RNAi技術及其應用課件

現(xiàn)在幾乎每天都會有文章對各種小RNA與機體發(fā)育之間關系的進展進行報道。而精明的生物技術公司也正在以驚人的速度積極地將RNAi的相關知識運用于藥物篩選研究。借助現(xiàn)現(xiàn)在幾乎每天都會有文章對各種小RNA與機體發(fā)育之間關系的進展1今先進的測序技術，人們鑒定出了多種新型小RNA，而隨后，它們的強大功能將會繼續(xù)吸引我們研究下去，相信研究結果一定會讓我們感到驚喜。

雙鏈RNA能夠以序列特異性今先進的測序技術，人們鑒定出了多種新型小RNA，而隨后，它們2的方式導致基因沉默的機制自發(fā)現(xiàn)起就對生物學的發(fā)展產生了巨大影響，它揭示了人們以前未曾注意到的基因表達調控機制。這種機制被稱為RNA干擾（RNAi）或者RNA沉默的方式導致基因沉默的機制自發(fā)現(xiàn)起就對生物學的發(fā)展產生了巨大影3（RNAsilencing）。其核心內容是：一些非編碼小RNA分子（smallnon-codingRNA，20~30nt）進入細胞后與序列互補的信使RNA靶標配（RNAsilencing）。其核心內容是：一些非編碼小RN4對，阻止其表達。2019年9月，《自然》首次刊登了美國科學家AndrewZ.Fire與llo等人撰寫的關于RNA干擾的成果文章。時隔不久，RNAi技術取得了非凡對，阻止其表達。2019年9月，《自然》首次刊登了美國科學家5的成就。人們逐漸意識到，RNAi將會對生物學的發(fā)展帶來深遠的影響。毫無疑問，打開了RNAi這一潘多拉盒子的AndrewFire與CraigMello獲得了200的成就。人們逐漸意識到，RNAi將會對生物學的發(fā)展帶來深遠的66年的生理學或醫(yī)學諾貝爾獎。諾貝爾委員會成員GoranHansson在該年的頒獎詞中說道：“RNAi為我們了解生命提供了新視角，并為醫(yī)學發(fā)展提供了新工具?！辈贿^6年的生理學或醫(yī)學諾貝爾獎。諾貝爾委員會成員GoranHan7，RNAi的故事才剛剛開始，許多懸念有待人們逐個解開。

細胞內表達的長dsRNA或外源性長dsRNA（可以是由正鏈轉錄產物和負鏈轉錄產物配對而成的結構，也可以，RNAi的故事才剛剛開始，許多懸念有待人們逐個解開。

細胞8是ssRNA內形成的莖環(huán)結構）在Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的雙鏈解開，其中一條鏈被優(yōu)先裝載入RNA誘導沉默復合物（RISC）中；裝載了小RNA是ssRNA內形成的莖環(huán)結構）在Dicer酶的作用下降解成小9的RISC復合物就會在細胞內積極地“搜索”轉錄組，探尋潛在的RNA靶分子。被裝載入RISC復合物當中的向導鏈（guidestrand）--ssRNA隨后引導RI的RISC復合物就會在細胞內積極地“搜索”轉錄組，探尋潛在的10SC復合物當中的核酸內切酶（有時被稱作“切割機”，現(xiàn)在人們知道它是Argonaute蛋白）反復剪切擁有向導鏈同源序列的mRNA靶分子。向導鏈就是通過這種方式來發(fā)SC復合物當中的核酸內切酶（有時被稱作“切割機”，現(xiàn)在人們知11揮特異性的RNAi作用的；

盡管不同生物體內，參與RNAi途徑的蛋白和相關機制各有不同，但是它們的干擾策略卻驚人地一致。在所有被研究過的物種中，RNAi都揮特異性的RNAi作用的；

盡管不同生物體內，參與RNAi12包含兩種主要的組成成分，即決定干擾特異性的小RNA和發(fā)揮抑制作用的Argonaute蛋白。

根據RISC復合物中Argonaute蛋白的天然活性以及小RNA與包含兩種主要的組成成分，即決定干擾特異性的小RNA和發(fā)揮抑制13其靶標mRNA之間互補程度的不同，RISC復合物與靶標mRNA結合后會發(fā)揮幾種不同的作用，它可以控制mRNA的穩(wěn)定性和蛋白質合成、維持基因組完整性，或產生一系列其靶標mRNA之間互補程度的不同，RISC復合物與靶標mRN14特異性的小RNA。隨著高通量測序技術的出現(xiàn)以及生物信息學的不斷進步，科研人員得以對小RNA的起源及其靶向機制開展更深入的研究。他們發(fā)現(xiàn)，在各個不同的物種當中，R特異性的小RNA。隨著高通量測序技術的出現(xiàn)以及生物信息學的不15NAi系統(tǒng)獲得了不同程度的改進，包括進化出“內置式的”分子“刻度尺”，用來控制小RNA的大小和結構，從而挑選出小dsRNA中最合適的那條單鏈分子進入下一步驟；或NAi系統(tǒng)獲得了不同程度的改進，包括進化出“內置式的”分子“16進化出防止“脫靶”現(xiàn)象出現(xiàn)的機制等等。

科研人員還發(fā)現(xiàn)RNAi通路的活性會在各個水平（從小RNA的生成到RISC復合物的沉默模式）受到嚴密調控。

各種不同的進化出防止“脫靶”現(xiàn)象出現(xiàn)的機制等等。

科研人員還發(fā)現(xiàn)RNA17RNA沉默途徑之間存在競爭關系，比如黑腹果蠅中的endo-siRNA和miRNA之間就相互競爭LOQS。這種競爭機制就是RNAi途徑中決定每一個階段里如何發(fā)生調RNA沉默途徑之間存在競爭關系，比如黑腹果蠅中的endo-s18控的關鍵步驟。很多植物和動物病毒都會編碼抑制蛋白來抑制宿主細胞的RNAi途徑，使得這些調控機制無法在各個不同階段發(fā)揮正常作用。細胞的蛋白質同樣也能夠調控RNAi控的關鍵步驟。很多植物和動物病毒都會編碼抑制蛋白來抑制宿主細19。比如，在人體胚胎細胞中，miRNAlet-7分子（一種抑癌分子，同時也是一種細胞周期調控分子）的生成過程就是一條轉錄后被抑制的過程，該途徑被多潛能因子LIN2。比如，在人體胚胎細胞中，miRNAlet-7分子（一種抑癌208所抑制。LIN28蛋白可以阻止pri-let-7分子在微處理器復合物中的剪切過程及后續(xù)由Dicer蛋白負責的pre-let-7前體分子的處理過程。不過，人體同8所抑制。LIN28蛋白可以阻止pri-let-7分子在微處21時存在另一條路徑。轉化生長因子β（TGF-β）和生長因子家族中的骨形成蛋白（BMP）都能促進miR-21這種促癌分子的生成。這是因為這些蛋白能夠促進DROSHA時存在另一條路徑。轉化生長因子β（TGF-β）和生長因子家族22將pri-miR-21轉化成pre-miR-21。更確切地說，SMAD蛋白家族成員TGF-β和BMP信號轉換因子與RNA解旋酶p68組成的復合物一起被招募至pr將pri-miR-21轉化成pre-miR-21。更確切地說23i-miR-21，促進pre-miRNA形成。另外，不均一核糖核酸RNPA1蛋白（heterogeneousnuclearRNPA1，hnRNPA1）這種著名的i-miR-21，促進pre-miRNA形成。另外，不均一核24前體mRNA分子剪切調控因子也會幫助DROSHA發(fā)揮作用，有效地生成pre-miR-18，這可能是由hnRNPA1蛋白能夠重新折疊發(fā)夾結構，或者直接與pri-m前體mRNA分子剪切調控因子也會幫助DROSHA發(fā)揮作用，有25iRNA結合，為DROSHA構建出一個酶切位點而造成的。這也說明在pri-miRNA分子中，某些發(fā)夾結構可能是在pri-miRNA分子與RNA伴侶蛋白結合之后才iRNA結合，為DROSHA構建出一個酶切位點而造成的。這也26會形成并被剪切的。

RISC復合體的活性同樣能夠被調控。在擬南芥中，非編碼基因IPS1中含有的一段基序能夠與miR-399序列互補，但是它們之間的互補配對過程會形成并被剪切的。

RISC復合體的活性同樣能夠被調控。在擬27卻被該miRNA分子中酶切位點處的一段錯配形成的環(huán)狀結構給破壞了。這樣，IPS1基因的mRNA產物不僅沒能被miR-399降解，反而還大量“扣押了”miR-39卻被該miRNA分子中酶切位點處的一段錯配形成的環(huán)狀結構給破289分子。因此，如果IPS1基因大量表達會使得胞內“積聚”大量miR-399分子的靶標--PHO2基因mRNA。這種靶標之間的相似性會給RNA調控網絡帶來不可預料9分子。因此，如果IPS1基因大量表達會使得胞內“積聚”大量29的復雜性。我們預測，最近在人體細胞中發(fā)現(xiàn)的大量mRNA樣非編碼RNA分子（mRNA-likenon-codingRNA）可能會在小RNA-Argonaute蛋白的復雜性。我們預測，最近在人體細胞中發(fā)現(xiàn)的大量mRNA樣非編30復合體調控過程中起到“減速器（attenuator）”的作用。

