAi用于基因治療的想法最初源于一些從事基因治療行業(yè)的科研人員在nmutation)都有可能改變細(xì)胞周期、加劇細(xì)胞增殖失控，109實(shí)際工作中遇到的問(wèn)題，如“RNAi和miRNA介導(dǎo)的基因敲除之間有何區(qū)別”以及“在以前基因敲除技術(shù)并不成熟的時(shí)候，RNAi是否真的能發(fā)揮效用”。顯然，諸如此類的實(shí)際工作中遇到的問(wèn)題，如“RNAi和miRNA介導(dǎo)的基因敲除110問(wèn)題并沒(méi)有簡(jiǎn)單或是明確的答案。即便如此，要想解決這些問(wèn)題，我們首先要給出一個(gè)明確的定義，即RNAi和miRNA分子都是短小的、雙鏈RNA分子(大約21堿基對(duì)的長(zhǎng)問(wèn)題并沒(méi)有簡(jiǎn)單或是明確的答案。即便如此，要想解決這些問(wèn)題，我111度)，這些RNA分子可以在轉(zhuǎn)錄后水平上部分或完全沉默某一特定基因的表達(dá)。而該過(guò)程僅在mRNA含有小RNA同源靶序列時(shí)才會(huì)發(fā)生。

RNAi比以前各種基于基因敲除度)，這些RNA分子可以在轉(zhuǎn)錄后水平上部分或完全沉默某一特定112的基因治療法都要成功的主要原因是一切哺乳動(dòng)物細(xì)胞中都存在內(nèi)源性RNAi/miRNA。RNAi和miRNA通路之間存在很多顯著的異同之處，一般來(lái)說(shuō)，RNAi會(huì)造成的基因治療法都要成功的主要原因是一切哺乳動(dòng)物細(xì)胞中都存在內(nèi)源113基因位點(diǎn)特異性的斷裂，而miRNA的敲除功能則源于mRNA的翻譯抑制和/或mRNA更新率的提高。小RNA和它的mRNA的靶位點(diǎn)完全互補(bǔ)匹配時(shí)會(huì)活化由RNAi引起基因位點(diǎn)特異性的斷裂，而miRNA的敲除功能則源于mRNA的114的斷裂途徑，而miRNA介導(dǎo)的抑制過(guò)程只需二者間有部分序列匹配即可。一般越低等的生物，它們的RNA越有可能通過(guò)介導(dǎo)相應(yīng)基因染色質(zhì)或DNA的修飾來(lái)觸發(fā)轉(zhuǎn)錄后的抑制的斷裂途徑，而miRNA介導(dǎo)的抑制過(guò)程只需二者間有部分序列匹115過(guò)程，而在哺乳動(dòng)物中是否存在這一過(guò)程尚存有爭(zhēng)議。

人們通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物基因組內(nèi)源miRNA基因序列進(jìn)行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)至少存在500個(gè)或更多不同類型的RNA調(diào)控著過(guò)程，而在哺乳動(dòng)物中是否存在這一過(guò)程尚存有爭(zhēng)議。

人們通過(guò)對(duì)116我們機(jī)體內(nèi)大約1/3的基因。這一調(diào)控過(guò)程進(jìn)一步加強(qiáng)了生物體在發(fā)育過(guò)程、細(xì)胞周期以及免疫和代謝途徑中對(duì)基因復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的控制。當(dāng)然，這些miRNA是如何被控制的我們機(jī)體內(nèi)大約1/3的基因。這一調(diào)控過(guò)程進(jìn)一步加強(qiáng)了生物體在117還有待進(jìn)一步探索，但現(xiàn)在已有很多科研人員嘗試研究這些生理過(guò)程的異常調(diào)節(jié)對(duì)諸如神經(jīng)功能缺損、癌癥、免疫失調(diào)以及感染的發(fā)病意義。

當(dāng)RNAi在一次不經(jīng)意的植物轉(zhuǎn)基還有待進(jìn)一步探索，但現(xiàn)在已有很多科研人員嘗試研究這些生理過(guò)程118因研究過(guò)程中首次作為一個(gè)概念被提出后，其作用機(jī)理最早由Fire、Mello等人于九十年代末在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中闡明(F因研究過(guò)程中首次作為一個(gè)概念被提出后，其作用機(jī)理最早由Fir119ireetal.,2019)，這一發(fā)現(xiàn)獲得了2019年的諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。起初，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)曾引起人們對(duì)于哺乳動(dòng)物是否存在RNAi現(xiàn)象這一問(wèn)題產(chǎn)生了極大的爭(zhēng)論。ireetal.,2019)，這一發(fā)現(xiàn)獲得了2019年的諾貝120

基于RNAi技術(shù)的療法可以被分為兩大類，第一類是成熟的siRNA分子以雙鏈裸露的RNA形式或RNA與載體結(jié)合的方式被傳遞。RNA的核苷酸可以被修飾，以降低其

基于RNAi技術(shù)的療法可以被分為兩大類，第一類是成熟的si121毒性并/或當(dāng)運(yùn)輸至含有核酸酶的體液時(shí)延長(zhǎng)其活性。由于siRNA在細(xì)胞內(nèi)的半衰期有限，因此它們的活性在細(xì)胞內(nèi)會(huì)受到限制。第二類是用DNA作為轉(zhuǎn)錄模板以使短的含發(fā)夾毒性并/或當(dāng)運(yùn)輸至含有核酸酶的體液時(shí)延長(zhǎng)其活性。由于siRN122結(jié)構(gòu)的RNA(shRNA)形成成熟的siRNA。盡管這些療法都受到載體的限制，但一般都會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈且持久的RNAi活性。

