生化技術(shù)凝膠過濾

關(guān)于生化技術(shù)凝膠過濾第一頁，共七十頁，2022年，8月28日

凝膠過濾是20C-60Y發(fā)展起來的一種分離純化方法；又稱分子篩層析、排阻層析

原理：凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被阻擋在外部，從而使混合溶液中各種組分按分子質(zhì)量不同進(jìn)行篩分

特點：設(shè)備簡單，操作方便、重復(fù)性好、回收率高

用途：分離純化蛋白質(zhì)、核酸、多糖、激素等，測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、樣品的濃縮和脫鹽等

第二頁，共七十頁，2022年，8月28日目的掌握凝膠的分類和性質(zhì)掌握凝膠過濾的基本原理熟悉凝膠過濾的操作與應(yīng)用第三頁，共七十頁，2022年，8月28日第一節(jié)凝膠的分類及性質(zhì)

第四頁，共七十頁，2022年，8月28日

凝膠是一類不溶于水，但在水中有較大膨脹度和較好分子篩作用的化合物目前主要有葡聚糖凝膠、天然瓊脂糖和交聯(lián)瓊脂糖；其次，還有聚丙烯酰胺凝膠（生物膠）、交聯(lián)葡聚糖與雙丙烯酰胺共聚凝膠，以及交聯(lián)瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合的凝膠等第五頁，共七十頁，2022年，8月28日第六頁，共七十頁，2022年，8月28日第七頁，共七十頁，2022年，8月28日

商品名稱：Sephadex，由葡聚糖[右旋糖酐(G型)]和3-氯-1，2環(huán)氧丙烷(交聯(lián)劑)以醚鍵交聯(lián)而成在交聯(lián)葡聚糖G-25、G-50中加入羥丙基后，即可構(gòu)成烷基化（LH型）葡聚糖凝膠一、葡聚糖凝膠第八頁，共七十頁，2022年，8月28日第九頁，共七十頁，2022年，8月28日①性狀：外觀為白色珠狀顆粒，在顯微鏡下可見表面為網(wǎng)狀皺紋②溶解性：帶有大量的羥基，親水性好，因此在水溶液或電解質(zhì)溶液中極易膨脹③型號：SephadexG-n（n越大，則交聯(lián)度越小，而膨脹度、吸水量和篩孔直徑則越大）④應(yīng)用：1.理化性質(zhì)凝膠過濾層析：以G型Sephadex為固定相，水為流動相，對水溶性物質(zhì)進(jìn)行分離凝膠滲透層析：以LH型Sephadex為固定相，以有機(jī)溶劑為流動相，對脂溶性物質(zhì)進(jìn)行分離第十頁，共七十頁，2022年，8月28日

在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液和有機(jī)溶劑中是穩(wěn)定的、不溶解的

強(qiáng)酸或氧化劑溶液中，則容易使糖苷鍵水解斷裂在室溫下長期保存時，應(yīng)加入適量的防腐劑如CHCl3、0.05％NaN3或20％EtOH等

2.穩(wěn)定性第十一頁，共七十頁，2022年，8月28日

含少量的羧基基團(tuán)，為弱酸性物質(zhì)。能與帶正電荷的分離物如堿性蛋白質(zhì)等發(fā)生吸附

克服方法：提高洗脫液的離子強(qiáng)度至0.05以上，可克服此非特異性吸附

①常用含有NaCl的緩沖液作洗脫液。

②新購得葡聚糖凝膠對蛋白質(zhì)往往有不可逆的吸附性能，雖然吸附的數(shù)量較少，但在定量測定或者分離純化極難得到的物質(zhì)時，也需先用易得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)層析，以便消除其影響3.吸附性第十二頁，共七十頁，2022年，8月28日

葡聚糖凝膠對芳香族化合物或雜環(huán)化合物以及某些凝集素具有較強(qiáng)的吸附作用，若采用凝膠過濾層析分離它們時，往往利用的是吸附性能，而不是排阻原理

