第十四章 細(xì)胞分子生物學(xué)相關(guān)儀器

第十四章細(xì)胞分子生物學(xué)相關(guān)儀器永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院楊曉斌2教學(xué)基本要求掌握流式細(xì)胞儀的工作原理、基本結(jié)構(gòu)和檢測(cè)信號(hào)掌握PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理和常用變溫方式熟悉流式細(xì)胞儀的主要部件和性能指標(biāo)熟悉PCR擴(kuò)增儀的分類、溫控方式和主要性能指標(biāo)了解流式細(xì)胞術(shù)和PCR儀的特點(diǎn)、應(yīng)用與常見故障第二節(jié)PCR基因擴(kuò)增儀2第一節(jié)流式細(xì)胞儀31第一節(jié)流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀的工作原理與結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀的常見故障與排除5流式細(xì)胞術(shù)和流式細(xì)胞儀概述31流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)與技術(shù)要求34第一節(jié)流式細(xì)胞儀6流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用31返回章目錄信號(hào)檢測(cè)與分析313331326流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）:應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)于處在快速直線流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行快速的、多參數(shù)的定量分析和分選的技術(shù)稱為流式細(xì)胞術(shù)。FCM也叫熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(fluorescenceactivatedcellsortingFACS)。

一、流式細(xì)胞術(shù)和流式細(xì)胞儀概述返回節(jié)目錄7流式細(xì)胞儀（flowcytometer，F(xiàn)CM）:以激光為光源，集流體力學(xué)技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。

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分析對(duì)象：生物顆粒（細(xì)胞、免疫復(fù)合物、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、細(xì)胞器、細(xì)菌、病毒等）

應(yīng)用范圍：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)，細(xì)胞遺傳學(xué)，分子生物學(xué)，藥理學(xué)，病理學(xué)等；臨床檢驗(yàn)：血液學(xué)，腫瘤學(xué)

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1.1934年,moldvan提出細(xì)胞計(jì)數(shù)流式自動(dòng)化設(shè)想

2.1949年,Wallacecoulter發(fā)明懸液計(jì)數(shù)粒子方法專利

3.20世紀(jì)70年代：制造出比較完善的商品化流式細(xì)胞儀,主要生產(chǎn)廠家是美國的Becton-Dickinson(BD)公司和Coulter公司

4.20世紀(jì)80年代以來：儀器性能向著多光束、多參數(shù)、多用途；儀器向著小型化、自動(dòng)化和簡(jiǎn)單化發(fā)展。

發(fā)展簡(jiǎn)史10二、流式細(xì)胞儀的工作原理和基本結(jié)構(gòu)生物顆粒分析原理細(xì)胞分選原理31323334流式細(xì)胞儀的分類流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)返回節(jié)目錄111.樣品的進(jìn)入流動(dòng)室將懸浮分散的單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異熒光染料染色后，放人樣品管。在氣體壓力的作用下，懸浮在樣品管中的單細(xì)胞懸液形成樣品流垂直進(jìn)入流式細(xì)胞儀的流動(dòng)室，沿流動(dòng)室的軸心向下流動(dòng)。（一）生物顆粒分析原理122.鞘液的作用流動(dòng)室軸心至外壁的鞘液也向下流動(dòng)，形成包繞細(xì)胞懸液的鞘液流，鞘液和樣品流在噴嘴附近組成一個(gè)圓柱流束，自噴嘴的圓形孔噴出，與水平方向的激光束垂直相交，相交點(diǎn)稱為測(cè)量區(qū)。