RNAi機制中最引人注目的亮點就是僅由20~30nt組成的小dsRNA。它們是由RNaseII復合體調控過程中起到“減速器（attenuator）”的作用31I酶（可以是Dicer單獨發(fā)揮作用，也可以是Drosha和Dicer共同發(fā)揮作用）剪切長RNA得到的產物。按照小RNA的來源前體的不同，我們可以將其分為兩大類：I酶（可以是Dicer單獨發(fā)揮作用，也可以是Drosha和D32一是小干擾RNA（siRNA），它是細胞為了應對病毒感染或者其它人工導入分子而剪切外源性長dsRNA前體而生成；二是miRNA，它由細胞運用其自身基因組編碼的莖一是小干擾RNA（siRNA），它是細胞為了應對病毒感染或者33環(huán)結構加工而來。借助高通量測序技術，人們發(fā)現(xiàn)了好幾種內源性小RNA，包括最近發(fā)現(xiàn)的PIWI相互作用RNA（PIWI-interactingRNA,piRNA）和環(huán)結構加工而來。借助高通量測序技術，人們發(fā)現(xiàn)了好幾種內源性小34內源性siRNA（esiRNA）。

不過，這些小RNA子都有一個共同的特征，那就是它們都能與Argonaute蛋白相結合，從而發(fā)揮它們的靶向作用。

簡述內源性siRNA（esiRNA）。

不過，這些小RNA子都有35小RNA分子的形成過程以及RNA沉默的機制

a、能夠形成dsRNA結構或者發(fā)夾結構的天然轉錄產物是形成小RNA分子的前體物質。這些雙鏈結構的RNA分子經由Dr小RNA分子的形成過程以及RNA沉默的機制

a、能夠形成ds36osha或Dicer等RNaseIII處理之后就能得到小dsRNA分子。如果這些小dsRNA分子之間的配對情況非常好，如圖中左側所示，那么就會經由Argonauosha或Dicer等RNaseIII處理之后就能得到小ds37te蛋白的酶切活性進行進一步處理，生成小ssRNA產物。如果像圖中右側所示的那樣，小dsRNA分子之間的配對情況不是非常好，比如出現(xiàn)了錯配或者有環(huán)狀凸出，那么它te蛋白的酶切活性進行進一步處理，生成小ssRNA產物。如果38們就不能被Argonaute蛋白酶切處理，只能經由一種不依賴酶切活性的方式生成最終的小ssRNA產物。目前，我們對于究竟是哪種蛋白參與其中來發(fā)揮解鏈活性還不得而們就不能被Argonaute蛋白酶切處理，只能經由一種不依賴39知。生成的小ssRNA分子隨后會與Argonaute蛋白結合，但究竟是哪一條單鏈分子（正鏈或負鏈）結合到Argonaute蛋白上則取決于它們的熱力學穩(wěn)定性。結合知。生成的小ssRNA分子隨后會與Argonaute蛋白結合40了單鏈小RNA分子的Argonaute蛋白會根據單鏈RNA分子的序列尋找能夠與其互補配對的mRNA分子，并與之結合，然后抑制它的表達。而究竟采用哪種機制沉默該基了單鏈小RNA分子的Argonaute蛋白會根據單鏈RNA分41因的表達，比如是直接降解目的mRNA還是僅僅抑制其表達，在很大程度上取決于mRNA和小RNA分子之間的互補程度。

b、在秀麗隱桿線蟲和某些植物細胞中發(fā)現(xiàn)，某些因的表達，比如是直接降解目的mRNA還是僅僅抑制其表達，在很42小RNA分子還可以通過RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）來合成。有一些天然轉錄產物（通常它們都是異常的轉錄產物）都是這種依賴RdRP途徑合成的小RNA分子的前小RNA分子還可以通過RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）來43體來源物質。因此，缺乏RdRP活性的物種，比如哺乳動物和黑腹果蠅等物種體內是不會發(fā)現(xiàn)這種小RNA合成機制的。經過這種途徑生成的小RNA分子隨后同樣也是與Argo體來源物質。因此，缺乏RdRP活性的物種，比如哺乳動物和黑腹44naute蛋白相結合，發(fā)揮抑制靶基因表達的作用。

c、有一類Argonaute蛋白只存在于生殖細胞當中，它們被稱作PIWI亞科蛋白，它們可以與piRNA結合，naute蛋白相結合，發(fā)揮抑制靶基因表達的作用。

c、有一類45隨后形成的復合物能夠沉默轉座子。單鏈前體RNA分子在未知蛋白的作用下經過初步處理過程形成piRNA。在生殖細胞內，PIWI蛋白在沉默轉座子的同時還能大量擴增pi隨后形成的復合物能夠沉默轉座子。單鏈前體RNA分子在未知蛋白46RNA分子，這個過程被稱作進一步處理過程，或者叫ping-pong擴增環(huán)路反應，這種反應在包括小鼠和斑馬魚在內的多個物種體內都廣泛存在，非常保守。在這步反應當中RNA分子，這個過程被稱作進一步處理過程，或者叫ping-p47，PIWI蛋白的剪切活性會不斷剪切轉座子轉錄產物（即piRNA的前體物質）形成piRNA的5端，但是piRNA的3端是由什么蛋白質負責生成的，我們現(xiàn)在還不清楚。，PIWI蛋白的剪切活性會不斷剪切轉座子轉錄產物（即piRN48

siRNA作為一種新興的治療技術，卻已經以一種前所未有的速度邁進了臨床試驗階段。下面，我們將介紹幾種已經進入臨床試驗階段的人體疾病RNAi療法。

第一個被

siRNA作為一種新興的治療技術，卻已經以一種前所未有的速49siRNA治療指南批準獲得臨床研究新藥（investigationalnewdrug，IND）資格，并且進入了臨床試驗的就是Bevasiranib，它是美國AcsiRNA治療指南批準獲得臨床研究新藥（investigat50uity制藥公司生產的針對血管內皮細胞生長因子（VEGF）的siRNA類藥物。該藥主要用于治療滲出性老年性黃斑變性。所謂滲出性老年性黃斑變性，主要是因為視網膜后uity制藥公司生產的針對血管內皮細胞生長因子（VEGF）的51血管大量生長，導致患者出現(xiàn)嚴重的不可逆性視力損傷。在小鼠試驗中對Bevasiranib進行的臨床前研究表明，直接眼部注射該藥能夠下調Vegf基因的表達，有效減少血管大量生長，導致患者出現(xiàn)嚴重的不可逆性視力損傷。在小鼠試驗52新生血管數(shù)量。

還有兩家公司也專注于用siRNA治療黃斑變性疾病，他們分別是美國的Merck’sSirnaTherapeutics公司（主要產品是針對VEGF新生血管數(shù)量。

還有兩家公司也專注于用siRNA治療黃斑變性53受體VEGFR1蛋白的Sirna-027）和Quark制藥公司。他們和倫敦及柏林的SilenceTherapeutics公司（即以前的SR制藥公司）合作，主要生受體VEGFR1蛋白的Sirna-027）和Quark制藥公54產靶定RTP801基因（又名DDIT4基因，該基因與黃斑變性疾病的進展有關）這種缺氧誘導基因的siRNA產品RTP801i-14。RTP801i-14已經被授權產靶定RTP801基因（又名DDIT4基因，該基因與黃斑變性55給英國的Prizer制藥公司，進行I/IIA期臨床試驗。Quark制藥公司也已經獲得了IND資格可以進行另一項臨床前試驗，他們目前正在為這項實驗招募志愿者。這項給英國的Prizer制藥公司，進行I/IIA期臨床試驗。Qu56實驗的藥物靶定TP53基因的siRNA。該藥通過抑制p53蛋白的表達能夠阻礙細胞凋亡通路，從而有望避免手術后出現(xiàn)的急性腎衰竭。