第十三頁，共七十頁，2022年，8月28日第十四頁，共七十頁，2022年，8月28日

瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的一種由D-半乳糖和3,6脫水的L-半乳糖連接而成的多糖。其商品名因生產(chǎn)廠家不同而異瑞典、中國：Sepharose美國：Bio-gelA15m，排阻分子量小于15million的分子，即15×106（排阻限度）

英國：Segavac，粉狀、顆粒狀丹麥：Gelarose

除Segavac外，都是以珠狀瓊脂糖凝膠形式出售

二、瓊脂糖凝膠第十五頁，共七十頁，2022年，8月28日1.性質(zhì)①高溫時呈液態(tài)，經(jīng)凝集即成瓊脂糖凝膠②對尿素、鹽酸胍等具有較強(qiáng)的抵抗力，在pH4.0~9.0緩沖液中穩(wěn)定③層析流速較高④干膠易脫水破裂，一般存放于含防腐劑的水溶液中，避免劇烈攪拌第十六頁，共七十頁，2022年，8月28日①Sepharose2B(2％)、4B(4％)和6B(6％)Sepharose6B的機(jī)械強(qiáng)度大于2B，但是篩孔小于2B②Sepharose與1，3-二溴異丙醇(1,3-dibromopropanol)在強(qiáng)堿性條件下反應(yīng)后，即生成CL型交聯(lián)瓊脂糖(SepharoseCL）

這種瓊脂糖的篩孔與同濃度的、未交聯(lián)的瓊脂糖相同，但耐熱、耐酸堿。但是在氧化劑存在下，會有少量的多糖鏈發(fā)生解聚（穩(wěn)定性提高）

2.應(yīng)用形式（按濃度分）第十七頁，共七十頁，2022年，8月28日3.特點機(jī)械強(qiáng)度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠好；且層析時流速較快第十八頁，共七十頁，2022年，8月28日

商品名稱：Bio-gel（生物膠）。以甲撐雙丙烯酰胺(雙體)作交聯(lián)劑，以過硫酸銨作催化劑，在N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)加速劑的作用下（化學(xué)催化），將丙烯酰胺(單體)聚合而成當(dāng)改變單體濃度時，就可得到吸水率不同的產(chǎn)物。商品聚丙烯酰胺凝膠型號有Bio-gelP-2到P-300，其阿拉伯?dāng)?shù)字表示排阻限度

如Bio-gelP-150的排阻限度為小于150×103Da三、聚丙烯酰胺凝膠第十九頁，共七十頁，2022年，8月28日

聚丙烯酰胺凝膠一般制成珠狀顆粒，使用前必須溶脹。能忍受濃的鹽、尿素和胍鹽等溶液的浸泡；耐酸堿，但要避免長期與強(qiáng)酸和強(qiáng)堿接觸，如果與其接觸并在高溫條件下，酰胺基將迅速發(fā)生分解聚丙烯酰胺凝膠對芳香族的、酸性和堿性的化合物稍有吸附現(xiàn)象克服吸附的方法：提高洗脫液的離子強(qiáng)度

第二十頁，共七十頁，2022年，8月28日

Sephacryl是由烯丙烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺共價交聯(lián)制成。此凝膠屬硬性凝膠，它具有一定大小的篩孔和少量的羧基基團(tuán)耐酸堿、耐去污劑、耐解離劑，甚至可用去污劑、鹽酸胍或尿素溶液作洗脫劑多用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖和蛋白聚糖的分離純化，也用于病毒顆粒的分離四、Sephacryl第二十一頁，共七十頁，2022年，8月28日

由高交聯(lián)度的瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合而成特點：具有良好的分子篩特性和理化穩(wěn)定性。溶液的酸堿度可在pH3~12范圍內(nèi)變化；溶液中加入去污劑(如1％SDS)和(或)解離劑(如8mol/L尿素、6mol/L鹽酸胍)時，也不會影響分離效果

五、Superdex第二十二頁，共七十頁，2022年，8月28日Superose：高交聯(lián)度的多孔瓊脂糖珠玻璃珠：有大量的網(wǎng)孔，且分布均一。機(jī)械性能良好，在較高的層析流速下，分辨率并不受影響，其缺點是對蛋白質(zhì)等物質(zhì)有吸附能力聚苯乙烯凝膠五、其他第二十三頁，共七十頁，2022年，8月28日第二節(jié)基本原理第二十四頁，共七十頁，2022年，8月28日一、基本原理