過(guò)去幾年，不斷有人嘗試在臨床前期的疾病結(jié)構(gòu)的RNA(shRNA)形成成熟的siRNA。盡管這些療法123模型中應(yīng)用小RNA。在這些嘗試中至少有6個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)獲得了成功，其中包括了用載體表達(dá)的shRNA和基于siRNA技術(shù)的基因療法，這些療法都很有希望應(yīng)用于臨床藥物的模型中應(yīng)用小RNA。在這些嘗試中至少有6個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)獲得了成功124開發(fā)。在前人的這些臨床實(shí)驗(yàn)的啟示下，下一步關(guān)鍵問(wèn)題是明確影響小RNA基因療法效率的關(guān)鍵因素究竟是因?yàn)榛蚯贸奶禺愋?，還是因?yàn)榇嬖诙喾N非特異性應(yīng)答形式。

在過(guò)開發(fā)。在前人的這些臨床實(shí)驗(yàn)的啟示下，下一步關(guān)鍵問(wèn)題是明確影響125去的十年里，小RNA在生物動(dòng)態(tài)平衡中所扮演的角色越來(lái)越為人們所了解。但是，即使有新型技術(shù)(尤其是大規(guī)模測(cè)序平臺(tái))的支持，我們對(duì)于小RNA具體功能的認(rèn)識(shí)還只處于表去的十年里，小RNA在生物動(dòng)態(tài)平衡中所扮演的角色越來(lái)越為人們126面階段。對(duì)內(nèi)源RNAi/miRNA途徑的闡明不但使人們對(duì)基因的調(diào)控和功能有了更清晰的了解，而且也幫助我們?cè)诩?xì)胞中發(fā)現(xiàn)更多其它類型的小RNA，不過(guò)這些小RNA產(chǎn)生面階段。對(duì)內(nèi)源RNAi/miRNA途徑的闡明不但使人們對(duì)基因127的機(jī)制以及它們?cè)诨蛘{(diào)控過(guò)程所起的作用還不甚明確，但對(duì)于研究RNA的生物學(xué)家及探索疾病治療新技術(shù)的醫(yī)學(xué)工作者而言，這些發(fā)現(xiàn)十分振奮人心。毫無(wú)疑問(wèn)，小RNA技術(shù)已的機(jī)制以及它們?cè)诨蛘{(diào)控過(guò)程所起的作用還不甚明確，但對(duì)于研究128RNAi技術(shù)及其應(yīng)用課件129RNAi技術(shù)及其應(yīng)用課件130RNAi技術(shù)及其應(yīng)用課件131現(xiàn)在幾乎每天都會(huì)有文章對(duì)各種小RNA與機(jī)體發(fā)育之間關(guān)系的進(jìn)展進(jìn)行報(bào)道。而精明的生物技術(shù)公司也正在以驚人的速度積極地將RNAi的相關(guān)知識(shí)運(yùn)用于藥物篩選研究。借助現(xiàn)現(xiàn)在幾乎每天都會(huì)有文章對(duì)各種小RNA與機(jī)體發(fā)育之間關(guān)系的進(jìn)展132今先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)，人們鑒定出了多種新型小RNA，而隨后，它們的強(qiáng)大功能將會(huì)繼續(xù)吸引我們研究下去，相信研究結(jié)果一定會(huì)讓我們感到驚喜。

雙鏈RNA能夠以序列特異性今先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)，人們鑒定出了多種新型小RNA，而隨后，它們133的方式導(dǎo)致基因沉默的機(jī)制自發(fā)現(xiàn)起就對(duì)生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大影響，它揭示了人們以前未曾注意到的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。這種機(jī)制被稱為RNA干擾（RNAi）或者RNA沉默的方式導(dǎo)致基因沉默的機(jī)制自發(fā)現(xiàn)起就對(duì)生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大影134（RNAsilencing）。其核心內(nèi)容是：一些非編碼小RNA分子（smallnon-codingRNA，20~30nt）進(jìn)入細(xì)胞后與序列互補(bǔ)的信使RNA靶標(biāo)配（RNAsilencing）。其核心內(nèi)容是：一些非編碼小RN135對(duì)，阻止其表達(dá)。2019年9月，《自然》首次刊登了美國(guó)科學(xué)家AndrewZ.Fire與llo等人撰寫的關(guān)于RNA干擾的成果文章。時(shí)隔不久，RNAi技術(shù)取得了非凡對(duì)，阻止其表達(dá)。2019年9月，《自然》首次刊登了美國(guó)科學(xué)家136的成就。人們逐漸意識(shí)到，RNAi將會(huì)對(duì)生物學(xué)的發(fā)展帶來(lái)深遠(yuǎn)的影響。毫無(wú)疑問(wèn)，打開了RNAi這一潘多拉盒子的AndrewFire與CraigMello獲得了200的成就。人們逐漸意識(shí)到，RNAi將會(huì)對(duì)生物學(xué)的發(fā)展帶來(lái)深遠(yuǎn)的1376年的生理學(xué)或醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。諾貝爾委員會(huì)成員GoranHansson在該年的頒獎(jiǎng)詞中說(shuō)道：“RNAi為我們了解生命提供了新視角，并為醫(yī)學(xué)發(fā)展提供了新工具。”不過(guò)6年的生理學(xué)或醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)。諾貝爾委員會(huì)成員GoranHan138，RNAi的故事才剛剛開始，許多懸念有待人們逐個(gè)解開。

細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的長(zhǎng)dsRNA或外源性長(zhǎng)dsRNA（可以是由正鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配對(duì)而成的結(jié)構(gòu)，也可以，RNAi的故事才剛剛開始，許多懸念有待人們逐個(gè)解開。

細(xì)胞139是ssRNA內(nèi)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)）在Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的雙鏈解開，其中一條鏈被優(yōu)先裝載入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）中；裝載了小RNA是ssRNA內(nèi)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)）在Dicer酶的作用下降解成小140的RISC復(fù)合物就會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積極地“搜索”轉(zhuǎn)錄組，探尋潛在的RNA靶分子。被裝載入RISC復(fù)合物當(dāng)中的向?qū)ф湥╣uidestrand）--ssRNA隨后引導(dǎo)RI的RISC復(fù)合物就會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積極地“搜索”轉(zhuǎn)錄組，探尋潛在的141SC復(fù)合物當(dāng)中的核酸內(nèi)切酶（有時(shí)被稱作“切割機(jī)”，現(xiàn)在人們知道它是Argonaute蛋白）反復(fù)剪切擁有向?qū)ф溚葱蛄械膍RNA靶分子。向?qū)ф溇褪峭ㄟ^(guò)這種方式來(lái)發(fā)SC復(fù)合物當(dāng)中的核酸內(nèi)切酶（有時(shí)被稱作“切割機(jī)”，現(xiàn)在人們知142揮特異性的RNAi作用的；