133.信號(hào)的產(chǎn)生與接收染色的細(xì)胞在測(cè)量區(qū)受激光照射后發(fā)出熒光，同時(shí)產(chǎn)生光散射。這些信號(hào)分別被光電倍增管和光電二極管接收，經(jīng)過計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存、計(jì)算、分析這些數(shù)字化信息，就可得細(xì)胞的大小和核酸含量等指標(biāo)。14FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(光電倍增管PMT3,PMT4etc.)15分選：當(dāng)某類細(xì)胞的特性與要分選的細(xì)胞相同時(shí)，流式細(xì)胞儀就會(huì)在這類細(xì)胞形成液滴時(shí)給含有這類細(xì)胞的液滴充以特定的電荷，帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板間的靜電場(chǎng)時(shí)，依所帶電荷的符號(hào)分別向左偏轉(zhuǎn)或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)。（二）生物顆粒分選原理16流式細(xì)胞儀分選系統(tǒng)FACSVantage488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector17流式細(xì)胞儀根據(jù)功能不同可分為臨床型和科研型。臨床型只有分析功能，沒有分選功能，操作簡(jiǎn)便，易學(xué)易掌握?？蒲行图扔蟹治龉δ苡钟蟹诌x功能，可快速將所感興趣的細(xì)胞分選出來。（三）流式細(xì)胞儀的分類18流式細(xì)胞儀根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同又可分為一般流式細(xì)胞儀和狹縫掃描流式細(xì)胞儀。前者的光斑直徑大于被檢細(xì)胞體積，只能提供細(xì)胞內(nèi)某種生物化學(xué)成分的參數(shù)。狹縫掃描流式細(xì)胞儀被檢細(xì)胞直徑大于激光光斑直徑，可計(jì)算出細(xì)胞直徑大小、核直徑大小、核漿比例等一系列的形態(tài)學(xué)信息的定量資料。

19狹縫掃描流式細(xì)胞儀

被檢細(xì)胞直徑大于激光光斑直徑，細(xì)胞通過光束時(shí)各部分被依次掃描。（四）流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)201.流動(dòng)室與液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個(gè)孔，供細(xì)胞單個(gè)流過，檢測(cè)區(qū)在該孔的中心，流動(dòng)室內(nèi)充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。樣品流在鞘流的環(huán)包下形成聚焦，保證每個(gè)細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而得到準(zhǔn)確的細(xì)胞熒光信息。

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由右圖可知，空氣泵產(chǎn)生壓縮空氣，通過鞘流壓力調(diào)節(jié)器加在鞘液上一恒定的壓力，這樣鞘液以勻速運(yùn)動(dòng)流過流動(dòng)室，在整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)行中流速是不變的。

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由于激光焦點(diǎn)處能量分布為正態(tài)分布（見圖），中心處能量最高。因此，當(dāng)樣本速率選擇高速時(shí)，處在樣本流不同位置的細(xì)胞或顆粒，受激光照射的能量不一樣，從而被激發(fā)出的熒光強(qiáng)度也不相同。

232.激光光源與光束成形系統(tǒng)激光是一種相干光源，它能提供單波長(zhǎng)、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照。由于細(xì)胞的快速流動(dòng)，每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時(shí)間僅為1μs左右，且細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱，與被照射的時(shí)間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞必須達(dá)到足夠的光照強(qiáng)度。

243.光學(xué)系統(tǒng)FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片和小孔組成。濾光片主要分為：1.長(zhǎng)通濾光片長(zhǎng)通濾光片使特定波長(zhǎng)以上的光通過。2.短通濾光片特定波長(zhǎng)以下的光通過。3.帶通濾光片帶通濾光片允許一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光通過25●光路系統(tǒng)側(cè)向角散射前向角散射不同熒光分析261．小水滴的形成壓電晶體帶動(dòng)流動(dòng)室振動(dòng)，液流形成水滴。噴嘴的振動(dòng)頻率即每秒鐘產(chǎn)生水滴的數(shù)目。當(dāng)噴嘴直徑為50μm時(shí)，信號(hào)頻率為40kHz，則每秒鐘產(chǎn)生4萬個(gè)水滴。若每秒鐘流出的細(xì)胞是1000個(gè)，則平均每40個(gè)水滴中只有一個(gè)水滴是有細(xì)胞的，其他皆為空白。