與此同時，美國的Calando實驗的藥物靶定TP53基因的siRNA。該藥通過抑制p53蛋57制藥公司也開始了新藥的臨床試驗項目。他們實驗的新藥是用于治療實體瘤的靶定核糖核苷酸還原酶RRM2（該酶參與DNA的合成）亞基的siRNA。值得一提的是，這是第一制藥公司也開始了新藥的臨床試驗項目。他們實驗的新藥是用于治療58項使用受體介導遞送方式的siRNA臨床試驗，該產品被連接有轉鐵蛋白的環(huán)糊精顆粒包裹。這樣，藥物就只會被細胞表面表達有轉鐵蛋白受體的細胞攝取，而轉鐵蛋白受體在腫瘤項使用受體介導遞送方式的siRNA臨床試驗，該產品被連接有轉59細胞表面表達量就非常高。

Acuity制藥公司與Merck公司旗下的SirnaTherapeutics公司合作進行的臨床藥物試驗成功地穩(wěn)定了患者的病情，阻止了細胞表面表達量就非常高。

Acuity制藥公司與Merck公60病情進一步加重，明顯改善了患者的視力，而且還沒有副作用和不良反應。這些成果讓我們對玻璃體內注射siRNA這種治療方法充滿了信心。但是，Kleinman等人的報道病情進一步加重，明顯改善了患者的視力，而且還沒有副作用和不良61給我們當頭潑了一盆冷水。Kleinman等人認為，患者新生血管數(shù)量的減少并不是因為siRNA特異性的基因沉默作用，而是因為它非特異性地激活了TLR3受體，繼而導給我們當頭潑了一盆冷水。Kleinman等人認為，患者新生血62致γ干擾素和白介素12活化，從而下調了VEGF因子的表達。換句話來說，特異性的siRNA藥物和非特異性的siRNA對照藥物都能因為siRNA與TLR3之間的相互致γ干擾素和白介素12活化，從而下調了VEGF因子的表達。換63作用而產生這種非特異性的血管生成抑制作用。而且，這種非特異性的效應與細胞對siRNA分子的攝取作用無關，同時由于TLR3蛋白參與細胞內多條信號通路，因此這也讓我作用而產生這種非特異性的血管生成抑制作用。而且，這種非特異性64們對siRNA療法的安全性問題感到了擔憂。

美國Alnylam制藥公司是一家專業(yè)的siRNA制藥公司，他們的主打產品ALN-RSV01主要針對呼吸道合胞病們對siRNA療法的安全性問題感到了擔憂。

美國Alnyl65毒感染（在美國每年有大約30萬人會感染呼吸道合胞病毒）。它可以沉默病毒復制過程中必需的病毒核衣殼蛋白編碼基因N基因。ALN-RSV01也是第一款進入臨床試驗的抗毒感染（在美國每年有大約30萬人會感染呼吸道合胞病毒）。它可66病毒siRNA產品，目前人們已經計劃將試驗對象擴展到兒科患者。就現(xiàn)有的試驗結果來看，ALN-RSV01的療效非常好，而且志愿者對它的耐受性也非常高。最近，Aln病毒siRNA產品，目前人們已經計劃將試驗對象擴展到兒科患者67ylam制藥公司又與KyowaHakkoKogyo結成了獨家合作關系，共同在日本和其他亞洲國家研發(fā)商業(yè)化的ALN-RSV01產品。

Alnylam制藥公司同時ylam制藥公司又與KyowaHakkoKogyo結成了獨家68也在開發(fā)一系列治療高膽固醇血癥、亨廷頓舞蹈?。ㄅc美國Medtronic共同開發(fā)）、丙型肝炎病毒（與美國Isis制藥公司共同開發(fā)）、進行性多病灶腦白質病（與美國B也在開發(fā)一系列治療高膽固醇血癥、亨廷頓舞蹈病（與美國Medt69iogenIdec公司共同開發(fā)）以及流感（與瑞士Novartis制藥公司共同開發(fā)）等疾病的siRNA產品。

國際雅-雷二氏綜合征協(xié)會（TheInternatiiogenIdec公司共同開發(fā)）以及流感（與瑞士Novart70onalPachyonychiaCongenitaConsortium，IPCC）也正與美國TransDerm公司合作，共同開發(fā)治療雅-雷二氏綜合征的siRNAonalPachyonychiaCongenitaConso71產品。他們希望該產品能夠“糾正”患者角蛋白的合成，從而達到治療這種罕見的皮膚疾病的目的。

美國希望之城醫(yī)療中心（TheCityofHopeNationalMe產品。他們希望該產品能夠“糾正”患者角蛋白的合成，從而達到治72dicalCenter）正在與澳大利亞Benitec公司合作開發(fā)一款治療艾滋病淋巴瘤的藥物。該藥物是一款使用了PolIII啟動子載體的shRNA類藥物，主要靶定dicalCenter）正在與澳大利亞Benitec公司合作73HIV病毒的tat基因和rev基因的共有外顯子序列。它使用的載體是基于HIV病毒的一種慢病毒載體，同時在載體上還插入了另外兩個RNA抗HIV基因，最后通過該載體HIV病毒的tat基因和rev基因的共有外顯子序列。它使用的74將shRNA基因導入血液干細胞。在臨床試驗中，通過自體骨髓移植方式將這種經過基因改造的血液干細胞輸入HIV病毒感染患者體內，看看是否能夠起到治療艾滋病相關骨髓瘤將shRNA基因導入血液干細胞。在臨床試驗中，通過自體骨髓移75的作用。到目前為止已經有四位患者接受了這種治療。

正如前面提到的那樣，在siRNA藥物研發(fā)領域合作已成為非常普遍的現(xiàn)象。通過合作可以獲得更多的好處，比如獲得更的作用。到目前為止已經有四位患者接受了這種治療。

正如前面提76多的科研資金，縮短最后藥物成品上市的時間等等。

有一些公司，比如美國RegulusTherapeutics公司等則將目光投向了miRNA。丹麥Santaris多的科研資金，縮短最后藥物成品上市的時間等等。

有一些公司，77制藥公司最近也開始為他們靶定人體miRNA分子（miR-122）的新藥開始了I期臨床試驗項目。在該項藥物試驗里，miR-122是被下調的靶標，被試驗的藥物是抗m制藥公司最近也開始為他們靶定人體miRNA分子（miR-1278iRNA的鎖核酸藥物SPC3649。鎖核酸是一種骨架被修飾過的寡核苷酸分子，經過修飾之后它能更好地與底物雜交，避免底物被核酸酶降解。SPC3649最終的目的是希iRNA的鎖核酸藥物SPC3649。鎖核酸是一種骨架被修飾過79望能夠治療丙型肝炎患者，因為miR-122可以促進丙型肝炎病毒復制。下調miR-122分子還能用于治療高膽固醇血癥患者。直接靶定在心臟里表達的miRNA分子，比望能夠治療丙型肝炎患者，因為miR-122可以促進丙型肝炎病80如miR-208（它能夠調控心臟肥大和纖維化）等也會達到治療目的，因為在醫(yī)療實踐中早就發(fā)現(xiàn)直接往靶器官里給藥是可行的。

miRNA功能的獲得或缺失與各種疾病的如miR-208（它能夠調控心臟肥大和纖維化）等也會達到治療81發(fā)生發(fā)展都有著密切的關系。蛋白質功能既可以直接也可以間接地受miRNA分子的調控，因此，miRNA表達水平的些許改變也會對基因表達調控帶來巨大的影響。在因為mi發(fā)生發(fā)展都有著密切的關系。蛋白質功能既可以直接也可以間接地受82RNA表達水平改變而造成的疾病中，我們可以設想是否如此，如果能使miRNA表達水平恢復正常，那么就應該能夠治愈該疾病呢？那么如果是這樣，當miRNA表達水平過高RNA表達水平改變而造成的疾病中，我們可以設想是否如此，如果83時我們就對其進行針對性下調，如果表達水平過低我們就往細胞內注入一些類似的miRNA模擬物。不過要達到這個目的，我們現(xiàn)有的小RNA遞送系統(tǒng)的特異性和有效性都還有待時我們就對其進行針對性下調，如果表達水平過低我們就往細胞內注84提高。另外，要想對目標miRNA分子表達水平進行精細、準確的調控并非一件容易的工作，而且人們現(xiàn)在還不清楚能否精確地只對一個miRNA分子施加影響而不會“傷及”同提高。另外，要想對目標miRNA分子表達水平進行精細、準確的85一miRNA分子家族中的其它成員。

