T-SDAA 0045-2021 多殺性巴氏桿菌的檢測 PCR法

ICS65.020.30B43團體標(biāo)準(zhǔn)T/SDAA0045－2021多性巴桿菌檢測 PCR法DetectionofPasteurellamultocidabyPCR2021－11－30發(fā)布 2021－12－31實施山東省畜牧協(xié)會 發(fā)布T/SDAA0045－2021T/SDAA0045－2021前??言本文件按照GB/T1.1—2020的規(guī)定起草。本文件由山東省畜牧協(xié)會提出并歸口。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件起草單位：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院、山東省動物疫病預(yù)防與控制中心。T/SDAA0045－2021T/SDAA0045－2021多殺性巴氏桿菌的檢測 PCR法范圍本文件規(guī)定了豬多殺性巴氏桿菌的PCR檢測方法。本方法適用于豬多殺性巴氏桿菌的檢測。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范NY/T564-2016豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)原理DNA核酸DNADNADNA條帶的大小來判斷結(jié)果。試劑或材料除非另有規(guī)定，所用試劑均為分析純。水：GB/T6682，一級。5%綿羊鮮血平板革蘭氏染液2×TaqMasterMixDNAMarkerDL2000瓊脂糖TAE緩沖液4SGreenPlus無毒核酸染料T/SDAA0045－2021儀器設(shè)備生物安全柜：配ULPA超高效空氣過濾器。高速冷凍離心機：轉(zhuǎn)速不低于12000rpm/min。PCR儀：最大升降溫速率為4℃/秒，溫度范圍4℃~99℃。凝膠成像儀：圖像分辨率不低于500萬像素，靈敏性可檢測出低于20pgEB染色的雙鏈DNA。302nm。3～300V1～400mA1～120W。樣品按照NY/T541的規(guī)定采集、貯存樣品。試驗步驟細菌的分離及純培養(yǎng)5%綿羊鮮血平板上劃線接種。接種后的平板貼好標(biāo)簽后放入恒溫箱，3724h，觀察菌落大小、形態(tài)、溶血狀況等。1mm~1.5mm左右，菌落形態(tài)參見附錄A.1。革蘭氏染色與鏡檢1cm大小的水膜。挑取單個菌落均勻涂抹在水膜內(nèi)，室溫干燥、火焰固定。進行革蘭氏染色。1min~2min，流水緩慢沖洗，干燥；1min~2min，流水緩慢沖洗，干燥；95%10s~30s，流水緩慢沖洗，干燥；T/SDAA0045－20211min，流水緩慢沖洗，自然干燥。鏡檢豬多殺巴氏桿菌為革蘭氏染色陰性、短小桿菌或球桿菌，細菌形態(tài)參見附錄A.2。PCRDNA模板的制備NY/T564-20164.4.4中的規(guī)定制備。PCR擴增引物根據(jù)多殺巴氏桿菌16SrNA基因序列（見附錄A.3，設(shè)計一對引物，商業(yè)合成，引物序列見附錄B.1。PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系為25μL體系，見附錄B.2。PCR反應(yīng)條件2000rpmn離心1inRCR5min，94303210min（標(biāo)準(zhǔn)株（無菌水PCR1.5%DNA條帶的大小。PCR按NY/T564-2016 4.4.6規(guī)定執(zhí)行。結(jié)果判定試驗成立的條件DL2000DNAMarkerDNA355bpB.3。陽性判定7.5.1355bp的片段，則判定被檢細菌為多殺性巴氏桿菌。T/SDAA0045－2021陰性判定7.5.1355bp的片段，則判定被檢細菌不是多殺性巴氏桿菌。附錄A（資料性）多殺性巴氏桿菌的菌落形態(tài)（圖A.1）圖A.1 豬多殺巴氏桿菌菌落形態(tài)（綿羊鮮血平板）豬多殺性巴氏桿菌形態(tài)（圖A.2）圖A.2豬多殺巴氏桿菌形態(tài)（革蘭氏染色）T/SDAA0045－2021靶基因片段及引物在靶基因中的位置（圖A.3）下游引物

TAATACTTGGGAATCTGGCTTATGGAGGGGGATAACTGTGGGAAACTGCAGCTAATACCGCGTATTCTCTGAGGAGGAAAGGGTGGGACCTTAGGGCCACCTGCCATAAGATGAGCCCAAGTGGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGCCTGCGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGCCTTCGGGTTGTAAAGTTCTTTCGGTAATGAGGAAGGGATGTTGTTAAATAGATAGCATCATTGACGTTAATTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATAACTGGGCGTAAAGGGCACGCAGGCGAACTTTTAAG圖A.3 設(shè)計引物的參照序列附錄B（規(guī)范性）PCR擴增的引物序列（表B.1）引物名稱引物序列（5＇-3＇方向）擴增片段大小上游引物（F）TATGGAGGGGGATAACTGTG355bp下游引物（R）GTCGTTA