（五）細(xì)胞分選器272．邏輯電路為了分選細(xì)胞，需要細(xì)胞在經(jīng)過測(cè)量區(qū)時(shí)判斷出哪個(gè)細(xì)胞滿足了分選的條件，并產(chǎn)生一個(gè)邏輯信號(hào)，此信號(hào)驅(qū)動(dòng)充電脈沖發(fā)生器，使之產(chǎn)生充電脈沖。283．水滴的充電與偏轉(zhuǎn)當(dāng)水滴從流束上將要斷開時(shí)給整個(gè)流束充電，則水滴從流束上斷開后便帶有同極性的多余表面電荷。下落的水滴通過一對(duì)平行板電極形成的靜電場(chǎng)時(shí)，帶正電荷的水滴向帶負(fù)電的電極板偏轉(zhuǎn)，這樣就可用容器收集水滴。29分析流程30當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物，通過激光照射區(qū)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。這些信號(hào)以細(xì)胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號(hào)。三、信號(hào)檢測(cè)與分析（一）檢測(cè)的信號(hào)返回節(jié)目錄311.散射光信號(hào)散射光分為前向角散射和側(cè)向角散射，散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)(如染色)，稱為細(xì)胞的物理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。（1）前向角散射前向角散射與被測(cè)細(xì)胞的大小有關(guān)（2）側(cè)向角散射側(cè)向散射光可提供細(xì)胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的信息。32散射光信號(hào)前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

入射激光的前向散射光信號(hào) 反映細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積

側(cè)向角散射（SSC,SideScatter） 入射激光90角的散射光信號(hào) 細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對(duì)復(fù)雜性33前向角散射光FSCFALSSensorLaser34側(cè)向角散射光SSCFALSSensor90LSSensorLaser352.熒光信號(hào)當(dāng)激光光束與細(xì)胞正交時(shí)，一般會(huì)產(chǎn)生兩種熒光信號(hào)。一種是細(xì)胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號(hào)，稱為細(xì)胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒光素標(biāo)記細(xì)胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號(hào)，通過對(duì)這類熒光信號(hào)的檢測(cè)和定量分析能了解所研究細(xì)胞的性質(zhì)和數(shù)量。36FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(光電倍增管PMT3,PMT4etc.)熒光檢測(cè)37（二）熒光信號(hào)的測(cè)量（1）熒光信號(hào)線性測(cè)量和對(duì)數(shù)測(cè)量線性放大器的輸出與輸入是線性關(guān)系，細(xì)胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測(cè)量一般選用線性放大測(cè)量。在細(xì)胞膜表面抗原等的熒光檢測(cè)時(shí)通常使用對(duì)數(shù)放大器。38熒光染色雙色直接染色39（2）熒光信號(hào)的面積和寬度熒光信號(hào)的面積是采用對(duì)熒光光通量進(jìn)行積分測(cè)量，一般對(duì)DNA倍體測(cè)量時(shí)采用面積，這是因?yàn)闊晒饷}沖的面積比熒光脈沖的高度更能準(zhǔn)確反映DNA的含量。熒光信號(hào)的寬度常用來區(qū)分雙連體細(xì)胞。40EthidiumPEcis-ParinaricacidTexasRedPE-TRConj.PIFITC600nm300nm500nm700nm400nm457350514610632488不同熒光素和激發(fā)激光的波長(zhǎng)41（3）光譜重疊的校正當(dāng)細(xì)胞攜帶兩種熒光受激光激發(fā)而發(fā)射兩種不同波長(zhǎng)的熒光時(shí)，理論上可選擇濾片使每種熒光僅被相應(yīng)的檢測(cè)器檢測(cè)，但由于目前所使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射譜性質(zhì)，雖然它們之間發(fā)射峰值各不相同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊。42

從右圖中可以看出，陰影為探測(cè)器檢測(cè)光譜的范圍，F(xiàn)ITC探測(cè)器會(huì)探測(cè)到少量的PE光譜，而PE探測(cè)器則檢測(cè)到較多的FITC光譜。