在實際治療時，不論是上調還是下調miRNA的功能，我們都還應該考慮到miRNA分子調控機制的復雜程度。要知道一個miRNA一miRNA分子家族中的其它成員。

在實際治療時，不論是上調86分子就可以調控數(shù)百個蛋白質的表達水平，因此我們哪怕對一個miRNA分子進行調控也要特別小心。

將siRNA分子用于臨床治療會產生很多安全性問題。完成了最初分子就可以調控數(shù)百個蛋白質的表達水平，因此我們哪怕對一個mi87的試驗之后，有很多報道都指出了這種新興療法可能存在很多潛在的安全問題。最早報道的是在一項小鼠試驗中，使用PolIII啟動子載體在肝臟中表達shRNA進行治療，結的試驗之后，有很多報道都指出了這種新興療法可能存在很多潛在的88果導致試驗小鼠死亡。具體的致死機制現(xiàn)在還不清楚，但是至少有部分原因可能是因為負責將miRNA分子從核內轉運到胞質中的轉運因子輸出蛋白5（exportin5）出現(xiàn)果導致試驗小鼠死亡。具體的致死機制現(xiàn)在還不清楚，但是至少有部89了飽和。現(xiàn)在其它試驗數(shù)據也表明很多參與RNAi處理過程的因子在細胞大量表達外源性siRNA時都會被這些小RNA分子所飽和，因此就無法轉運正常的細胞內源性miRN了飽和。現(xiàn)在其它試驗數(shù)據也表明很多參與RNAi處理過程的因子90A分子。由于每一個細胞miRNA都能夠調控上百種基因的表達，因此對miRNA途徑哪怕只帶來一點小小的擾動也會造成非常嚴重的后果。

要解決這個問題有一種辦法就是A分子。由于每一個細胞miRNA都能夠調控上百種基因的表達，91設計能被Dicer酶切割的外源性siRNA（即增加siRNA的長度），這樣就能在達到同樣治療效果的前提下使用最低劑量的siRNA藥物。這些RNA分子經過Dice設計能被Dicer酶切割的外源性siRNA（即增加siRNA92r酶切割之后就進入了RNAi途徑，這樣相比直接使用外源性的21nt的siRNA藥物通常都能夠以更低的劑量達到更好的基因沉默效果。雖然少量的siRNA分子應該不足r酶切割之后就進入了RNAi途徑，這樣相比直接使用外源性的293以飽和整個RNAi體系，但是它們也能夠與其它miRNA競爭RISC復合體進入位點。這種競爭會造成什么樣的遠期結果現(xiàn)在還不清楚。

使用微陣列芯片可以很明顯地發(fā)現(xiàn)以飽和整個RNAi體系，但是它們也能夠與其它miRNA競爭R94，往胞內導入外源性siRNA分子之后會改變靶基因的表達水平，但同時也能改變其它非靶基因的表達狀況，因為僅憑6、7個核苷酸互補序列的結合就會通過一種miRNA樣機，往胞內導入外源性siRNA分子之后會改變靶基因的表達水平，95制產生特異性的脫靶效應。不過，微陣列芯片只能夠反映mRNA水平的改變，不能夠反映翻譯水平的改變，因此我們還不能明確這種脫靶效應會造成多大的影響。由于使用人工合成制產生特異性的脫靶效應。不過，微陣列芯片只能夠反映mRNA水96的siRNA只能短期抑制細胞基因的表達，因此在臨床實踐中，這種特異性的脫靶效應可能還不是一個大問題。不過無論如何，在進行適當?shù)亩拘栽囼灂r我們都應該考慮siRNA的siRNA只能短期抑制細胞基因的表達，因此在臨床實踐中，這97與非靶基因mRNA3端UTR區(qū)域結合后可能出現(xiàn)的問題。

在進行siRNA設計的時候可以采取一些策略，盡量減少這種脫靶情況的發(fā)生。比如，在siRNA雙鏈分子中引與非靶基因mRNA3端UTR區(qū)域結合后可能出現(xiàn)的問題。

在進98入2’-O-Me修飾或者進行DNA替換都能夠明顯降低脫靶現(xiàn)象的發(fā)生率。改變熱穩(wěn)定性或者封閉正義鏈5端的磷酸化位點，這都能改善反義鏈選擇過程，這對于降低脫靶率也是入2’-O-Me修飾或者進行DNA替換都能夠明顯降低脫靶現(xiàn)象99非常有幫助的。

RNAi機制是一條非常保守的作用機制，它最初的作用可能是幫助物種抵抗病毒的感染。如果是這樣，我們也就不會感到奇怪，為什么在某些情況下siRNA非常有幫助的。

RNAi機制是一條非常保守的作用機制，它最初100能夠起到Toll樣受體激動劑的作用；某些序列，比如富含尿嘧啶的序列或者富含鳥嘌呤及尿嘧啶的序列能夠誘導細胞的免疫應答。siRNA能夠刺激細胞出現(xiàn)免疫應答不僅是因能夠起到Toll樣受體激動劑的作用；某些序列，比如富含尿嘧啶101為它的序列，還可能是因為它的結構、所使用的遞送系統(tǒng)或者細胞類型等等因素。雖然這種免疫刺激在某些情況下可能會有所幫助，但是通常來說我們都不希望它發(fā)生。上面提到的T為它的序列，還可能是因為它的結構、所使用的遞送系統(tǒng)或者細胞類102LR3反應對VEGF或VEGF受體起到的非序列特異性調控作用，以及另一起報道中提到的在鼠類動物模型中，靶定巨噬細胞遷移抑制因子（migrationinhibitLR3反應對VEGF或VEGF受體起到的非序列特異性調控作用103oryfactor，Mif）的siRNA和非特異性的對照siRNA分子都能夠通過能激活蛋白激酶（PKR）的dsRNA的活性增強乳腺癌細胞的增殖能力。上述無一不提oryfactor，Mif）的siRNA和非特異性的對照si104示我們，在解釋siRNA體內實驗結果時一定要倍加仔細。

雖然我們還沒能找到一種方法可以避免所有的脫靶效應，但是可以預見，使用恰當?shù)腞NA修飾方法和遞送途徑，從示我們，在解釋siRNA體內實驗結果時一定要倍加仔細。

雖然105而使RNA分子避免接觸天然免疫系統(tǒng)的受體，我們就一定能夠解決脫靶這個問題。

所謂基因療法(genetherapy)通常是指為病人補充他所缺乏的基因產物(一般是而使RNA分子避免接觸天然免疫系統(tǒng)的受體，我們就一定能夠解決106蛋白質)。某些情況下補充過量的某種蛋白質可以起到穩(wěn)定和改善病情的作用。然而，在用基因療法治療某些疾病--例如由于病毒感染或是由于病毒基因組編碼的外源基因侵入機體蛋白質)。某些情況下補充過量的某種蛋白質可以起到穩(wěn)定和改善病107而導致的疾病時--適當關閉或是下調某個基因的表達也十分重要。癌癥就是個典型的例子，體內正常基因的不正確表達或是發(fā)生功能獲得性突變(gain-of-functio而導致的疾病時--適當關閉或是下調某個基因的表達也十分重要。108nmutation)都有可能改變細胞周期、加劇細胞增殖失控，從而引發(fā)癌變。

miRNA/RNAi用于基因治療的想法最初源于一些從事基因治療行業(yè)的科研人員在nmutation)都有可能改變細胞周期、加劇細胞增殖失控，109實際工作中遇到的問題，如“RNAi和miRNA介導的基因敲除之間有何區(qū)別”以及“在以前基因敲除技術并不成熟的時候，RNAi是否真的能發(fā)揮效用”。顯然，諸如此類的實際工作中遇到的問題，如“RNAi和miRNA介導的基因敲除110問題并沒有簡單或是明確的答案。即便如此，要想解決這些問題，我們首先要給出一個明確的定義，即RNAi和miRNA分子都是短小的、雙鏈RNA分子(大約21堿基對的長問題并沒有簡單或是明確的答案。即便如此，要想解決這些問題，我111度)，這些RNA分子可以在轉錄后水平上部分或完全沉默某一特定基因的表達。而該過程僅在mRNA含有小RNA同源靶序列時才會發(fā)生。

RNAi比以前各種基于基因敲除度)，這些RNA分子可以在轉錄后水平上部分或完全沉默某一特定112的基因治療法都要成功的主要原因是一切哺乳動物細胞中都存在內源性RNAi/miRNA。RNAi和miRNA通路之間存在很多顯著的異同之處，一般來說，RNAi會造成的基因治療法都要成功的主要原因是一切哺乳動物細胞中都存在內源113基因位點特異性的斷裂，而miRNA的敲除功能則源于mRNA的翻譯抑制和/或mRNA更新率的提高。小RNA和它的mRNA的靶位點完全互補匹配時會活化由RNAi引起基因位點特異性的斷裂，而miRNA的敲除功能則源于mRNA的114的斷裂途徑，而miRNA介導的抑制過程只需二者間有部分序列匹配即可。一般越低等的生物，它們的RNA越有可能通過介導相應基因染色質或DNA的修飾來觸發(fā)轉錄后的抑制的斷裂途徑，而miRNA介導的抑制過程只需二者間有部分序列匹115過程，而在哺乳動物中是否存在這一過程尚存有爭議。

人們通過對哺乳動物基因組內源miRNA基因序列進行相關研究，發(fā)現(xiàn)至少存在500個或更多不同類型的RNA調控著過程，而在哺乳動物中是否存在這一過程尚存有爭議。