盡管不同生物體內(nèi)，參與RNAi途徑的蛋白和相關(guān)機(jī)制各有不同，但是它們的干擾策略卻驚人地一致。在所有被研究過(guò)的物種中，RNAi都揮特異性的RNAi作用的；

盡管不同生物體內(nèi)，參與RNAi143包含兩種主要的組成成分，即決定干擾特異性的小RNA和發(fā)揮抑制作用的Argonaute蛋白。

根據(jù)RISC復(fù)合物中Argonaute蛋白的天然活性以及小RNA與包含兩種主要的組成成分，即決定干擾特異性的小RNA和發(fā)揮抑制144其靶標(biāo)mRNA之間互補(bǔ)程度的不同，RISC復(fù)合物與靶標(biāo)mRNA結(jié)合后會(huì)發(fā)揮幾種不同的作用，它可以控制mRNA的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)合成、維持基因組完整性，或產(chǎn)生一系列其靶標(biāo)mRNA之間互補(bǔ)程度的不同，RISC復(fù)合物與靶標(biāo)mRN145特異性的小RNA。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)以及生物信息學(xué)的不斷進(jìn)步，科研人員得以對(duì)小RNA的起源及其靶向機(jī)制開展更深入的研究。他們發(fā)現(xiàn)，在各個(gè)不同的物種當(dāng)中，R特異性的小RNA。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)以及生物信息學(xué)的不146NAi系統(tǒng)獲得了不同程度的改進(jìn)，包括進(jìn)化出“內(nèi)置式的”分子“刻度尺”，用來(lái)控制小RNA的大小和結(jié)構(gòu)，從而挑選出小dsRNA中最合適的那條單鏈分子進(jìn)入下一步驟；或NAi系統(tǒng)獲得了不同程度的改進(jìn)，包括進(jìn)化出“內(nèi)置式的”分子“147進(jìn)化出防止“脫靶”現(xiàn)象出現(xiàn)的機(jī)制等等。

科研人員還發(fā)現(xiàn)RNAi通路的活性會(huì)在各個(gè)水平（從小RNA的生成到RISC復(fù)合物的沉默模式）受到嚴(yán)密調(diào)控。

各種不同的進(jìn)化出防止“脫靶”現(xiàn)象出現(xiàn)的機(jī)制等等。

科研人員還發(fā)現(xiàn)RNA148RNA沉默途徑之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，比如黑腹果蠅中的endo-siRNA和miRNA之間就相互競(jìng)爭(zhēng)LOQS。這種競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制就是RNAi途徑中決定每一個(gè)階段里如何發(fā)生調(diào)RNA沉默途徑之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，比如黑腹果蠅中的endo-s149控的關(guān)鍵步驟。很多植物和動(dòng)物病毒都會(huì)編碼抑制蛋白來(lái)抑制宿主細(xì)胞的RNAi途徑，使得這些調(diào)控機(jī)制無(wú)法在各個(gè)不同階段發(fā)揮正常作用。細(xì)胞的蛋白質(zhì)同樣也能夠調(diào)控RNAi控的關(guān)鍵步驟。很多植物和動(dòng)物病毒都會(huì)編碼抑制蛋白來(lái)抑制宿主細(xì)150。比如，在人體胚胎細(xì)胞中，miRNAlet-7分子（一種抑癌分子，同時(shí)也是一種細(xì)胞周期調(diào)控分子）的生成過(guò)程就是一條轉(zhuǎn)錄后被抑制的過(guò)程，該途徑被多潛能因子LIN2。比如，在人體胚胎細(xì)胞中，miRNAlet-7分子（一種抑癌1518所抑制。LIN28蛋白可以阻止pri-let-7分子在微處理器復(fù)合物中的剪切過(guò)程及后續(xù)由Dicer蛋白負(fù)責(zé)的pre-let-7前體分子的處理過(guò)程。不過(guò)，人體同8所抑制。LIN28蛋白可以阻止pri-let-7分子在微處152時(shí)存在另一條路徑。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）和生長(zhǎng)因子家族中的骨形成蛋白（BMP）都能促進(jìn)miR-21這種促癌分子的生成。這是因?yàn)檫@些蛋白能夠促進(jìn)DROSHA時(shí)存在另一條路徑。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）和生長(zhǎng)因子家族153將pri-miR-21轉(zhuǎn)化成pre-miR-21。更確切地說(shuō)，SMAD蛋白家族成員TGF-β和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)換因子與RNA解旋酶p68組成的復(fù)合物一起被招募至pr將pri-miR-21轉(zhuǎn)化成pre-miR-21。更確切地說(shuō)154i-miR-21，促進(jìn)pre-miRNA形成。另外，不均一核糖核酸RNPA1蛋白（heterogeneousnuclearRNPA1，hnRNPA1）這種著名的i-miR-21，促進(jìn)pre-miRNA形成。另外，不均一核155前體mRNA分子剪切調(diào)控因子也會(huì)幫助DROSHA發(fā)揮作用，有效地生成pre-miR-18，這可能是由hnRNPA1蛋白能夠重新折疊發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或者直接與pri-m前體mRNA分子剪切調(diào)控因子也會(huì)幫助DROSHA發(fā)揮作用，有156iRNA結(jié)合，為DROSHA構(gòu)建出一個(gè)酶切位點(diǎn)而造成的。這也說(shuō)明在pri-miRNA分子中，某些發(fā)夾結(jié)構(gòu)可能是在pri-miRNA分子與RNA伴侶蛋白結(jié)合之后才iRNA結(jié)合，為DROSHA構(gòu)建出一個(gè)酶切位點(diǎn)而造成的。這也157會(huì)形成并被剪切的。