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圖中點(diǎn)A通過透鏡f成像在A’處，而點(diǎn)B通過透鏡f成像在B’處。在光電倍增管前放上一小孔，作為空間濾波器，排除其它雜散光信號(hào)，從而確保了A點(diǎn)光源進(jìn)不了B’點(diǎn)處，B點(diǎn)光源也進(jìn)不了A’點(diǎn)處。

44目前FCM數(shù)據(jù)的存貯的方式均采用列表排隊(duì)(ListMode)方式。目前FCM所采用的都是多參數(shù)指標(biāo)，熒光標(biāo)記物參數(shù)數(shù)量在逐漸增多。采用ListMode方式可大量節(jié)約內(nèi)存和磁盤容量。（三）測(cè)量數(shù)據(jù)的存貯與顯示45直方圖分析46點(diǎn)圖分析47等高圖和密度圖分析48四、流式細(xì)胞儀的性能指標(biāo)和技術(shù)要求

熒光測(cè)量靈敏度；儀器的分辨率；前向角散射光檢測(cè)靈敏度；FCM分析速度；FCM分選指標(biāo)3132性能指標(biāo)：技術(shù)要求：樣品制備；熒光染料與熒光染色，質(zhì)量控制等返回節(jié)目錄49靈敏度的高低是衡量?jī)x器檢測(cè)微弱熒光信號(hào)的重要指標(biāo)。一般以能檢測(cè)到單個(gè)微球上最少標(biāo)有FITC或PE熒光分子數(shù)目來表示，現(xiàn)在的FCM均可達(dá)到檢測(cè)小于100個(gè)熒光分子的指標(biāo)。(一)性能指標(biāo)1.熒光測(cè)量靈敏度50分辨率是衡量?jī)x器測(cè)量精度的指標(biāo)，通常用變異系數(shù)CV(CoefficientofVariation)值表示：(δ是分布的標(biāo)準(zhǔn)誤差，是分布的平均值)2.分辨率51前向角散射光檢測(cè)靈敏度是指能夠檢測(cè)到的最小顆粒大小，一般目前商品化的FCM可以測(cè)量到0.2μ～0.5μ左右。3.前向角散射光檢測(cè)靈敏度52分析速度以每秒分析的細(xì)胞數(shù)來表示。當(dāng)細(xì)胞流過光束的速度超過FCM儀器響應(yīng)速度時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生的熒光信號(hào)就會(huì)丟失，這段時(shí)間稱為儀器的死時(shí)間。死時(shí)間越短，儀器處理數(shù)據(jù)越快，一般可達(dá)到3000～6000個(gè)/秒左右。大型機(jī)已達(dá)到每秒幾萬個(gè)細(xì)胞。4.FCM分析速度53分選指標(biāo)主要包括分選速度、分選純度和分選收獲率。分選速度指每秒可提取所要細(xì)胞的個(gè)數(shù)。分選純度指要分選的目的細(xì)胞占分選出細(xì)胞的百分比。分選收獲率指被分出的細(xì)胞與原來溶液中該細(xì)胞的百分比。5.FCM分選指標(biāo)54

1.檢測(cè)樣品制備的重要性因?yàn)榱魇郊?xì)胞儀測(cè)量的是每個(gè)細(xì)胞所產(chǎn)生的散射光和熒光信號(hào)，如果兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞間粘連重疊或細(xì)胞碎片過多，都會(huì)影響信號(hào)的收集及所收集信號(hào)的真實(shí)性，所以制備單細(xì)胞懸液是進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析最關(guān)鍵的第一步。（二）技術(shù)要求55

2.常用的熒光染料與標(biāo)記染色散射光信號(hào)是激光照在細(xì)胞上所產(chǎn)生的前向光和側(cè)向光信號(hào)。熒光信號(hào)來自于細(xì)胞的自發(fā)熒光或被分析細(xì)胞經(jīng)特異性熒光標(biāo)記染色后通過激光束激發(fā)后所產(chǎn)生的。因此，被分析細(xì)胞在制備成單細(xì)胞懸液后，經(jīng)過與熒光染料染色后才能上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。56