人們通過對116我們機體內大約1/3的基因。這一調控過程進一步加強了生物體在發(fā)育過程、細胞周期以及免疫和代謝途徑中對基因復雜的調控網絡的控制。當然，這些miRNA是如何被控制的我們機體內大約1/3的基因。這一調控過程進一步加強了生物體在117還有待進一步探索，但現(xiàn)在已有很多科研人員嘗試研究這些生理過程的異常調節(jié)對諸如神經功能缺損、癌癥、免疫失調以及感染的發(fā)病意義。

當RNAi在一次不經意的植物轉基還有待進一步探索，但現(xiàn)在已有很多科研人員嘗試研究這些生理過程118因研究過程中首次作為一個概念被提出后，其作用機理最早由Fire、Mello等人于九十年代末在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中闡明(F因研究過程中首次作為一個概念被提出后，其作用機理最早由Fir119ireetal.,2019)，這一發(fā)現(xiàn)獲得了2019年的諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。起初，這項發(fā)現(xiàn)曾引起人們對于哺乳動物是否存在RNAi現(xiàn)象這一問題產生了極大的爭論。ireetal.,2019)，這一發(fā)現(xiàn)獲得了2019年的諾貝120

基于RNAi技術的療法可以被分為兩大類，第一類是成熟的siRNA分子以雙鏈裸露的RNA形式或RNA與載體結合的方式被傳遞。RNA的核苷酸可以被修飾，以降低其

基于RNAi技術的療法可以被分為兩大類，第一類是成熟的si121毒性并/或當運輸至含有核酸酶的體液時延長其活性。由于siRNA在細胞內的半衰期有限，因此它們的活性在細胞內會受到限制。第二類是用DNA作為轉錄模板以使短的含發(fā)夾毒性并/或當運輸至含有核酸酶的體液時延長其活性。由于siRN122結構的RNA(shRNA)形成成熟的siRNA。盡管這些療法都受到載體的限制，但一般都會產生強烈且持久的RNAi活性。

過去幾年，不斷有人嘗試在臨床前期的疾病結構的RNA(shRNA)形成成熟的siRNA。盡管這些療法123模型中應用小RNA。在這些嘗試中至少有6個臨床實驗獲得了成功，其中包括了用載體表達的shRNA和基于siRNA技術的基因療法，這些療法都很有希望應用于臨床藥物的模型中應用小RNA。在這些嘗試中至少有6個臨床實驗獲得了成功124開發(fā)。在前人的這些臨床實驗的啟示下，下一步關鍵問題是明確影響小RNA基因療法效率的關鍵因素究竟是因為基因敲除的特異性，還是因為存在多種非特異性應答形式。

在過開發(fā)。在前人的這些臨床實驗的啟示下，下一步關鍵問題是明確影響125去的十年里，小RNA在生物動態(tài)平衡中所扮演的角色越來越為人們所了解。但是，即使有新型技術(尤其是大規(guī)模測序平臺)的支持，我們對于小RNA具體功能的認識還只處于表去的十年里，小RNA在生物動態(tài)平衡中所扮演的角色越來越為人們126面階段。對內源RNAi/miRNA途徑的闡明不但使人們對基因的調控和功能有了更清晰的了解，而且也幫助我們在細胞中發(fā)現(xiàn)更多其它類型的小RNA，不過這些小RNA產生面階段。對內源RNAi/miRNA途徑的闡明不但使人們對基因127的機制以及它們在基因調控過程所起的作用還不甚明確，但對于研究RNA的生物學家及探索疾病治療新技術的醫(yī)學工作者而言，這些發(fā)現(xiàn)十分振奮人心。毫無疑問，小RNA技術已的機制以及它們在基因調控過程所起的作用還不甚明確，但對于研究128RNAi技術及其應用課件129RNAi技術及其應用課件130RNAi技術及其應用課件131現(xiàn)在幾乎每天都會有文章對各種小RNA與機體發(fā)育之間關系的進展進行報道。而精明的生物技術公司也正在以驚人的速度積極地將RNAi的相關知識運用于藥物篩選研究。借助現(xiàn)現(xiàn)在幾乎每天都會有文章對各種小RNA與機體發(fā)育之間關系的進展132今先進的測序技術，人們鑒定出了多種新型小RNA，而隨后，它們的強大功能將會繼續(xù)吸引我們研究下去，相信研究結果一定會讓我們感到驚喜。

雙鏈RNA能夠以序列特異性今先進的測序技術，人們鑒定出了多種新型小RNA，而隨后，它們133的方式導致基因沉默的機制自發(fā)現(xiàn)起就對生物學的發(fā)展產生了巨大影響，它揭示了人們以前未曾注意到的基因表達調控機制。這種機制被稱為RNA干擾（RNAi）或者RNA沉默的方式導致基因沉默的機制自發(fā)現(xiàn)起就對生物學的發(fā)展產生了巨大影134（RNAsilencing）。其核心內容是：一些非編碼小RNA分子（smallnon-codingRNA，20~30nt）進入細胞后與序列互補的信使RNA靶標配（RNAsilencing）。其核心內容是：一些非編碼小RN135對，阻止其表達。2019年9月，《自然》首次刊登了美國科學家AndrewZ.Fire與llo等人撰寫的關于RNA干擾的成果文章。時隔不久，RNAi技術取得了非凡對，阻止其表達。2019年9月，《自然》首次刊登了美國科學家136的成就。人們逐漸意識到，RNAi將會對生物學的發(fā)展帶來深遠的影響。毫無疑問，打開了RNAi這一潘多拉盒子的AndrewFire與CraigMello獲得了200的成就。人們逐漸意識到，RNAi將會對生物學的發(fā)展帶來深遠的1376年的生理學或醫(yī)學諾貝爾獎。諾貝爾委員會成員GoranHansson在該年的頒獎詞中說道：“RNAi為我們了解生命提供了新視角，并為醫(yī)學發(fā)展提供了新工具?！辈贿^6年的生理學或醫(yī)學諾貝爾獎。諾貝爾委員會成員GoranHan138，RNAi的故事才剛剛開始，許多懸念有待人們逐個解開。

細胞內表達的長dsRNA或外源性長dsRNA（可以是由正鏈轉錄產物和負鏈轉錄產物配對而成的結構，也可以，RNAi的故事才剛剛開始，許多懸念有待人們逐個解開。

細胞139是ssRNA內形成的莖環(huán)結構）在Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的雙鏈解開，其中一條鏈被優(yōu)先裝載入RNA誘導沉默復合物（RISC）中；裝載了小RNA是ssRNA內形成的莖環(huán)結構）在Dicer酶的作用下降解成小140的RISC復合物就會在細胞內積極地“搜索”轉錄組，探尋潛在的RNA靶分子。被裝載入RISC復合物當中的向導鏈（guidestrand）--ssRNA隨后引導RI的RISC復合物就會在細胞內積極地“搜索”轉錄組，探尋潛在的141SC復合物當中的核酸內切酶（有時被稱作“切割機”，現(xiàn)在人們知道它是Argonaute蛋白）反復剪切擁有向導鏈同源序列的mRNA靶分子。向導鏈就是通過這種方式來發(fā)SC復合物當中的核酸內切酶（有時被稱作“切割機”，現(xiàn)在人們知142揮特異性的RNAi作用的；

盡管不同生物體內，參與RNAi途徑的蛋白和相關機制各有不同，但是它們的干擾策略卻驚人地一致。在所有被研究過的物種中，RNAi都揮特異性的RNAi作用的；

盡管不同生物體內，參與RNAi143包含兩種主要的組成成分，即決定干擾特異性的小RNA和發(fā)揮抑制作用的Argonaute蛋白。

根據RISC復合物中Argonaute蛋白的天然活性以及小RNA與包含兩種主要的組成成分，即決定干擾特異性的小RNA和發(fā)揮抑制144其靶標mRNA之間互補程度的不同，RISC復合物與靶標mRNA結合后會發(fā)揮幾種不同的作用，它可以控制mRNA的穩(wěn)定性和蛋白質合成、維持基因組完整性，或產生一系列其靶標mRNA之間互補程度的不同，RISC復合物與靶標mRN145特異性的小RNA。隨著高通量測序技術的出現(xiàn)以及生物信息學的不斷進步，科研人員得以對小RNA的起源及其靶向機制開展更深入的研究。他們發(fā)現(xiàn)，在各個不同的物種當中，R特異性的小RNA。隨著高通量測序技術的出現(xiàn)以及生物信息學的不146NAi系統(tǒng)獲得了不同程度的改進，包括進化出“內置式的”分子“刻度尺”，用來控制小RNA的大小和結構，從而挑選出小dsRNA中最合適的那條單鏈分子進入下一步驟；或NAi系統(tǒng)獲得了不同程度的改進，包括進化出“內置式的”分子“147進化出防止“脫靶”現(xiàn)象出現(xiàn)的機制等等。

