疏水層析相互作用

關(guān)于疏水層析相互作用第一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日一、疏水層析的概念及原理

“疏水作用”一詞是Kauzmann于1959年首次在“蛋白質(zhì)進(jìn)展”雜志中提出的，隨后陸續(xù)有學(xué)者發(fā)表用疏水層析成功分離蛋白質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道；如鈣調(diào)蛋白、苯丙氨酸裂解酶、凝集素等。（一）疏水層析的來(lái)歷及概念

1972年，ErelZ.等人將不同鏈長(zhǎng)的α，ω—二胺同系物鍵合在瓊脂糖上，以不同pH的含鹽緩沖液作流動(dòng)相成功純化了糖原磷酸化酶，開(kāi)始確立了疏水層析在分離純化某些疏水蛋白質(zhì)、肽類(lèi)等生物大分子的重要作用。

疏水層析的原理完全不同于離子交換層析或凝膠過(guò)濾層析等技術(shù)，使該技術(shù)與后兩者經(jīng)常聯(lián)合使用來(lái)分離復(fù)雜的生物樣品；

目前該技術(shù)主要應(yīng)用領(lǐng)域是在蛋白質(zhì)的純化方面，成為血清蛋白、膜結(jié)合蛋白、核蛋白、受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細(xì)胞等分離時(shí)的有效手段。第二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日

（二）原理

疏水層析是利用被分離組分分子表面的疏水微區(qū)、（可逆）變性后暴露出的疏水殘基，或在高鹽環(huán)境下暴露于分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性配體之間的作用強(qiáng)弱，依次用從高至低離子強(qiáng)度洗脫液可將疏水作用由弱到強(qiáng)的組分分離開(kāi)。高濃度鹽與水分子發(fā)生強(qiáng)烈作用，導(dǎo)致疏水分子周?chē)纬煽昭ǖ乃肿訙p少，促進(jìn)疏水性分子與介質(zhì)的疏水配基之間發(fā)生結(jié)合。第三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日高濃度鹽與水分子發(fā)生強(qiáng)烈作用，導(dǎo)致疏水分子周?chē)纬煽昭ǖ乃肿訙p少，促進(jìn)疏水性分子與介質(zhì)的疏水配基之間發(fā)生結(jié)合基質(zhì)疏水配基疏水補(bǔ)丁第四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日疏水相互作用的機(jī)制A.高離子強(qiáng)度環(huán)境下（高鹽濃度），疏水性樣品分子結(jié)合在填料上。B.隨著鹽濃度降低，結(jié)合的樣品分子按照疏水性強(qiáng)弱洗脫下來(lái)第五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日二、疏水層析過(guò)程

介質(zhì)的選擇樣品的準(zhǔn)備層析條件的優(yōu)化

第六頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日（一）、介質(zhì)（基質(zhì)+配基）的選擇

基質(zhì)主要有多糖類(lèi)如瓊脂糖、纖維素和人工合成聚合物類(lèi)如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯類(lèi)。其中，半剛性的瓊脂糖類(lèi)凝膠仍是應(yīng)用最廣泛的疏水介質(zhì)。近年來(lái)研制超大(superporous)瓊脂糖，在擴(kuò)散孔的基礎(chǔ)上增加了對(duì)流孔，在流速較高的條件下獲較好的分辨率。殼聚糖具有良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，近年來(lái)在疏水層析中也得到了應(yīng)用第七頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日

HIC介質(zhì)的疏水配基主要為烷基和芳香基，與反相層析介質(zhì)相比，其烷基通常在C8以下，芳香基多為苯基。

R代表疏水配基，M代表基質(zhì)。調(diào)節(jié)兩種反應(yīng)物的比例可控制介質(zhì)的配基密度第八頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日偶聯(lián)至基質(zhì)的常見(jiàn)配基類(lèi)型（A）丁基，（B）辛基，（C）苯基，（D）新戊基