3.流式細(xì)胞儀操作技術(shù)的質(zhì)量控制在臨床檢測(cè)中，應(yīng)對(duì)各個(gè)工作環(huán)節(jié)和儀器性能進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和規(guī)范化操作，以保證各項(xiàng)檢測(cè)數(shù)據(jù)和指標(biāo)的可靠性。57光路與流路校正主要目的在于確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，使儀器檢測(cè)時(shí)的變異減少到最小，從而控制儀器的CV值。在流路校正物中，有標(biāo)準(zhǔn)大小的熒光微球，其物理性質(zhì)、生物學(xué)特性和化學(xué)特性均經(jīng)過標(biāo)定。

58PMT校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀在使用過程中，光電倍增管隨時(shí)間的增加，其放大功率會(huì)有所改變，對(duì)樣品檢測(cè)的靈敏度會(huì)產(chǎn)生影響。為保證樣品檢測(cè)時(shí)儀器處于最佳工作狀態(tài)，采用質(zhì)控品進(jìn)行PMT校準(zhǔn)，必要時(shí)進(jìn)行電壓補(bǔ)償。59絕對(duì)計(jì)數(shù)的校準(zhǔn)為保證儀器在計(jì)數(shù)時(shí)的準(zhǔn)確性，儀器應(yīng)采用絕對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品建立絕對(duì)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)品是經(jīng)標(biāo)定的，如以計(jì)算1000個(gè)細(xì)胞為1ml，作為設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。在樣本測(cè)定時(shí)，以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行絕對(duì)計(jì)數(shù)，從而獲得絕對(duì)計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)值。60五、FCM的維護(hù)及常見故障的排除（一）儀器的維護(hù)1.激光電源的波動(dòng)范圍應(yīng)小于±10%。2.冷卻水須用過濾器，并保證壓力和流量。3.室溫在18℃～24℃，相對(duì)濕度小于85%。4.安裝單獨(dú)的可靠的地線。5.儀器操作必須有經(jīng)過培訓(xùn)的人員操作。6.樣品和鞘液管道每周應(yīng)用漂白粉液清洗。返回節(jié)目錄61故障信息引起故障的原因解決方法清洗液高度錯(cuò)誤清洗液少了加清洗液清洗液高度警示清洗液傳感器失靈與公司聯(lián)系數(shù)據(jù)處理速率錯(cuò)誤數(shù)據(jù)太大，難以處理稀釋樣品文件名錯(cuò)誤輸入的文件名與系統(tǒng)沖突輸入另一個(gè)文件名（二）常見故障及排除62故障信息引起故障的原因解決方法存取數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤流式細(xì)胞儀不能存取數(shù)據(jù)關(guān)開計(jì)算機(jī)重試程序錯(cuò)誤軟件不能執(zhí)行該程序選擇主菜單上的重建項(xiàng)程序號(hào)太大程序號(hào)不能大于32取消一些程序，再輸入相應(yīng)號(hào)碼沒有激光束激光器關(guān)閉檢查電源，開激光器63六、流式細(xì)胞儀的臨床應(yīng)用

FCM對(duì)自身免疫性疾病HLA抗原的分析流式細(xì)胞儀在血液學(xué)中的應(yīng)用流式細(xì)胞儀在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用流式細(xì)胞儀在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用流式細(xì)胞儀在AIDS病檢測(cè)中的分析流式細(xì)胞儀在藥物學(xué)方面的應(yīng)用流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用返回節(jié)目錄64流式細(xì)胞分析的基本步驟65流式細(xì)胞術(shù)廣泛地應(yīng)用于免疫理論研究及其臨床實(shí)踐，所以有人稱之為現(xiàn)代免疫技術(shù)基石之一。尤其同單克隆抗體的結(jié)合應(yīng)用，在淋巴細(xì)胞及其亞群分析、淋巴細(xì)胞功能分析、免疫分型、分選、腫瘤細(xì)胞的免疫檢測(cè)、研究細(xì)胞周期等方面都起著相當(dāng)重要的作用。（一）流式細(xì)胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用66血液病多為腫瘤性、免疫性和遺傳性疾病，惡性血液病約占其總數(shù)一半以上。FCM在血液細(xì)胞的分類、分型，造血細(xì)胞分化的研究，血細(xì)胞中各種酶的定量分析，如過氧化物酶、非特異性酯酶等方面應(yīng)用廣泛。（二）流式細(xì)胞儀在血液學(xué)中的應(yīng)用67細(xì)胞生物學(xué)研究中，應(yīng)用最頻繁也最普通的是細(xì)胞周期分析，研究細(xì)胞周期或DNA倍體與細(xì)胞表面受體及抗原表達(dá)的關(guān)系，包括細(xì)胞周期各時(shí)相的百分比和細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定等內(nèi)容。對(duì)同一細(xì)胞的參數(shù)測(cè)定技術(shù)則導(dǎo)致了對(duì)細(xì)胞周期的一些新發(fā)現(xiàn)，典型的方法是吖啶橙雙染色技術(shù)。