RISC復(fù)合體的活性同樣能夠被調(diào)控。在擬南芥中，非編碼基因IPS1中含有的一段基序能夠與miR-399序列互補(bǔ)，但是它們之間的互補(bǔ)配對(duì)過(guò)程會(huì)形成并被剪切的。

RISC復(fù)合體的活性同樣能夠被調(diào)控。在擬158卻被該miRNA分子中酶切位點(diǎn)處的一段錯(cuò)配形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)給破壞了。這樣，IPS1基因的mRNA產(chǎn)物不僅沒(méi)能被miR-399降解，反而還大量“扣押了”miR-39卻被該miRNA分子中酶切位點(diǎn)處的一段錯(cuò)配形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)給破1599分子。因此，如果IPS1基因大量表達(dá)會(huì)使得胞內(nèi)“積聚”大量miR-399分子的靶標(biāo)--PHO2基因mRNA。這種靶標(biāo)之間的相似性會(huì)給RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)帶來(lái)不可預(yù)料9分子。因此，如果IPS1基因大量表達(dá)會(huì)使得胞內(nèi)“積聚”大量160的復(fù)雜性。我們預(yù)測(cè)，最近在人體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的大量mRNA樣非編碼RNA分子（mRNA-likenon-codingRNA）可能會(huì)在小RNA-Argonaute蛋白的復(fù)雜性。我們預(yù)測(cè)，最近在人體細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的大量mRNA樣非編161復(fù)合體調(diào)控過(guò)程中起到“減速器（attenuator）”的作用。

RNAi機(jī)制中最引人注目的亮點(diǎn)就是僅由20~30nt組成的小dsRNA。它們是由RNaseII復(fù)合體調(diào)控過(guò)程中起到“減速器（attenuator）”的作用162I酶（可以是Dicer單獨(dú)發(fā)揮作用，也可以是Drosha和Dicer共同發(fā)揮作用）剪切長(zhǎng)RNA得到的產(chǎn)物。按照小RNA的來(lái)源前體的不同，我們可以將其分為兩大類：I酶（可以是Dicer單獨(dú)發(fā)揮作用，也可以是Drosha和D163一是小干擾RNA（siRNA），它是細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)病毒感染或者其它人工導(dǎo)入分子而剪切外源性長(zhǎng)dsRNA前體而生成；二是miRNA，它由細(xì)胞運(yùn)用其自身基因組編碼的莖一是小干擾RNA（siRNA），它是細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)病毒感染或者164環(huán)結(jié)構(gòu)加工而來(lái)。借助高通量測(cè)序技術(shù)，人們發(fā)現(xiàn)了好幾種內(nèi)源性小RNA，包括最近發(fā)現(xiàn)的PIWI相互作用RNA（PIWI-interactingRNA,piRNA）和環(huán)結(jié)構(gòu)加工而來(lái)。借助高通量測(cè)序技術(shù)，人們發(fā)現(xiàn)了好幾種內(nèi)源性小165內(nèi)源性siRNA（esiRNA）。

不過(guò)，這些小RNA子都有一個(gè)共同的特征，那就是它們都能與Argonaute蛋白相結(jié)合，從而發(fā)揮它們的靶向作用。

簡(jiǎn)述內(nèi)源性siRNA（esiRNA）。

不過(guò)，這些小RNA子都有166小RNA分子的形成過(guò)程以及RNA沉默的機(jī)制

a、能夠形成dsRNA結(jié)構(gòu)或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)的天然轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是形成小RNA分子的前體物質(zhì)。這些雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA分子經(jīng)由Dr小RNA分子的形成過(guò)程以及RNA沉默的機(jī)制

a、能夠形成ds167osha或Dicer等RNaseIII處理之后就能得到小dsRNA分子。如果這些小dsRNA分子之間的配對(duì)情況非常好，如圖中左側(cè)所示，那么就會(huì)經(jīng)由Argonauosha或Dicer等RNaseIII處理之后就能得到小ds168te蛋白的酶切活性進(jìn)行進(jìn)一步處理，生成小ssRNA產(chǎn)物。如果像圖中右側(cè)所示的那樣，小dsRNA分子之間的配對(duì)情況不是非常好，比如出現(xiàn)了錯(cuò)配或者有環(huán)狀凸出，那么它te蛋白的酶切活性進(jìn)行進(jìn)一步處理，生成小ssRNA產(chǎn)物。如果169們就不能被Argonaute蛋白酶切處理，只能經(jīng)由一種不依賴酶切活性的方式生成最終的小ssRNA產(chǎn)物。目前，我們對(duì)于究竟是哪種蛋白參與其中來(lái)發(fā)揮解鏈活性還不得而們就不能被Argonaute蛋白酶切處理，只能經(jīng)由一種不依賴170知。生成的小ssRNA分子隨后會(huì)與Argonaute蛋白結(jié)合，但究竟是哪一條單鏈分子（正鏈或負(fù)鏈）結(jié)合到Argonaute蛋白上則取決于它們的熱力學(xué)穩(wěn)定性。結(jié)合知。生成的小ssRNA分子隨后會(huì)與Argonaute蛋白結(jié)合171了單鏈小RNA分子的Argonaute蛋白會(huì)根據(jù)單鏈RNA分子的序列尋找能夠與其互補(bǔ)配對(duì)的mRNA分子，并與之結(jié)合，然后抑制它的表達(dá)。而究竟采用哪種機(jī)制沉默該基了單鏈小RNA分子的Argonaute蛋白會(huì)根據(jù)單鏈RNA分172因的表達(dá)，比如是直接降解目的mRNA還是僅僅抑制其表達(dá)，在很大程度上取決于mRNA和小RNA分子之間的互補(bǔ)程度。