第九頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日

對(duì)某些蛋白而言，上述有些配基與其結(jié)合力太強(qiáng)，為洗脫有時(shí)需用有機(jī)溶劑，有變性風(fēng)險(xiǎn)；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不僅可提供足夠的結(jié)合力，且避免了上述缺點(diǎn)。第十頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日常用的疏水層析介質(zhì)⒈O(jiān)ctylSepharose4FastFlow(辛基瓊脂糖凝膠4FF)

工作pH范圍為3-13,清洗pH范圍為2-14,工作的最大速度是600cm/h,載量為每ml填料結(jié)合50μmol正辛烷基，疏水性中等，適合各種蛋白的分離和純化。⒉ButylSepharose4FastFlow(丁基瓊脂糖凝膠4FF)工作pH范圍為3-13，清洗pH范圍為2-14，工作的最大速度是600cm/h,載量為每ml填料結(jié)合50umol正丁烷基，疏水性最弱，適合含脂族配體的生物分子。第十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日⒊PhenylSepharose6FastFlow(苯基瓊脂糖凝膠4FF)

疏水性最強(qiáng)，載量高，適合含芳香族配體的生物分子的預(yù)處理，載量為每ml填料結(jié)合40umol苯基，工作pH范圍為3-13，清洗pH范圍為2-14，工作的最大速度是600cm/h。⒋PhenylSepharoseCL-4B(苯基瓊脂糖凝膠CL-4B)

疏水性較Octyl弱，適用于分離和純化對(duì)疏水性尚未了解的蛋白，載量為每ml填料結(jié)合40umol苯基；工作pH范圍為3-13，清洗pH范圍為2-14，工作的最大速度是50cm/h。第十二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日在HIC中，應(yīng)選機(jī)械強(qiáng)度較大的剛性基質(zhì)；若待分離物質(zhì)分子量很大，且樣品量較大，則應(yīng)選大孔基質(zhì)，如瓊脂糖凝膠；若待分離物質(zhì)較小，或樣品量很小，但分辨率的要求高，則可選孔徑小的基質(zhì)甚至非孔型基質(zhì)。HIC介質(zhì)中，烷基配基的鏈長(zhǎng)大多在C4～C8之間，苯基的疏水性大致與戊基相當(dāng)，因與溶質(zhì)發(fā)生π-π相互作用，它與戊基有不同的選擇性，而寡聚乙二醇固定相的疏水性介于丁基與苯基之間。第十三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日不同的介質(zhì)對(duì)同一樣品有不同的分離效果：第十四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日填料的篩選試驗(yàn)

試管法篩選填料1.取6支試管，標(biāo)號(hào)1，2，3，4，5，6；2.取不同的填料，分裝于6支離心管中；3.向裝了填料的試管中加入樣品；4.混勻，離心，分別檢測(cè)6支試管上清的樣品活性；5.選擇目的蛋白結(jié)合效果最好的填料。123456管號(hào)各種填料的試管分別向各試管中加入樣品第十五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日預(yù)裝柱篩選法試驗(yàn)流程：1.平衡緩沖液：50mM磷酸鹽、PH7.0，再加入硫酸銨。2.洗脫緩沖液：50mM磷酸鹽、PH7.0。3.樣品準(zhǔn)備:往樣品中添加適量濃度的硫酸銨，使樣品溶液中的鹽濃度與平衡緩沖液中基本一致，并調(diào)節(jié)樣品溶液的pH。（后將介紹樣品準(zhǔn)備的硫酸銨沉淀法）4.用1ml/min的流速，5-10個(gè)CV的平衡緩沖液平衡柱子。5.用1ml/min的流速上樣，上樣過(guò)程中收集穿透液。選取不同填料的1ml的預(yù)裝柱進(jìn)行試驗(yàn)第十六頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日6.上完樣后以1ml/min的流速，繼續(xù)用平衡緩沖液沖洗直到紫外、電導(dǎo)基線(xiàn)平穩(wěn)（至少5個(gè)CV），過(guò)程中收集洗脫物。7.用洗脫緩沖液以1ml/min的流速進(jìn)行洗脫，洗3-5個(gè)CV，收集洗脫峰。8.檢測(cè)每一個(gè)預(yù)裝柱洗脫下來(lái)的洗脫峰的純度及含量。