科研人員還發(fā)現(xiàn)RNAi通路的活性會在各個水平（從小RNA的生成到RISC復合物的沉默模式）受到嚴密調控。

各種不同的進化出防止“脫靶”現(xiàn)象出現(xiàn)的機制等等。

科研人員還發(fā)現(xiàn)RNA148RNA沉默途徑之間存在競爭關系，比如黑腹果蠅中的endo-siRNA和miRNA之間就相互競爭LOQS。這種競爭機制就是RNAi途徑中決定每一個階段里如何發(fā)生調RNA沉默途徑之間存在競爭關系，比如黑腹果蠅中的endo-s149控的關鍵步驟。很多植物和動物病毒都會編碼抑制蛋白來抑制宿主細胞的RNAi途徑，使得這些調控機制無法在各個不同階段發(fā)揮正常作用。細胞的蛋白質同樣也能夠調控RNAi控的關鍵步驟。很多植物和動物病毒都會編碼抑制蛋白來抑制宿主細150。比如，在人體胚胎細胞中，miRNAlet-7分子（一種抑癌分子，同時也是一種細胞周期調控分子）的生成過程就是一條轉錄后被抑制的過程，該途徑被多潛能因子LIN2。比如，在人體胚胎細胞中，miRNAlet-7分子（一種抑癌1518所抑制。LIN28蛋白可以阻止pri-let-7分子在微處理器復合物中的剪切過程及后續(xù)由Dicer蛋白負責的pre-let-7前體分子的處理過程。不過，人體同8所抑制。LIN28蛋白可以阻止pri-let-7分子在微處152時存在另一條路徑。轉化生長因子β（TGF-β）和生長因子家族中的骨形成蛋白（BMP）都能促進miR-21這種促癌分子的生成。這是因為這些蛋白能夠促進DROSHA時存在另一條路徑。轉化生長因子β（TGF-β）和生長因子家族153將pri-miR-21轉化成pre-miR-21。更確切地說，SMAD蛋白家族成員TGF-β和BMP信號轉換因子與RNA解旋酶p68組成的復合物一起被招募至pr將pri-miR-21轉化成pre-miR-21。更確切地說154i-miR-21，促進pre-miRNA形成。另外，不均一核糖核酸RNPA1蛋白（heterogeneousnuclearRNPA1，hnRNPA1）這種著名的i-miR-21，促進pre-miRNA形成。另外，不均一核155前體mRNA分子剪切調控因子也會幫助DROSHA發(fā)揮作用，有效地生成pre-miR-18，這可能是由hnRNPA1蛋白能夠重新折疊發(fā)夾結構，或者直接與pri-m前體mRNA分子剪切調控因子也會幫助DROSHA發(fā)揮作用，有156iRNA結合，為DROSHA構建出一個酶切位點而造成的。這也說明在pri-miRNA分子中，某些發(fā)夾結構可能是在pri-miRNA分子與RNA伴侶蛋白結合之后才iRNA結合，為DROSHA構建出一個酶切位點而造成的。這也157會形成并被剪切的。

RISC復合體的活性同樣能夠被調控。在擬南芥中，非編碼基因IPS1中含有的一段基序能夠與miR-399序列互補，但是它們之間的互補配對過程會形成并被剪切的。

RISC復合體的活性同樣能夠被調控。在擬158卻被該miRNA分子中酶切位點處的一段錯配形成的環(huán)狀結構給破壞了。這樣，IPS1基因的mRNA產物不僅沒能被miR-399降解，反而還大量“扣押了”miR-39卻被該miRNA分子中酶切位點處的一段錯配形成的環(huán)狀結構給破1599分子。因此，如果IPS1基因大量表達會使得胞內“積聚”大量miR-399分子的靶標--PHO2基因mRNA。這種靶標之間的相似性會給RNA調控網絡帶來不可預料9分子。因此，如果IPS1基因大量表達會使得胞內“積聚”大量160的復雜性。我們預測，最近在人體細胞中發(fā)現(xiàn)的大量mRNA樣非編碼RNA分子（mRNA-likenon-codingRNA）可能會在小RNA-Argonaute蛋白的復雜性。我們預測，最近在人體細胞中發(fā)現(xiàn)的大量mRNA樣非編161復合體調控過程中起到“減速器（attenuator）”的作用。

RNAi機制中最引人注目的亮點就是僅由20~30nt組成的小dsRNA。它們是由RNaseII復合體調控過程中起到“減速器（attenuator）”的作用162I酶（可以是Dicer單獨發(fā)揮作用，也可以是Drosha和Dicer共同發(fā)揮作用）剪切長RNA得到的產物。按照小RNA的來源前體的不同，我們可以將其分為兩大類：I酶（可以是Dicer單獨發(fā)揮作用，也可以是Drosha和D163一是小干擾RNA（siRNA），它是細胞為了應對病毒感染或者其它人工導入分子而剪切外源性長dsRNA前體而生成；二是miRNA，它由細胞運用其自身基因組編碼的莖一是小干擾RNA（siRNA），它是細胞為了應對病毒感染或者164環(huán)結構加工而來。借助高通量測序技術，人們發(fā)現(xiàn)了好幾種內源性小RNA，包括最近發(fā)現(xiàn)的PIWI相互作用RNA（PIWI-interactingRNA,piRNA）和環(huán)結構加工而來。借助高通量測序技術，人們發(fā)現(xiàn)了好幾種內源性小165內源性siRNA（esiRNA）。

不過，這些小RNA子都有一個共同的特征，那就是它們都能與Argonaute蛋白相結合，從而發(fā)揮它們的靶向作用。

簡述內源性siRNA（esiRNA）。

不過，這些小RNA子都有166小RNA分子的形成過程以及RNA沉默的機制

a、能夠形成dsRNA結構或者發(fā)夾結構的天然轉錄產物是形成小RNA分子的前體物質。這些雙鏈結構的RNA分子經由Dr小RNA分子的形成過程以及RNA沉默的機制

a、能夠形成ds167osha或Dicer等RNaseIII處理之后就能得到小dsRNA分子。如果這些小dsRNA分子之間的配對情況非常好，如圖中左側所示，那么就會經由Argonauosha或Dicer等RNaseIII處理之后就能得到小ds168te蛋白的酶切活性進行進一步處理，生成小ssRNA產物。如果像圖中右側所示的那樣，小dsRNA分子之間的配對情況不是非常好，比如出現(xiàn)了錯配或者有環(huán)狀凸出，那么它te蛋白的酶切活性進行進一步處理，生成小ssRNA產物。如果169們就不能被Argonaute蛋白酶切處理，只能經由一種不依賴酶切活性的方式生成最終的小ssRNA產物。目前，我們對于究竟是哪種蛋白參與其中來發(fā)揮解鏈活性還不得而們就不能被Argonaute蛋白酶切處理，只能經由一種不依賴170知。生成的小ssRNA分子隨后會與Argonaute蛋白結合，但究竟是哪一條單鏈分子（正鏈或負鏈）結合到Argonaute蛋白上則取決于它們的熱力學穩(wěn)定性。結合知。生成的小ssRNA分子隨后會與Argonaute蛋白結合171了單鏈小RNA分子的Argonaute蛋白會根據單鏈RNA分子的序列尋找能夠與其互補配對的mRNA分子，并與之結合，然后抑制它的表達。而究竟采用哪種機制沉默該基了單鏈小RNA分子的Argonaute蛋白會根據單鏈RNA分172因的表達，比如是直接降解目的mRNA還是僅僅抑制其表達，在很大程度上取決于mRNA和小RNA分子之間的互補程度。

b、在秀麗隱桿線蟲和某些植物細胞中發(fā)現(xiàn)，某些因的表達，比如是直接降解目的mRNA還是僅僅抑制其表達，在很173小RNA分子還可以通過RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）來合成。有一些天然轉錄產物（通常它們都是異常的轉錄產物）都是這種依賴RdRP途徑合成的小RNA分子的前小RNA分子還可以通過RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）來174體來源物質。因此，缺乏RdRP活性的物種，比如哺乳動物和黑腹果蠅等物種體內是不會發(fā)現(xiàn)這種小RNA合成機制的。經過這種途徑生成的小RNA分子隨后同樣也是與Argo體來源物質。因此，缺乏RdRP活性的物種，比如哺乳動物和黑腹175naute蛋白相結合，發(fā)揮抑制靶基因表達的作用。

c、有一類Argonaute蛋白只存在于生殖細胞當中，它們被稱作PIWI亞科蛋白，它們可以與piRNA結合，naute蛋白相結合，發(fā)揮抑制靶基因表達的作用。