（三）流式細(xì)胞儀在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用68近年來熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及熒光探針標(biāo)記的單克隆抗體，為流式細(xì)胞技術(shù)研究各種腫瘤抗原、腫瘤蛋白、致癌基因開辟了新途徑，極大地提高了腫瘤學(xué)的研究水平，并為流式細(xì)胞技術(shù)在腫瘤學(xué)的研究中開辟了更廣闊的應(yīng)用前景。（四）流式細(xì)胞儀在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用69流式細(xì)胞術(shù)用于AIDS免疫功能的檢測(cè)是最重要的檢測(cè)手段，采用三參數(shù)熒光標(biāo)記計(jì)數(shù)可對(duì)T淋巴細(xì)胞及亞群進(jìn)行分析，并通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)T細(xì)胞亞群可以對(duì)HIV感染者或AIDS發(fā)病者進(jìn)行區(qū)別。

（五）流式細(xì)胞儀在AIDS病檢測(cè)中的分析70利用FCM可以進(jìn)行HLA-B27／HLA-B7雙標(biāo)記抗體檢測(cè)HLA-B27陽性細(xì)胞，同時(shí)又可排出交叉反應(yīng)。通常58％～97％的強(qiáng)直性脊柱炎患者可檢出這種抗原，而正常人僅2％～7％可檢出這種抗原。FCM檢測(cè)HLA-B27快速、特異、敏感，為強(qiáng)制性脊柱炎的臨床診斷提供了有力的幫助。（六）FCM對(duì)自身免疫性疾病HLA抗原的分析71HLA-B27HLA-B27陰性樣本HLA-B27陽性樣本72流式細(xì)胞儀在檢測(cè)藥物在細(xì)胞中的分布，研究藥物的作用機(jī)制方面應(yīng)用廣泛。亦可用于篩選新藥，如化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制，可通過測(cè)DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白等進(jìn)行觀察。（七）流式細(xì)胞儀在藥物學(xué)方面的應(yīng)用第二節(jié)PCR基因擴(kuò)增儀74PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理243133第二節(jié)PCR基因擴(kuò)增儀5PCR基因擴(kuò)增儀的臨床應(yīng)用31PCR基因擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)PCR基因擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)PCR基因擴(kuò)增儀的操作規(guī)程與常見故障返回章目錄75一、PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理

（一）PCR技術(shù)的發(fā)展及原理1971年，Kleppe等人首次在文章中準(zhǔn)確、客觀地闡述了PCR方法。1985年，美國PE-Cetus公司的KaryMullis等人發(fā)明PCR技術(shù)。返回節(jié)目錄76PCR技術(shù)的本質(zhì)是體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在TaqDNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)“變性→退火→引物延伸”過程至25～40個(gè)循環(huán)，呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)大待測(cè)樣本中的核酸拷貝數(shù)。77PCR的基本原理