凝膠過濾層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑較一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可完全或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而小分子化合物則可以在篩孔中自由擴(kuò)散和滲透。某種組分凝膠層析柱中被排阻的程度用表示

洗脫體積；外水體積；凝膠床體積

在一定層析條件下，和均為固定值，而隨著被分離物分子量的變化而變化。組分分子量越大，則洗脫更容易（排阻越多），越小，越小第二十五頁，共七十頁，2022年，8月28日

各組分間的值差異越大，分離效果越好；差異越小,則分離效果很差，或根本無法分離流出物用部分收集器等量或等時收集，檢測后分段合并相同組分的各管流出物，得到分子量不同的各種組分第二十六頁，共七十頁，2022年，8月28日

1、當(dāng)Kav=0時，則Ve=Vo，即對于根本不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部的大分子物質(zhì)全排阻，洗脫體積等于空隙體積即外水體積（圖中組分Ⅰ）2、當(dāng)Kav=1時，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全滲入凝膠內(nèi)部時，洗脫體積應(yīng)為空隙體積與內(nèi)水體積之和。Ve=Vo+Vi（圖中組分Ⅲ）第二十七頁，共七十頁，2022年，8月28日3、當(dāng)0＜Kav＜1時，Ve=Vo+Kav（Vi＋Vg）。表示固定相中只有一部分可被組分?jǐn)U散滲入，一部分被排阻，Ve即在Vo與Vo+Vi＋Vg之間變化（圖中組分Ⅱ）4、有時Kav＞1，表示凝膠對組分有吸附作用（從內(nèi)水中洗脫出來的含量下降），此時Ve＞Vo+Vi＋Vg。例如一些芳香族化合物如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等在SephadexG-25中的洗脫體積遠(yuǎn)超出理論計算的最大值第二十八頁，共七十頁，2022年，8月28日二、值的測定只要測出、和，即可計算出值的測定：（1）計算法：（2）測定法：第二十九頁，共七十頁，2022年，8月28日

的測定：用藍(lán)色的葡聚糖2000（M=200萬），在Sephadex中被完全排阻，并借助其本身的顏色，采用肉眼或分光光度計檢測（210、260或620nm）洗脫體積的測定：用、N-乙酰酪氨酸或其他小分子物質(zhì)作為洗脫對象。由于分子量小，且無吸附，故洗脫體積剛好是（=1）當(dāng)分子大小在凝膠孔徑的上、下限之間時，則介于和之間（即=0~1）第三十頁，共七十頁，2022年，8月28日第三十一頁，共七十頁，2022年，8月28日第三節(jié)操作第三十二頁，共七十頁，2022年，8月28日（一）凝膠的選擇

1.型號：凝膠型號不一樣，篩分范圍亦不相同如：SephadexG型多用于分離蛋白質(zhì)；生物膠和Sephacryl等多用于分離核酸；要除去蛋白質(zhì)中的鹽類，多用SephadexG-252.粒度：粒度與交聯(lián)度無關(guān)。與粗顆粒相比，細(xì)顆粒凝膠之間空隙小，裝柱易均勻，分離效果好，但流速慢；而粗顆粒凝膠流速快，宜用小顆粒直徑的層析柱

一、凝膠的選擇與處理第三十三頁，共七十頁，2022年，8月28日第三十四頁，共七十頁，2022年，8月28日（二）凝膠用量計算

由于凝膠在處理過程中會有一部分損失，故用此法計算出的凝膠用量需增加10~20%第三十五頁，共七十頁，2022年，8月28日（三）凝膠的處理將所用的干膠置于5~10倍量的D.W中，充分浸泡（表6-2溶脹時間），用傾斜法去除表面懸浮的小顆粒，再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl室溫浸泡0.5h，抽濾除去堿液，用D.W洗至中性。再用抽氣方法以D.W或平衡液除去凝膠顆粒之間的氣泡第三十六頁，共七十頁，2022年，8月28日1．柱子的選擇①當(dāng)直徑相同時，柱長長者比柱長短者分辨率高②柱長相同時，直徑大者比小者分辨率高③床體積相同時，柱長長者比短的分辨率高