c、有一類176隨后形成的復合物能夠沉默轉座子。單鏈前體RNA分子在未知蛋白的作用下經過初步處理過程形成piRNA。在生殖細胞內，PIWI蛋白在沉默轉座子的同時還能大量擴增pi隨后形成的復合物能夠沉默轉座子。單鏈前體RNA分子在未知蛋白177RNA分子，這個過程被稱作進一步處理過程，或者叫ping-pong擴增環(huán)路反應，這種反應在包括小鼠和斑馬魚在內的多個物種體內都廣泛存在，非常保守。在這步反應當中RNA分子，這個過程被稱作進一步處理過程，或者叫ping-p178，PIWI蛋白的剪切活性會不斷剪切轉座子轉錄產物（即piRNA的前體物質）形成piRNA的5端，但是piRNA的3端是由什么蛋白質負責生成的，我們現(xiàn)在還不清楚。，PIWI蛋白的剪切活性會不斷剪切轉座子轉錄產物（即piRN179

siRNA作為一種新興的治療技術，卻已經以一種前所未有的速度邁進了臨床試驗階段。下面，我們將介紹幾種已經進入臨床試驗階段的人體疾病RNAi療法。

第一個被

siRNA作為一種新興的治療技術，卻已經以一種前所未有的速180siRNA治療指南批準獲得臨床研究新藥（investigationalnewdrug，IND）資格，并且進入了臨床試驗的就是Bevasiranib，它是美國AcsiRNA治療指南批準獲得臨床研究新藥（investigat181uity制藥公司生產的針對血管內皮細胞生長因子（VEGF）的siRNA類藥物。該藥主要用于治療滲出性老年性黃斑變性。所謂滲出性老年性黃斑變性，主要是因為視網膜后uity制藥公司生產的針對血管內皮細胞生長因子（VEGF）的182血管大量生長，導致患者出現(xiàn)嚴重的不可逆性視力損傷。在小鼠試驗中對Bevasiranib進行的臨床前研究表明，直接眼部注射該藥能夠下調Vegf基因的表達，有效減少血管大量生長，導致患者出現(xiàn)嚴重的不可逆性視力損傷。在小鼠試驗183新生血管數(shù)量。

還有兩家公司也專注于用siRNA治療黃斑變性疾病，他們分別是美國的Merck’sSirnaTherapeutics公司（主要產品是針對VEGF新生血管數(shù)量。

還有兩家公司也專注于用siRNA治療黃斑變性184受體VEGFR1蛋白的Sirna-027）和Quark制藥公司。他們和倫敦及柏林的SilenceTherapeutics公司（即以前的SR制藥公司）合作，主要生受體VEGFR1蛋白的Sirna-027）和Quark制藥公185產靶定RTP801基因（又名DDIT4基因，該基因與黃斑變性疾病的進展有關）這種缺氧誘導基因的siRNA產品RTP801i-14。RTP801i-14已經被授權產靶定RTP801基因（又名DDIT4基因，該基因與黃斑變性186給英國的Prizer制藥公司，進行I/IIA期臨床試驗。Quark制藥公司也已經獲得了IND資格可以進行另一項臨床前試驗，他們目前正在為這項實驗招募志愿者。這項給英國的Prizer制藥公司，進行I/IIA期臨床試驗。Qu187實驗的藥物靶定TP53基因的siRNA。該藥通過抑制p53蛋白的表達能夠阻礙細胞凋亡通路，從而有望避免手術后出現(xiàn)的急性腎衰竭。

與此同時，美國的Calando實驗的藥物靶定TP53基因的siRNA。該藥通過抑制p53蛋188制藥公司也開始了新藥的臨床試驗項目。他們實驗的新藥是用于治療實體瘤的靶定核糖核苷酸還原酶RRM2（該酶參與DNA的合成）亞基的siRNA。值得一提的是，這是第一制藥公司也開始了新藥的臨床試驗項目。他們實驗的新藥是用于治療189項使用受體介導遞送方式的siRNA臨床試驗，該產品被連接有轉鐵蛋白的環(huán)糊精顆粒包裹。這樣，藥物就只會被細胞表面表達有轉鐵蛋白受體的細胞攝取，而轉鐵蛋白受體在腫瘤項使用受體介導遞送方式的siRNA臨床試驗，該產品被連接有轉190細胞表面表達量就非常高。

Acuity制藥公司與Merck公司旗下的SirnaTherapeutics公司合作進行的臨床藥物試驗成功地穩(wěn)定了患者的病情，阻止了細胞表面表達量就非常高。

Acuity制藥公司與Merck公191病情進一步加重，明顯改善了患者的視力，而且還沒有副作用和不良反應。這些成果讓我們對玻璃體內注射siRNA這種治療方法充滿了信心。但是，Kleinman等人的報道病情進一步加重，明顯改善了患者的視力，而且還沒有副作用和不良192給我們當頭潑了一盆冷水。Kleinman等人認為，患者新生血管數(shù)量的減少并不是因為siRNA特異性的基因沉默作用，而是因為它非特異性地激活了TLR3受體，繼而導給我們當頭潑了一盆冷水。Kleinman等人認為，患者新生血193致γ干擾素和白介素12活化，從而下調了VEGF因子的表達。換句話來說，特異性的siRNA藥物和非特異性的siRNA對照藥物都能因為siRNA與TLR3之間的相互致γ干擾素和白介素12活化，從而下調了VEGF因子的表達。換194作用而產生這種非特異性的血管生成抑制作用。而且，這種非特異性的效應與細胞對siRNA分子的攝取作用無關，同時由于TLR3蛋白參與細胞內多條信號通路，因此這也讓我作用而產生這種非特異性的血管生成抑制作用。而且，這種非特異性195們對siRNA療法的安全性問題感到了擔憂。

美國Alnylam制藥公司是一家專業(yè)的siRNA制藥公司，他們的主打產品ALN-RSV01主要針對呼吸道合胞病們對siRNA療法的安全性問題感到了擔憂。

美國Alnyl196毒感染（在美國每年有大約30萬人會感染呼吸道合胞病毒）。它可以沉默病毒復制過程中必需的病毒核衣殼蛋白編碼基因N基因。ALN-RSV01也是第一款進入臨床試驗的抗毒感染（在美國每年有大約30萬人會感染呼吸道合胞病毒）。它可197病毒siRNA產品，目前人們已經計劃將試驗對象擴展到兒科患者。就現(xiàn)有的試驗結果來看，ALN-RSV01的療效非常好，而且志愿者對它的耐受性也非常高。最近，Aln病毒siRNA產品，目前人們已經計劃將試驗對象擴展到兒科患者198ylam制藥公司又與KyowaHakkoKogyo結成了獨家合作關系，共同在日本和其他亞洲國家研發(fā)商業(yè)化的ALN-RSV01產品。

Alnylam制藥公司同時ylam制藥公司又與KyowaHakkoKogyo結成了獨家199也在開發(fā)一系列治療高膽固醇血癥、亨廷頓舞蹈病（與美國Medtronic共同開發(fā)）、丙型肝炎病毒（與美國Isis制藥公司共同開發(fā)）、進行性多病灶腦白質病（與美國B也在開發(fā)一系列治療高膽固醇血癥、亨廷頓舞蹈?。ㄅc美國Medt200iogenIdec公司共同開發(fā)）以及流感（與瑞士Novartis制藥公司共同開發(fā)）等疾病的siRNA產品。

國際雅-雷二氏綜合征協(xié)會（TheInternatiiogenIdec公司共同開發(fā)）以及流感（與瑞士Novart201onalPachyonychiaCongenitaConsortium，IPCC）也正與美國TransDerm公司合作，共同開發(fā)治療雅-雷二氏綜合征的siRNAonalPachyonychiaCongenitaConso202產品。他們希望該產品能夠“糾正”患者角蛋白的合成，從而達到治療這種罕見的皮膚疾病的目的。

美國希望之城醫(yī)療中心（TheCityofHopeNationalMe產品。他們希望該產品能夠“糾正”患者角蛋白的合成，從而達到治203dicalCenter）正在與澳大利亞Benitec公司合作開發(fā)一款治療艾滋病淋巴瘤的藥物。該藥物是一款使用了PolIII啟動子載體的shRNA類藥物，主要靶定dicalCenter）正在與澳大利亞Benitec公司合作204HIV病毒的tat基因和rev基因的共有外顯子序列。它使用的載體是基于HIV病毒的一種慢病毒載體，同時在載體上還插入了另外兩個RNA抗HIV基因，最后通過該載體HIV病毒的tat基因和rev基因的共有外顯子序列。它使用的205將shRNA基因導入血液干細胞。在臨床試驗中，通過自體骨髓移植方式將這種經過基因改造的血液干細胞輸入HIV病毒感染患者體內，看看是否能夠起到治療艾滋病相關骨髓瘤將shRNA基因導入血液干細胞。在臨床試驗中，通過自體骨髓移206的作用。到目前為止已經有四位患者接受了這種治療。