選擇目的蛋白能夠結(jié)合并且洗脫下來(lái)效果最好的填料，如果進(jìn)行梯度洗脫，選擇選擇性和分辨率最好的填料第十七頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日基本原理

硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)。用此方法可以將主要的免疫球蛋白從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來(lái)。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來(lái)沉淀不同的蛋白質(zhì)。這種方法稱(chēng)之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來(lái)表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用最廣。（二）、樣品準(zhǔn)備（即樣品處理）----實(shí)例試劑耗材及設(shè)備硫酸銨沉淀法-----抗體的純化1.血清；2.硫酸銨飽和溶液:硫酸銨800g~850g加水1000ml，加熱至絕大部分溶質(zhì)溶解為止，趁熱過(guò)濾，置室溫過(guò)夜，然后以28％NH4OH調(diào)pH至7.0；3.0.01mol/LpH7.4PBS溶液；用0.10mol/LNaH2PO4溶液和0.10mol/LNa2HPO4溶液按一定比例混合；4.透析袋；5.高速冷凍離心機(jī)；6.PH計(jì)。第十八頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)過(guò)程1.取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入（NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成20%（NH4)2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30min。2.40C、3000r/min離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。3.在上清液中再加（NH4)2SO4飽和溶液30ml，使成為50%（NH4)2SO4溶液，充分混合，靜置30min。4.40C、3000r/min離心20min，棄上清。5.于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加（NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成為33%（NH4)2SO4溶液，充分混合后，靜置30min。6.40C、3000r/min離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復(fù)步驟5，2~3次。7.用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。8.透析除鹽，在純水中透析過(guò)夜，再在生理鹽水中于4℃透析24h，中間換液數(shù)次。9.透析液中的鹽可以使用脫鹽柱SephadexTMG-25除去。第十九頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日（三）、層析條件的優(yōu)化緩沖體系和PH的選擇離子強(qiáng)度的選擇其他鹽的選擇洗脫方式的選擇第二十頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日

疏水層析緩沖液中的pH對(duì)整個(gè)分離的影響不大，一般調(diào)至中性（6－8）左右.溶液的pH值主要考慮能維持生物大分子生物活性的pH環(huán)境，而且蛋白質(zhì)結(jié)合疏水填料的能力一般在pH6-8下沒(méi)有什么變化。當(dāng)溶液的pH接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，其疏水性增加，有利于與配基結(jié)合。（若緩沖液的PH為蛋白的PI，則蛋白易發(fā)生沉淀）1.緩沖體系和PH的選擇：PH的選擇第二十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日緩沖體系的選擇試管法篩選緩沖體系向各試管中加入不同的緩沖體系管號(hào)12341.取4支試管，標(biāo)號(hào)1，2，3，4；2.配置不同的緩沖體系如Tris-Hcl、PBS、NaAc-HAc、檸檬酸-檸檬酸鈉等；3.向4支試管中加入2中配制的不同緩沖體系；4.混勻，靜置2h后檢測(cè)4支試管中樣品活性及穩(wěn)定性；5.選擇活性及穩(wěn)定性最好的緩沖體系。實(shí)驗(yàn)過(guò)程

未知樣品建議使用的緩沖液：起始緩沖液：1.5M硫酸銨，50mM

PBS，PH7.0洗脫緩沖液：50mM

PBS，PH7.0第二十二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日如同填料選擇一樣，疏水相互作用層析中鹽的選擇也是不斷嘗試的過(guò)程，因?yàn)槊糠N鹽在促進(jìn)疏水相互作用方面的能力都不同，隨著鹽濃度的增加，結(jié)合的蛋白幾乎隨著線(xiàn)性增加，直到一個(gè)特殊的鹽濃度，然后隨著鹽濃度的增加，結(jié)合的蛋白呈指數(shù)形式增加

在實(shí)踐中，鈉、鉀或銨的硫酸鹽具有有效的促進(jìn)了疏水相互作用層析中配基和蛋白的相互作用，并且對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用。因此，最通常使用的鹽是硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉、氯化鉀和醋酸銨。2.鹽的選擇