一般理想的層析柱直徑與長度之比是1：25~1：100；層析柱外面最好有夾套，能控制溫度（柱溫箱），以保證結(jié)果的重復(fù)性2．裝柱：常用濕裝法（第三章）3．凝膠柱的鑒定

二、凝膠柱的制備第三十七頁，共七十頁，2022年，8月28日流速、柱長對分離的影響

第三十八頁，共七十頁，2022年，8月28日加樣量與層析柱床體積及檢測方法的靈敏度有關(guān)。床體積越小、方法靈敏度越高時，加樣量越少層析的目的在于分析時，加樣量占床體積的1～2％，作制備、脫鹽用時，占20～30％一般來說，加樣量越少，分辨率越高。具體加樣體積由分配系數(shù)(Kav)或洗脫體積(Ve)來決定三、加樣與洗脫（一）加樣第三十九頁，共七十頁，2022年，8月28日第四十頁，共七十頁，2022年，8月28日

VeA、VeB：組分A、B的洗脫體積

KavA、KavB：組分A、B的分配系數(shù)Vs：A、B兩組分的洗脫體積之差（又稱為分離體積）Vs=VeA－VeB

當(dāng)樣品體積Vp＝Vs時，理論上的洗脫圖形是兩種物質(zhì)恰好分開(圖中Ⅲ)。但由于樣品流過柱時的擴(kuò)散作用，其體積會逐漸增大，致使其洗脫體積遠(yuǎn)比原來大加樣量（Vp）的確定第四十一頁，共七十頁，2022年，8月28日

圖Ⅱ、Ⅲ中A、B兩種物質(zhì)有一定程度的交叉，這表明二者只是部分分開。因此，當(dāng)Vp等于或大于Vs時，A、B兩種物質(zhì)就不能完全分開(圖中Ⅱ)

當(dāng)Vp＜Vs時，A、B兩種物質(zhì)就能分開(圖中Ⅰ)

根據(jù)Ve=Vo+Kav（Vt－Vo）又Vs=VeA－VeB

=（KavA－KavB）（Vt－Vo）第四十二頁，共七十頁，2022年，8月28日

Vs=（KavA－KavB）（Vt－Vo）=（KavA－KavB）（Vi+Vg）

A、B兩種物質(zhì)能分開的最低限：Vp＝Vs最大Vs時的必要條件：①KavA－KavB最大，為1－0＝1②Vi+Vg最大，一般為Vt/2則：最大理論加樣量Vp＝Vs＝Vt/2

最大理論加樣量的計算第四十三頁，共七十頁，2022年，8月28日

為提高分離效果，除了縮小加樣體積以外，樣品的黏度也一般以小于2cp(厘帕，P=N/m2·s)，或者與洗脫液的黏度相當(dāng)為宜葡聚糖使粘度上升

黏度的影響第四十四頁，共七十頁，2022年，8月28日粘度對柱層析的影響

第四十五頁，共七十頁，2022年，8月28日1.洗脫液的選擇原則

能溶解被洗脫物質(zhì)而又不使其變性或失活一般以單一緩沖液（如PBS、Tris-HCl緩沖液等）或鹽溶液，有時甚至用D.W作為洗脫液2.洗脫速度

若流速不均勻，收集的每一部分洗脫體積不恒定，Kav就難以確定最好的裝置是恒流泵(微量泵、蠕動泵)，可以使流速在較大范圍內(nèi)恒定。若無此裝置，可用控制操作壓的辦法進(jìn)行，其裝置可使用恒壓瓶

一般，洗脫速度慢，分離效果就好；但若太慢，又會因擴(kuò)散加劇而影響分離效果(二)洗脫第四十六頁，共七十頁，2022年，8月28日。第四十七頁，共七十頁，2022年，8月28日