正如前面提到的那樣，在siRNA藥物研發(fā)領域合作已成為非常普遍的現(xiàn)象。通過合作可以獲得更多的好處，比如獲得更的作用。到目前為止已經有四位患者接受了這種治療。

正如前面提207多的科研資金，縮短最后藥物成品上市的時間等等。

有一些公司，比如美國RegulusTherapeutics公司等則將目光投向了miRNA。丹麥Santaris多的科研資金，縮短最后藥物成品上市的時間等等。

有一些公司，208制藥公司最近也開始為他們靶定人體miRNA分子（miR-122）的新藥開始了I期臨床試驗項目。在該項藥物試驗里，miR-122是被下調的靶標，被試驗的藥物是抗m制藥公司最近也開始為他們靶定人體miRNA分子（miR-12209iRNA的鎖核酸藥物SPC3649。鎖核酸是一種骨架被修飾過的寡核苷酸分子，經過修飾之后它能更好地與底物雜交，避免底物被核酸酶降解。SPC3649最終的目的是希iRNA的鎖核酸藥物SPC3649。鎖核酸是一種骨架被修飾過210望能夠治療丙型肝炎患者，因為miR-122可以促進丙型肝炎病毒復制。下調miR-122分子還能用于治療高膽固醇血癥患者。直接靶定在心臟里表達的miRNA分子，比望能夠治療丙型肝炎患者，因為miR-122可以促進丙型肝炎病211如miR-208（它能夠調控心臟肥大和纖維化）等也會達到治療目的，因為在醫(yī)療實踐中早就發(fā)現(xiàn)直接往靶器官里給藥是可行的。

miRNA功能的獲得或缺失與各種疾病的如miR-208（它能夠調控心臟肥大和纖維化）等也會達到治療212發(fā)生發(fā)展都有著密切的關系。蛋白質功能既可以直接也可以間接地受miRNA分子的調控，因此，miRNA表達水平的些許改變也會對基因表達調控帶來巨大的影響。在因為mi發(fā)生發(fā)展都有著密切的關系。蛋白質功能既可以直接也可以間接地受213RNA表達水平改變而造成的疾病中，我們可以設想是否如此，如果能使miRNA表達水平恢復正常，那么就應該能夠治愈該疾病呢？那么如果是這樣，當miRNA表達水平過高RNA表達水平改變而造成的疾病中，我們可以設想是否如此，如果214時我們就對其進行針對性下調，如果表達水平過低我們就往細胞內注入一些類似的miRNA模擬物。不過要達到這個目的，我們現(xiàn)有的小RNA遞送系統(tǒng)的特異性和有效性都還有待時我們就對其進行針對性下調，如果表達水平過低我們就往細胞內注215提高。另外，要想對目標miRNA分子表達水平進行精細、準確的調控并非一件容易的工作，而且人們現(xiàn)在還不清楚能否精確地只對一個miRNA分子施加影響而不會“傷及”同提高。另外，要想對目標miRNA分子表達水平進行精細、準確的216一miRNA分子家族中的其它成員。

在實際治療時，不論是上調還是下調miRNA的功能，我們都還應該考慮到miRNA分子調控機制的復雜程度。要知道一個miRNA一miRNA分子家族中的其它成員。

在實際治療時，不論是上調217分子就可以調控數(shù)百個蛋白質的表達水平，因此我們哪怕對一個miRNA分子進行調控也要特別小心。

將siRNA分子用于臨床治療會產生很多安全性問題。完成了最初分子就可以調控數(shù)百個蛋白質的表達水平，因此我們哪怕對一個mi218的試驗之后，有很多報道都指出了這種新興療法可能存在很多潛在的安全問題。最早報道的是在一項小鼠試驗中，使用PolIII啟動子載體在肝臟中表達shRNA進行治療，結的試驗之后，有很多報道都指出了這種新興療法可能存在很多潛在的219果導致試驗小鼠死亡。具體的致死機制現(xiàn)在還不清楚，但是至少有部分原因可能是因為負責將miRNA分子從核內轉運到胞質中的轉運因子輸出蛋白5（exportin5）出現(xiàn)果導致試驗小鼠死亡。具體的致死機制現(xiàn)在還不清楚，但是至少有部220了飽和。現(xiàn)在其它試驗數(shù)據也表明很多參與RNAi處理過程的因子在細胞大量表達外源性siRNA時都會被這些小RNA分子所飽和，因此就無法轉運正常的細胞內源性miRN了飽和?，F(xiàn)在其它試驗數(shù)據也表明很多參與RNAi處理過程的因子221A分子。由于每一個細胞miRNA都能夠調控上百種基因的表達，因此對miRNA途徑哪怕只帶來一點小小的擾動也會造成非常嚴重的后果。

要解決這個問題有一種辦法就是A分子。由于每一個細胞miRNA都能夠調控上百種基因的表達，222設計能被Dicer酶切割的外源性siRNA（即增加siRNA的長度），這樣就能在達到同樣治療效果的前提下使用最低劑量的siRNA藥物。這些RNA分子經過Dice設計能被Dicer酶切割的外源性siRNA（即增加siRNA223r酶切割之后就進入了RNAi途徑，這樣相比直接使用外源性的21nt的siRNA藥物通常都能夠以更低的劑量達到更好的基因沉默效果。雖然少量的siRNA分子應該不足r酶切割之后就進入了RNAi途徑，這樣相比直接使用外源性的2224以飽和整個RNAi體系，但是它們也能夠與其它miRNA競爭RISC復合體進入位點。這種競爭會造成什么樣的遠期結果現(xiàn)在還不清楚。

使用微陣列芯片可以很明顯地發(fā)現(xiàn)以飽和整個RNAi體系，但是它們也能夠與其它miRNA競爭R225，往胞內導入外源性siRNA分子之后會改變靶基因的表達水平，但同時也能改變其它非靶基因的表達狀況，因為僅憑6、7個核苷酸互補序列的結合就會通過一種miRNA樣機，往胞內導入外源性siRNA分子之后會改變靶基因的表達水平，226制產生特異性的脫靶效應。不過，微陣列芯片只能夠反映mRNA水平的改變，不能夠反映翻譯水平的改變，因此我們還不能明確這種脫靶效應會造成多大的影響。由于使用人工合成制產生特異性的脫靶效應。不過，微陣列芯片只能夠反映mRNA水227的siRNA只能短期抑制細胞基因的表達，因此在臨床實踐中，這種特異性的脫靶效應可能還不是一個大問題。不過無論如何，在進行適當?shù)亩拘栽囼灂r我們都應該考慮siRNA的siRNA只能短期抑制細胞基因的表達，因此在臨床實踐中，這228與非靶基因mRNA3端UTR區(qū)域結合后可能出現(xiàn)的問題。

在進行siRNA設計的時候可以采取一些策略，盡量減少這種脫靶情況的發(fā)生。比如，在siRNA雙鏈分子中引與非靶基因mRNA3端UTR區(qū)域結合后可能出現(xiàn)的問題。

在進229入2’-O-Me修飾或者進行DNA替換都能夠明顯降低脫靶現(xiàn)象的發(fā)生率。改變熱穩(wěn)定性或者封閉正義鏈5端的磷酸化位點，這都能改善反義鏈選擇過程，這對于降低脫靶率也是入2’-O-Me修飾或者進行DNA替換都能夠明顯降低脫靶現(xiàn)象230非常有幫助的。

RNAi機制是一條非常保守的作用機制，它最初的作用可能是幫助物種抵抗病毒的感染。如果是這樣，我們也就不會感到奇怪，為什么在某些情況下siRNA非常有幫助的。

RNAi機制是一條非常保守的作用機制，它最初231能夠起到Toll樣受體激動劑的作用；某些序列，比如富含尿嘧啶的序列或者富含鳥嘌呤及尿嘧啶的序列能夠誘導細胞的免疫應答。siRNA能夠刺激細胞出現(xiàn)免疫應答不僅是因能夠起到Toll樣受體激動劑的作用；某些序列，比如富含尿嘧啶232為它的序列，還可能是因為它的結構、所使用的遞送系統(tǒng)或者細胞類型等等因素。雖然這種免疫刺激在某些情況下可能會有所幫助，但是通常來說我們都不希望它發(fā)生。上面提到的T為它的序列，還可能是因為它的結構、所使用的遞送系統(tǒng)或者細胞類233LR3反應對VEGF或VEGF受體起到的非序列特異性調控作用，以及另一起報道中提到的在鼠類動物模型中，靶定巨噬細胞遷移抑制因子（migrationinhibitLR3反應對VEGF或VEGF受