b、在秀麗隱桿線蟲和某些植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，某些因的表達(dá)，比如是直接降解目的mRNA還是僅僅抑制其表達(dá)，在很173小RNA分子還可以通過(guò)RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）來(lái)合成。有一些天然轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（通常它們都是異常的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）都是這種依賴RdRP途徑合成的小RNA分子的前小RNA分子還可以通過(guò)RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）來(lái)174體來(lái)源物質(zhì)。因此，缺乏RdRP活性的物種，比如哺乳動(dòng)物和黑腹果蠅等物種體內(nèi)是不會(huì)發(fā)現(xiàn)這種小RNA合成機(jī)制的。經(jīng)過(guò)這種途徑生成的小RNA分子隨后同樣也是與Argo體來(lái)源物質(zhì)。因此，缺乏RdRP活性的物種，比如哺乳動(dòng)物和黑腹175naute蛋白相結(jié)合，發(fā)揮抑制靶基因表達(dá)的作用。

c、有一類Argonaute蛋白只存在于生殖細(xì)胞當(dāng)中，它們被稱作PIWI亞科蛋白，它們可以與piRNA結(jié)合，naute蛋白相結(jié)合，發(fā)揮抑制靶基因表達(dá)的作用。

c、有一類176隨后形成的復(fù)合物能夠沉默轉(zhuǎn)座子。單鏈前體RNA分子在未知蛋白的作用下經(jīng)過(guò)初步處理過(guò)程形成piRNA。在生殖細(xì)胞內(nèi)，PIWI蛋白在沉默轉(zhuǎn)座子的同時(shí)還能大量擴(kuò)增pi隨后形成的復(fù)合物能夠沉默轉(zhuǎn)座子。單鏈前體RNA分子在未知蛋白177RNA分子，這個(gè)過(guò)程被稱作進(jìn)一步處理過(guò)程，或者叫ping-pong擴(kuò)增環(huán)路反應(yīng)，這種反應(yīng)在包括小鼠和斑馬魚在內(nèi)的多個(gè)物種體內(nèi)都廣泛存在，非常保守。在這步反應(yīng)當(dāng)中RNA分子，這個(gè)過(guò)程被稱作進(jìn)一步處理過(guò)程，或者叫ping-p178，PIWI蛋白的剪切活性會(huì)不斷剪切轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（即piRNA的前體物質(zhì)）形成piRNA的5端，但是piRNA的3端是由什么蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)生成的，我們現(xiàn)在還不清楚。，PIWI蛋白的剪切活性會(huì)不斷剪切轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（即piRN179

siRNA作為一種新興的治療技術(shù)，卻已經(jīng)以一種前所未有的速度邁進(jìn)了臨床試驗(yàn)階段。下面，我們將介紹幾種已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的人體疾病RNAi療法。

第一個(gè)被

siRNA作為一種新興的治療技術(shù)，卻已經(jīng)以一種前所未有的速180siRNA治療指南批準(zhǔn)獲得臨床研究新藥（investigationalnewdrug，IND）資格，并且進(jìn)入了臨床試驗(yàn)的就是Bevasiranib，它是美國(guó)AcsiRNA治療指南批準(zhǔn)獲得臨床研究新藥（investigat181uity制藥公司生產(chǎn)的針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的siRNA類藥物。該藥主要用于治療滲出性老年性黃斑變性。所謂滲出性老年性黃斑變性，主要是因?yàn)橐暰W(wǎng)膜后uity制藥公司生產(chǎn)的針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的182血管大量生長(zhǎng)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不可逆性視力損傷。在小鼠試驗(yàn)中對(duì)Bevasiranib進(jìn)行的臨床前研究表明，直接眼部注射該藥能夠下調(diào)Vegf基因的表達(dá)，有效減少血管大量生長(zhǎng)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不可逆性視力損傷。在小鼠試驗(yàn)183新生血管數(shù)量。

還有兩家公司也專注于用siRNA治療黃斑變性疾病，他們分別是美國(guó)的Merck’sSirnaTherapeutics公司（主要產(chǎn)品是針對(duì)VEGF新生血管數(shù)量。

還有兩家公司也專注于用siRNA治療黃斑變性184受體VEGFR1蛋白的Sirna-027）和Quark制藥公司。他們和倫敦及柏林的SilenceTherapeutics公司（即以前的SR制藥公司）合作，主要生受體VEGFR1蛋白的Sirna-027）和Quark制藥公185產(chǎn)靶定RTP801基因（又名DDIT4基因，該基因與黃斑變性疾病的進(jìn)展有關(guān)）這種缺氧誘導(dǎo)基因的siRNA產(chǎn)品RTP801i-14。RTP801i-14已經(jīng)被授權(quán)產(chǎn)靶定RTP801基因（又名DDIT4基因，該基因與黃斑變性186給英國(guó)的Prizer制藥公司，進(jìn)行I/IIA期臨床試驗(yàn)。Quark制藥公司也已經(jīng)獲得了IND資格可以進(jìn)行另一項(xiàng)臨床前試驗(yàn)，他們目前正在為這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)招募志愿者。這項(xiàng)給英國(guó)的Prizer制藥公司，進(jìn)行I/IIA期臨床試驗(yàn)。Qu187實(shí)驗(yàn)的藥物靶定TP53基因的siRNA。該藥通過(guò)抑制p53蛋白的表達(dá)能夠阻礙細(xì)胞凋亡通路，從而有望避免手術(shù)后出現(xiàn)的急性腎衰竭。