建議：1.在給定的濃度下，和其他鹽相比，硫酸銨能夠給出最好的分辨率，可以使用的最高濃度是2M。2.3M的鹽濃度通常需要使用氯化鈉3.硫酸鈉是一種非常好的鹽析試劑，但是在高濃度下，蛋白不是穩(wěn)定定。4.硫酸銨不推薦在PH8.0下使用第二十三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日下圖顯示的是不同的鹽如何影響選擇性的.按出峰順序依次為：細(xì)胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A，ａ-糜蛋白酶原第二十四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日3.離子強(qiáng)度的選擇在所使用的鹽的種類(lèi)確定的前提下，鹽濃度的高低會(huì)影響溶質(zhì)分子與介質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度及介質(zhì)的結(jié)合容量。蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用隨緩沖液的離子強(qiáng)度提高而增加，因此HIC通常在略低于鹽析點(diǎn)的鹽濃度上樣吸附，而洗脫時(shí)逐漸降低洗脫液的離子強(qiáng)度。下圖為不同離子強(qiáng)度對(duì)蛋白分離的選擇性的影響：在這個(gè)例子中，目的蛋白是最后一個(gè)洗脫峰。在（a）中，目的蛋白在較窄的區(qū)域洗脫，容易造成雜質(zhì)和目的蛋白一起被洗脫下來(lái)；在（b）中，此時(shí)在上一次使用較高鹽濃度運(yùn)行過(guò)程中結(jié)合的雜蛋白現(xiàn)在在初始的洗脫階段洗脫，剩下目的蛋白結(jié)合著，降低了雜質(zhì)和目的蛋白一起洗脫下來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，并且增加了柱子對(duì)目的蛋白的載量；（c）圖,由于初始鹽濃度較低，樣品在上樣的過(guò)程中結(jié)合的不夠緊，導(dǎo)致在洗脫過(guò)程中洗脫峰顯著的展寬。第二十五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日離子強(qiáng)度確定方法試管法123456管號(hào)↓↓↓↓↓↓2.0M1.5M1.0M0.5M0.1M0.05M鹽以硫酸銨為例加入各濃度的硫酸銨實(shí)驗(yàn)過(guò)程：1.取六支試管，標(biāo)號(hào)為1，2，3，4，5，6；2.向6支試管中加入含不同濃度硫酸銨的平衡緩沖液；3.向各試管中加入樣品；4.混勻，靜置30-60min；5.取上清，檢測(cè)上清液中蛋白含量及純度；6.選擇目的蛋白剛好完全結(jié)合而雜質(zhì)不結(jié)合或結(jié)合很少的鹽濃度。第二十六頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日預(yù)裝柱法實(shí)驗(yàn)過(guò)程：1.配置含有不同濃度硫酸銨（0.05M-2M）的平衡緩沖液；2.1ml/min的流速，用5-10個(gè)CV的平衡緩沖液（含2M的硫酸銨）平衡柱子；3.用1ml/min的流速上樣，收集穿透液；4.1ml/min的流速，至少用5個(gè)CV的起始緩沖液（含2.0M的硫酸銨）繼續(xù)平衡柱子直到紫外、電導(dǎo)基線(xiàn)平穩(wěn)；5.1ml/min的流速，用3-5個(gè)CV的洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰；6.重復(fù)2-5步驟，每次將上述步驟2中的平衡緩沖液改為含1.5M硫酸銨的平衡緩沖液。直到使用含有0.05M硫酸銨的起始緩沖液；7.分析所有的洗脫峰，檢測(cè)純度和結(jié)合到柱子上的量；8.確定能夠讓目的蛋白結(jié)合而雜蛋白流出的鹽濃度。確定需要使目的蛋白完全洗脫下來(lái)的最低的鹽濃度。使用1ml的預(yù)裝柱第二十七頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日4.洗脫方式的選擇

結(jié)合的蛋白可以通過(guò)控制降低鹽濃度來(lái)洗脫。根據(jù)分離的目的可以選擇線(xiàn)性梯度洗脫或者逐步洗脫。（1）線(xiàn)性梯度洗脫：1.高分辨率的分離或分析；2.確定逐步洗脫的條件；3.在保持需要的分辨率條件下可用增加流速來(lái)優(yōu)化梯度洗脫。