SephadexG-50及其以下（交聯(lián)度大）的流速與操作壓之間的關(guān)系遵守Darcy’s規(guī)律u：線性流速(ml/cm2·h)K：常數(shù)(粗、中、細(xì)顆粒的各不相同)△P：操作壓(cp)L：柱長流速與操作壓第四十八頁，共七十頁，2022年，8月28日

Ko僅與凝膠的性質(zhì)有關(guān)，而與柱子直徑基本無關(guān)。但是G-75以上各種型號交聯(lián)葡聚糖的流速還與柱直徑大小有關(guān)

當(dāng)洗脫液的黏度為lcp時的表達(dá)式第四十九頁，共七十頁，2022年，8月28日第五十頁，共七十頁，2022年，8月28日

一般，洗脫流速慢，則分離效果就好；但太慢又會因擴(kuò)散加劇而影響分離效果第五十一頁，共七十頁，2022年，8月28日四、凝膠柱的再生及保存（一）再生

使用過一次或幾次的凝膠柱，通常用3～4倍床體積的洗脫液沖洗，再用平衡液平衡即可；但使用過多次后，凝膠床體積變小、流動速度下降、雜質(zhì)過多等，其處理方法是

①先用水反復(fù)進(jìn)行逆向沖洗（反沖），再用緩沖液進(jìn)行平衡；

②把凝膠倒出，用低濃度的酸或堿按其預(yù)處理方法進(jìn)行處理，然后重新裝柱第五十二頁，共七十頁，2022年，8月28日①膨脹狀態(tài)即在水相中保存?？杉尤?.02%的疊氮鈉（NaN3）溶液等防腐劑或加熱滅菌后于低溫短時間保存。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等為防腐劑。因為它們能引起凝膠顆粒的收縮，同時還能進(jìn)入層析儀器的塑料部件，使塑料變軟，造成不良后果（二）保存第五十三頁，共七十頁，2022年，8月28日第五十四頁，共七十頁，2022年，8月28日②半收縮狀態(tài)：

用完后水洗凈，然后再用60%～70%乙醇洗，則凝膠體積縮小，于低溫較長時間保存③干燥狀態(tài)：

用水洗凈后，加入含乙醇的水洗，并逐漸加大含醇量，最后用95%乙醇洗，則凝膠脫水收縮，再用乙醚洗去乙醇，抽濾至干，于60～80℃烘干后長時間保存

不脫水而直接烘干會黏結(jié)成塊

第五十五頁，共七十頁，2022年，8月28日第四節(jié)應(yīng)用第五十六頁，共七十頁，2022年，8月28日原理：鹽類小分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠篩孔，而大分子物質(zhì)則被排阻在外（分子篩原理）優(yōu)點：與透析相比，速度快，不會引起大分子物質(zhì)變性材料：細(xì)顆粒葡聚糖凝膠G-25

一、脫鹽和濃縮第五十七頁，共七十頁，2022年，8月28日分離對象：溶解度、帶電性等理化性質(zhì)相似而分子質(zhì)量不同，或者是聚合度不等的混合物溶液實例：SephadexG-200層析純化AFP制備Ag-Ab復(fù)合物溶于少量0.1mol/LGly-HCl緩沖液中，并用本液透析2h上SephadexG-200柱得AFP峰置0.1mol/L檸檬酸-磷酸緩沖液（pH4.8）透析上柱洗脫AFP純品二、分離生命物質(zhì)第五十八頁，共七十頁，2022年，8月28日第五十九頁，共七十頁，2022年，8月28日第六十頁，共七十頁，2022年，8月28日熱源物質(zhì)：指微生物產(chǎn)生的分子量很大的某些多糖蛋白復(fù)合物等，能使人體發(fā)熱的物質(zhì)材料：SephadexG-25（80~120目）特點：比活性炭吸附、離子交換吸附等方便

實例：用SephadexG-25凝膠層析除去氨基酸粗品中的熱源質(zhì)：利用熱源（大分子蛋白類）的Kav=0，而氨基酸的Kav≈1，將試劑量控制在柱體積的20~30%，能實現(xiàn)完全分離三、去熱源物質(zhì)第六十一頁，共七十頁，2022年，8月28日原理：Kav=－blgM+c或lgM=a－dKav(M為分子質(zhì)量，常