與此同時(shí)，美國(guó)的Calando實(shí)驗(yàn)的藥物靶定TP53基因的siRNA。該藥通過(guò)抑制p53蛋188制藥公司也開始了新藥的臨床試驗(yàn)項(xiàng)目。他們實(shí)驗(yàn)的新藥是用于治療實(shí)體瘤的靶定核糖核苷酸還原酶RRM2（該酶參與DNA的合成）亞基的siRNA。值得一提的是，這是第一制藥公司也開始了新藥的臨床試驗(yàn)項(xiàng)目。他們實(shí)驗(yàn)的新藥是用于治療189項(xiàng)使用受體介導(dǎo)遞送方式的siRNA臨床試驗(yàn)，該產(chǎn)品被連接有轉(zhuǎn)鐵蛋白的環(huán)糊精顆粒包裹。這樣，藥物就只會(huì)被細(xì)胞表面表達(dá)有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的細(xì)胞攝取，而轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在腫瘤項(xiàng)使用受體介導(dǎo)遞送方式的siRNA臨床試驗(yàn)，該產(chǎn)品被連接有轉(zhuǎn)190細(xì)胞表面表達(dá)量就非常高。

Acuity制藥公司與Merck公司旗下的SirnaTherapeutics公司合作進(jìn)行的臨床藥物試驗(yàn)成功地穩(wěn)定了患者的病情，阻止了細(xì)胞表面表達(dá)量就非常高。

Acuity制藥公司與Merck公191病情進(jìn)一步加重，明顯改善了患者的視力，而且還沒(méi)有副作用和不良反應(yīng)。這些成果讓我們對(duì)玻璃體內(nèi)注射siRNA這種治療方法充滿了信心。但是，Kleinman等人的報(bào)道病情進(jìn)一步加重，明顯改善了患者的視力，而且還沒(méi)有副作用和不良192給我們當(dāng)頭潑了一盆冷水。Kleinman等人認(rèn)為，患者新生血管數(shù)量的減少并不是因?yàn)閟iRNA特異性的基因沉默作用，而是因?yàn)樗翘禺愋缘丶せ盍薚LR3受體，繼而導(dǎo)給我們當(dāng)頭潑了一盆冷水。Kleinman等人認(rèn)為，患者新生血193致γ干擾素和白介素12活化，從而下調(diào)了VEGF因子的表達(dá)。換句話來(lái)說(shuō)，特異性的siRNA藥物和非特異性的siRNA對(duì)照藥物都能因?yàn)閟iRNA與TLR3之間的相互致γ干擾素和白介素12活化，從而下調(diào)了VEGF因子的表達(dá)。換194作用而產(chǎn)生這種非特異性的血管生成抑制作用。而且，這種非特異性的效應(yīng)與細(xì)胞對(duì)siRNA分子的攝取作用無(wú)關(guān)，同時(shí)由于TLR3蛋白參與細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路，因此這也讓我作用而產(chǎn)生這種非特異性的血管生成抑制作用。而且，這種非特異性195們對(duì)siRNA療法的安全性問(wèn)題感到了擔(dān)憂。

美國(guó)Alnylam制藥公司是一家專業(yè)的siRNA制藥公司，他們的主打產(chǎn)品ALN-RSV01主要針對(duì)呼吸道合胞病們對(duì)siRNA療法的安全性問(wèn)題感到了擔(dān)憂。

美國(guó)Alnyl196毒感染（在美國(guó)每年有大約30萬(wàn)人會(huì)感染呼吸道合胞病毒）。它可以沉默病毒復(fù)制過(guò)程中必需的病毒核衣殼蛋白編碼基因N基因。ALN-RSV01也是第一款進(jìn)入臨床試驗(yàn)的抗毒感染（在美國(guó)每年有大約30萬(wàn)人會(huì)感染呼吸道合胞病毒）。它可197病毒siRNA產(chǎn)品，目前人們已經(jīng)計(jì)劃將試驗(yàn)對(duì)象擴(kuò)展到兒科患者。就現(xiàn)有的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，ALN-RSV01的療效非常好，而且志愿者對(duì)它的耐受性也非常高。最近，Aln病毒siRNA產(chǎn)品，目前人們已經(jīng)計(jì)劃將試驗(yàn)對(duì)象擴(kuò)展到兒科患者198ylam制藥公司又與KyowaHakkoKogyo結(jié)成了獨(dú)家合作關(guān)系，共同在日本和其他亞洲國(guó)家研發(fā)商業(yè)化的ALN-RSV01產(chǎn)品。

Alnylam制藥公司同時(shí)ylam制藥公司又與KyowaHakkoKogyo結(jié)成了獨(dú)家199也在開發(fā)一系列治療高膽固醇血癥、亨廷頓舞蹈?。ㄅc美國(guó)Medtronic共同開發(fā)）、丙型肝炎病毒（與美國(guó)Isis制藥公司共同開發(fā)）、進(jìn)行性多病灶腦白質(zhì)?。ㄅc美國(guó)B也在開發(fā)一系列治療高膽固醇血癥、亨廷頓舞蹈?。ㄅc美國(guó)Medt200iogenIdec公司共同開發(fā)）以及流感（與瑞士Novartis制藥公司共同開發(fā)）等疾病的siRNA產(chǎn)品。

國(guó)際雅-雷二氏綜合征協(xié)會(huì)（TheInternatiiogenIdec公司共同開發(fā)）以及流感（與瑞士Novart201onalPachyonychiaCongenitaConsortium，IPCC）也正與美國(guó)TransDerm公司合作，共同開發(fā)治療雅-雷二氏綜合征的siRNAonalPachyonychiaCongenitaConso202產(chǎn)品。他們希望該產(chǎn)品能夠“糾正”患者角蛋白的合成，從而達(dá)到治療這種罕見的皮膚疾病的目的。