線(xiàn)性梯度洗脫是最常用的洗脫方式：當(dāng)從一個(gè)未知的樣品開(kāi)始時(shí)，通常使用線(xiàn)性梯度洗脫，盡可能的讓各種組分結(jié)合在填料上，然后分別洗脫下來(lái)看總的蛋白圖樣。隨著緩沖液中鹽濃度的降低，疏水相互作用也會(huì)逐漸減弱，結(jié)合的物質(zhì)開(kāi)始被洗脫。特點(diǎn)

用10-30個(gè)柱體積進(jìn)行梯度洗脫，增加洗脫緩沖液的比例，直到鹽濃度達(dá)到最低即無(wú)鹽緩沖液。第二十八頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日（2）逐步洗脫：洗脫步驟：第一步，洗脫緩沖液的鹽濃度和體積經(jīng)過(guò)優(yōu)化來(lái)洗脫所有和柱子結(jié)合能力比目的蛋白弱的的物質(zhì)，注意，鹽濃度和緩沖液體積應(yīng)該足夠大，以用來(lái)洗脫結(jié)合弱的雜質(zhì)，但是一定不能低于目的蛋白開(kāi)始共同洗脫出峰的水平。（例如目的蛋白被洗脫出峰的鹽濃度為1.2M,則洗脫緩沖液的鹽濃度應(yīng)高于1.2M）第二步，鹽濃度降低到目的蛋白洗脫的水平。注意，鹽濃度應(yīng)該足夠低來(lái)洗脫目的蛋白而不過(guò)分稀釋?zhuān)菨舛扔直仨毐３指哂谝欢ㄋ揭苑乐菇Y(jié)合的雜質(zhì)被共同洗脫。第三步，鹽濃度進(jìn)一步降低來(lái)洗脫殘余的雜質(zhì)，這一步可以直接用無(wú)鹽緩沖液。第四步，柱子用起始緩沖液平衡，為下一步做準(zhǔn)備。

最多用5個(gè)柱體積的洗脫緩沖液（鹽濃度低于起始緩沖液的濃度）洗脫結(jié)合蛋白，重復(fù)，降低每一步的鹽濃度，直到目的蛋白被洗脫下來(lái)。

當(dāng)疏水層析作用已經(jīng)用線(xiàn)性梯度洗脫優(yōu)化過(guò)了，轉(zhuǎn)換到逐步洗脫可以降低分離所用的總柱體積數(shù)，有助于加快分離時(shí)間，減少緩沖液消耗，而且保持需要的純度，這種類(lèi)型的逐步洗脫通常用于常規(guī)的、大規(guī)模的分離。

特點(diǎn)第二十九頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日5.其他

一般柱溫升高，生物大分子的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，疏水作用增加，吸附能力增加，有利于提高層析柱的分離度，所以有時(shí)可以通過(guò)提高柱溫來(lái)增加疏水基團(tuán)與配基間的相互作用，分離性質(zhì)相近的化合物，如對(duì)分離一些小分子是非常有效的。但是對(duì)于具有生物活性的物質(zhì)或酶類(lèi)，在高溫條件下易變性失活，因此不宜在高溫條件下進(jìn)行分離。一般都在常溫或低溫下操作。

如下圖說(shuō)明了樣品、起始和洗脫緩沖液、柱子、層析設(shè)備在相同溫度的重要性。兩次分離都在室溫（23度），相同的條件下（除了樣品溫度在23或4度)進(jìn)行。所有的組分都在同一溫度時(shí)，目的蛋白結(jié)合了，然后在梯度的中間被洗脫，而樣品的溫度在4度時(shí)，目的蛋白在穿透中洗脫。（1）.柱溫第三十頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日根據(jù)分離階段的不同，流速也不一樣。如在平衡、洗滌、再平衡的過(guò)程中可以稍微提高流速；在上樣和線(xiàn)性洗脫或時(shí)建議使用低流速，以免流穿或分離不開(kāi)。（2）.流速（3）.上樣量第三十一頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日三、應(yīng)用蛋白類(lèi)（包括酶）、肽類(lèi)的分離