美國(guó)希望之城醫(yī)療中心（TheCityofHopeNationalMe產(chǎn)品。他們希望該產(chǎn)品能夠“糾正”患者角蛋白的合成，從而達(dá)到治203dicalCenter）正在與澳大利亞Benitec公司合作開發(fā)一款治療艾滋病淋巴瘤的藥物。該藥物是一款使用了PolIII啟動(dòng)子載體的shRNA類藥物，主要靶定dicalCenter）正在與澳大利亞Benitec公司合作204HIV病毒的tat基因和rev基因的共有外顯子序列。它使用的載體是基于HIV病毒的一種慢病毒載體，同時(shí)在載體上還插入了另外兩個(gè)RNA抗HIV基因，最后通過(guò)該載體HIV病毒的tat基因和rev基因的共有外顯子序列。它使用的205將shRNA基因?qū)胙焊杉?xì)胞。在臨床試驗(yàn)中，通過(guò)自體骨髓移植方式將這種經(jīng)過(guò)基因改造的血液干細(xì)胞輸入HIV病毒感染患者體內(nèi)，看看是否能夠起到治療艾滋病相關(guān)骨髓瘤將shRNA基因?qū)胙焊杉?xì)胞。在臨床試驗(yàn)中，通過(guò)自體骨髓移206的作用。到目前為止已經(jīng)有四位患者接受了這種治療。

正如前面提到的那樣，在siRNA藥物研發(fā)領(lǐng)域合作已成為非常普遍的現(xiàn)象。通過(guò)合作可以獲得更多的好處，比如獲得更的作用。到目前為止已經(jīng)有四位患者接受了這種治療。

正如前面提207多的科研資金，縮短最后藥物成品上市的時(shí)間等等。

有一些公司，比如美國(guó)RegulusTherapeutics公司等則將目光投向了miRNA。丹麥Santaris多的科研資金，縮短最后藥物成品上市的時(shí)間等等。

有一些公司，208制藥公司最近也開始為他們靶定人體miRNA分子（miR-122）的新藥開始了I期臨床試驗(yàn)項(xiàng)目。在該項(xiàng)藥物試驗(yàn)里，miR-122是被下調(diào)的靶標(biāo)，被試驗(yàn)的藥物是抗m制藥公司最近也開始為他們靶定人體miRNA分子（miR-12209iRNA的鎖核酸藥物SPC3649。鎖核酸是一種骨架被修飾過(guò)的寡核苷酸分子，經(jīng)過(guò)修飾之后它能更好地與底物雜交，避免底物被核酸酶降解。SPC3649最終的目的是希iRNA的鎖核酸藥物SPC3649。鎖核酸是一種骨架被修飾過(guò)210望能夠治療丙型肝炎患者，因?yàn)閙iR-122可以促進(jìn)丙型肝炎病毒復(fù)制。下調(diào)miR-122分子還能用于治療高膽固醇血癥患者。直接靶定在心臟里表達(dá)的miRNA分子，比望能夠治療丙型肝炎患者，因?yàn)閙iR-122可以促進(jìn)丙型肝炎病211如miR-208（它能夠調(diào)控心臟肥大和纖維化）等也會(huì)達(dá)到治療目的，因?yàn)樵卺t(yī)療實(shí)踐中早就發(fā)現(xiàn)直接往靶器官里給藥是可行的。

miRNA功能的獲得或缺失與各種疾病的如miR-208（它能夠調(diào)控心臟肥大和纖維化）等也會(huì)達(dá)到治療212發(fā)生發(fā)展都有著密切的關(guān)系。蛋白質(zhì)功能既可以直接也可以間接地受miRNA分子的調(diào)控，因此，miRNA表達(dá)水平的些許改變也會(huì)對(duì)基因表達(dá)調(diào)控帶來(lái)巨大的影響。在因?yàn)閙i發(fā)生發(fā)展都有著密切的關(guān)系。蛋白質(zhì)功能既可以直接也可以間接地受213RNA表達(dá)水平改變而造成的疾病中，我們可以設(shè)想是否如此，如果能使miRNA表達(dá)水平恢復(fù)正常，那么就應(yīng)該能夠治愈該疾病呢？那么如果是這樣，當(dāng)miRNA表達(dá)水平過(guò)高RNA表達(dá)水平改變而造成的疾病中，我們可以設(shè)想是否如此，如果214時(shí)我們就對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性下調(diào)，如果表達(dá)水平過(guò)低我們就往細(xì)胞內(nèi)注入一些類似的miRNA模擬物。不過(guò)要達(dá)到這個(gè)目的，我們現(xiàn)有的小RNA遞送系統(tǒng)的特異性和有效性都還有待時(shí)我們就對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性下調(diào)，如果表達(dá)水平過(guò)低我們就往細(xì)胞內(nèi)注215提高。另外，要想對(duì)目標(biāo)miRNA分子表達(dá)水平進(jìn)行精細(xì)、準(zhǔn)確的調(diào)控并非一件容易的工作，而且人們現(xiàn)在還不清楚能否精確地只對(duì)一個(gè)miRNA分子施加影響而不會(huì)“傷及”同提高。另外，要想對(duì)目標(biāo)miRNA分子表達(dá)水平進(jìn)行精細(xì)、準(zhǔn)確的216一miRNA分子家族中的其它成員。

在實(shí)際治療時(shí)，不論是上調(diào)還是下調(diào)miRNA的功能，我們都還應(yīng)該考慮到miRNA分子調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜程度。要知道一個(gè)miRNA一miRNA分子家族中的其它成員。

在實(shí)際治療時(shí)，不論是上調(diào)217分子就可以調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，因此我們哪怕對(duì)一個(gè)miRNA分子進(jìn)行調(diào)控也要特別小心。