鈣調(diào)蛋白的純化疏水作用層析法純化抗乙肝病毒核心抗原單克隆抗體第三十二頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日牛皮層骨中純化酸性磷酸酶：ABCD（A）CM-Sepharose陽(yáng)離子交換層析，（B）磷酸纖維素親和層析，（C）SephacrylS-200凝膠過(guò)濾層析，（D）Phenyl-Sepharose疏水作用層析

第三十三頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日鈣調(diào)蛋白純化過(guò)程1.除去填料中的乙醇后，以50%（m/v）濃度懸于10mmol/LTris-HclPH8.0,1mmol/LMgCL2，

2mmol/LEDTA,1mmol/Lａ-巰基乙醇（E液）---50mmol/LNacl,1mmol/L尿素的溶液中;2.層析柱（2.5cm*10cm，裝40ml填料）：用3-5個(gè)CV的10mmol/LTris-HclPH8.0,1mmol/LMgCL2，2mmol/LEDTA,1mmol/Lａ-巰基乙醇（F液），進(jìn)行平衡；3.將離子交換層析分離好的鈣調(diào)蛋白，用F液透析后，補(bǔ)加固體CaCl2于樣品（終濃度為1mmol/L,，確保鈣離子處于飽和狀態(tài)，并有效的與固定相結(jié)合），接著上樣；4.用2-4CV的含0.2mol/LNaCl的F液進(jìn)行洗脫，以除去吸附力弱的雜質(zhì)及與鈣調(diào)蛋白結(jié)合的一些蛋白；5.用含0.2mol/LNaCl的E液進(jìn)行洗脫，使有效成分解離（EDTA對(duì)Ca2+有較大的親和力，Mg2+可置換柱中Ca2+）；6.即可得到較為純的雞胗鈣調(diào)蛋白。

鈣調(diào)蛋白的外形似啞鈴,有兩個(gè)球形的末端,中間被一個(gè)長(zhǎng)而富有彈性的螺旋結(jié)構(gòu)相連,每個(gè)末端有兩個(gè)Ca2+結(jié)構(gòu)域,每個(gè)結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合一個(gè)Ca2+,這樣,一個(gè)鈣調(diào)蛋白可以結(jié)合4個(gè)Ca2+,鈣調(diào)蛋白與Ca2+結(jié)合后的構(gòu)型相當(dāng)穩(wěn)定。苯基-SepharoseCL-4B第三十四頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日疏水作用層析法純化抗乙肝病毒核心抗原單克隆抗體目的:采用疏水作用層析法純化小鼠腹水來(lái)源的抗乙肝核心抗原(HBcAg)單克隆抗體(mAb),并對(duì)分離條件進(jìn)行優(yōu)化。方法:

采用不同疏水層析介質(zhì)、溶液pH和NaCl濃度,研究其對(duì)抗體吸附的影響,以及分析不同的洗脫方式和洗脫體積對(duì)抗體洗脫的影響,并用ELISA法檢測(cè)純化后抗體的活性。結(jié)果:疏水作用層析法純化小鼠腹水來(lái)源的抗HB2cAgmAb(IgG1)的最適條件是以pH7.0、20mmol/LPB+1.2mol/L(NH4)2SO4為上樣緩沖液,采用1.2～0mol/L(NH4)2SO4,12CV梯度進(jìn)行洗脫,獲得的mAb純度大于75%,回收率達(dá)80%,純化后mAb的活性保持良好。結(jié)論:采用疏水作用層析對(duì)mAb進(jìn)行純化,并優(yōu)化了各步實(shí)驗(yàn)條件,為建立具有抗體純度高、生物學(xué)活性好、易于放大的抗HBcAg的mAb的純化方法提供了必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)第三十五頁(yè)，共四十一頁(yè)，2022年，8月28日

近年來(lái)，隨著層析技術(shù)的發(fā)展，與HIC相關(guān)的其它層析技術(shù)也得到了發(fā)展，主要有以下兩種：

1）親硫性疏水層析(thio—philicchromatography)

2）疏水電荷誘導(dǎo)層析(HCIC)

四、