將siRNA分子用于臨床治療會(huì)產(chǎn)生很多安全性問(wèn)題。完成了最初分子就可以調(diào)控?cái)?shù)百個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，因此我們哪怕對(duì)一個(gè)mi218的試驗(yàn)之后，有很多報(bào)道都指出了這種新興療法可能存在很多潛在的安全問(wèn)題。最早報(bào)道的是在一項(xiàng)小鼠試驗(yàn)中，使用PolIII啟動(dòng)子載體在肝臟中表達(dá)shRNA進(jìn)行治療，結(jié)的試驗(yàn)之后，有很多報(bào)道都指出了這種新興療法可能存在很多潛在的219果導(dǎo)致試驗(yàn)小鼠死亡。具體的致死機(jī)制現(xiàn)在還不清楚，但是至少有部分原因可能是因?yàn)樨?fù)責(zé)將miRNA分子從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運(yùn)因子輸出蛋白5（exportin5）出現(xiàn)果導(dǎo)致試驗(yàn)小鼠死亡。具體的致死機(jī)制現(xiàn)在還不清楚，但是至少有部220了飽和?，F(xiàn)在其它試驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明很多參與RNAi處理過(guò)程的因子在細(xì)胞大量表達(dá)外源性siRNA時(shí)都會(huì)被這些小RNA分子所飽和，因此就無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)正常的細(xì)胞內(nèi)源性miRN了飽和?，F(xiàn)在其它試驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明很多參與RNAi處理過(guò)程的因子221A分子。由于每一個(gè)細(xì)胞miRNA都能夠調(diào)控上百種基因的表達(dá)，因此對(duì)miRNA途徑哪怕只帶來(lái)一點(diǎn)小小的擾動(dòng)也會(huì)造成非常嚴(yán)重的后果。

要解決這個(gè)問(wèn)題有一種辦法就是A分子。由于每一個(gè)細(xì)胞miRNA都能夠調(diào)控上百種基因的表達(dá)，222設(shè)計(jì)能被Dicer酶切割的外源性siRNA（即增加siRNA的長(zhǎng)度），這樣就能在達(dá)到同樣治療效果的前提下使用最低劑量的siRNA藥物。這些RNA分子經(jīng)過(guò)Dice設(shè)計(jì)能被Dicer酶切割的外源性siRNA（即增加siRNA223r酶切割之后就進(jìn)入了RNAi途徑，這樣相比直接使用外源性的21nt的siRNA藥物通常都能夠以更低的劑量達(dá)到更好的基因沉默效果。雖然少量的siRNA分子應(yīng)該不足r酶切割之后就進(jìn)入了RNAi途徑，這樣相比直接使用外源性的2224以飽和整個(gè)RNAi體系，但是它們也能夠與其它miRNA競(jìng)爭(zhēng)RISC復(fù)合體進(jìn)入位點(diǎn)。這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)造成什么樣的遠(yuǎn)期結(jié)果現(xiàn)在還不清楚。

使用微陣列芯片可以很明顯地發(fā)現(xiàn)以飽和整個(gè)RNAi體系，但是它們也能夠與其它miRNA競(jìng)爭(zhēng)R225，往胞內(nèi)導(dǎo)入外源性siRNA分子之后會(huì)改變靶基因的表達(dá)水平，但同時(shí)也能改變其它非靶基因的表達(dá)狀況，因?yàn)閮H憑6、7個(gè)核苷酸互補(bǔ)序列的結(jié)合就會(huì)通過(guò)一種miRNA樣機(jī)，往胞內(nèi)導(dǎo)入外源性siRNA分子之后會(huì)改變靶基因的表達(dá)水平，226制產(chǎn)生特異性的脫靶效應(yīng)。不過(guò)，微陣列芯片只能夠反映mRNA水平的改變，不能夠反映翻譯水平的改變，因此我們還不能明確這種脫靶效應(yīng)會(huì)造成多大的影響。由于使用人工合成制產(chǎn)生特異性的脫靶效應(yīng)。不過(guò)，微陣列芯片只能夠反映mRNA水227的siRNA只能短期抑制細(xì)胞基因的表達(dá)，因此在臨床實(shí)踐中，這種特異性的脫靶效應(yīng)可能還不是一個(gè)大問(wèn)題。不過(guò)無(wú)論如何，在進(jìn)行適當(dāng)?shù)亩拘栽囼?yàn)時(shí)我們都應(yīng)該考慮siRNA的siRNA只能短期抑制細(xì)胞基因的表達(dá)，因此在臨床實(shí)踐中，這228與非靶基因mRNA3端UTR區(qū)域結(jié)合后可能出現(xiàn)的問(wèn)題。

在進(jìn)行siRNA設(shè)計(jì)的時(shí)候可以采取一些策略，盡量減少這種脫靶情況的發(fā)生。比如，在siRNA雙鏈分子中引與非靶基因mRNA3端UTR區(qū)域結(jié)合后可能出現(xiàn)的問(wèn)題。

在進(jìn)229入2’-O-Me修飾或者進(jìn)行DNA替換都能夠明顯降低脫靶現(xiàn)象的發(fā)生率。改變熱穩(wěn)定性或者封閉正義鏈5端的磷酸化位點(diǎn)，這都能改善反義鏈選擇過(guò)程，這對(duì)于降低脫靶率也是入2’-O-Me修飾或者進(jìn)行DNA替換都能夠明顯降低脫靶現(xiàn)象230非常有幫助的。

RNAi機(jī)制是一條非常保守的作用機(jī)制，它最初的作用可能是幫助物種抵抗病毒的感染。如果是這樣，我們也就不會(huì)感到奇怪，為什么在某些情況下siRNA非常有幫助的。

RNAi機(jī)制是一條非常保守的作用機(jī)制，它最初231能夠起到Toll樣受體激動(dòng)劑的作用；某些序列，比如富含尿嘧啶的序列或者富含鳥嘌呤及尿嘧啶的序列能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的免疫應(yīng)答。siRNA能夠刺激細(xì)胞出現(xiàn)免疫應(yīng)答不僅是因能夠起到Toll樣受體激動(dòng)劑的作用；某些序列，比如富含尿嘧啶232為它的序列，還可能是因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)、所使用的遞送系統(tǒng)或者細(xì)胞類型等等因素。雖然這種免疫刺激在某些情況下可能會(huì)有所幫助，但是通常來(lái)說(shuō)我們都不希望它發(fā)生。上面提到的T為它的序列，還可能是因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)、所使用的遞送系統(tǒng)或者細(xì)胞類233LR3反應(yīng)對(duì)VEGF或VEGF受體起到的非序列特異性調(diào)控作用，以及另一起報(bào)道中提到的在鼠類動(dòng)物模型中，靶定巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（migrationinhibitLR3反應(yīng)對(duì)VEGF或VEGF受