78PCR儀溫度控制水浴鍋控溫壓縮機(jī)控溫

半導(dǎo)體控溫

離心式空氣加熱控溫

（二）PCR基因擴(kuò)增儀的工作原理79二、PCR擴(kuò)增儀的分類與結(jié)構(gòu)PCR擴(kuò)增儀的種類

普通PCR擴(kuò)增儀

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀

梯度PCR儀

原位PCR儀

返回節(jié)目錄80熒光實(shí)時(shí)定量PCR（real-timequantitativePCR,RQ-PCR）技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號(hào)的變化真實(shí)地反映了體系中模板的增加，通過檢測(cè)熒光信號(hào)，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。81實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

金屬板式實(shí)時(shí)定量PCR儀

離心式實(shí)時(shí)定量PCR儀

各孔獨(dú)立控溫的定量PCR儀82金屬板式實(shí)時(shí)定量PCR儀可作為普通PCR儀使用可帶梯度功能可容納的樣本量大，無需特殊耗材溫度均一性欠佳，有邊緣效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件難以做到與樣品完全一致

83ABI7500熒光定量PCR儀

MJ公司Chromo4熒光定量PCR儀

Bio-rad公司iCycler熒光定量PCR儀84離心式實(shí)時(shí)定量PCR儀溫度均一性較好使用的是同一個(gè)激發(fā)光源和檢測(cè)器，隨時(shí)檢測(cè)旋轉(zhuǎn)到跟前的樣品，有效減少系統(tǒng)誤差可容納樣品量少，有的需用特殊毛細(xì)管作樣品管，增加了使用成本，也不帶梯度功能

85Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀

LightCycleTM熒光定量PCR儀

86LightCycleTM熒光定量PCR儀結(jié)構(gòu)示意圖

87各孔獨(dú)立控溫的定量PCR儀不同樣品槽分別擁有獨(dú)立的智能升降溫模塊，各孔獨(dú)立控溫，適合多指標(biāo)快速檢測(cè)。SmartCyclerⅡ的軟件允許一臺(tái)儀器同時(shí)操作六個(gè)樣品模塊，既滿足高速批量要求，又能靈活運(yùn)用，還可實(shí)現(xiàn)任意梯度反應(yīng)。SmartCyclerⅡ上樣不如傳統(tǒng)方法方便，而且需要獨(dú)特的扁平反應(yīng)管，使用成本較高。88SmartCyclerⅡ熒光定量PCR儀89三、PCR擴(kuò)增儀的性能指標(biāo)（一）溫度控制

溫度的準(zhǔn)確性

溫度的均一性

升降溫的速度不同模式下的相同溫度特性

返回節(jié)目錄90（二）熒光檢測(cè)系統(tǒng)

激發(fā)光源

檢測(cè)器

發(fā)光二極管

鹵鎢燈光源

超低溫CCD

光電倍增管

91（三）軟件簡(jiǎn)便的人性化設(shè)計(jì)最能滿足其需求。新型的PCR儀很注重程序編寫的簡(jiǎn)易性，易學(xué)易用，還具有實(shí)時(shí)信息顯示、記憶存儲(chǔ)多個(gè)程序、自動(dòng)倒記時(shí)、自動(dòng)斷電保護(hù)等功能，很多還可以免費(fèi)升級(jí)。92（四）其他多樣化樣品基座設(shè)計(jì)、熱蓋等都使PCR儀越來越人性化。93四、PCR擴(kuò)增儀的操作規(guī)程與常見故障

（一）PCR擴(kuò)增儀的操作規(guī)程普通PCR擴(kuò)增儀的操作非常簡(jiǎn)便，接通電源，儀器自檢，設(shè)置溫度程序或調(diào)出儲(chǔ)存的程序運(yùn)行即可。定量PCR擴(kuò)增儀的操作和普通PCR儀基本相同。

返回節(jié)目錄94①熒光染料污染樣品孔；②PCR管融化，原因可能是溫度傳感器出問題或是熱蓋出問題；③個(gè)別孔擴(kuò)增效率差異很大，可能的原因是半導(dǎo)體模塊出現(xiàn)壞點(diǎn)；④熒光強(qiáng)度減弱或不穩(wěn)定，產(chǎn)生的原因有濾光片發(fā)霉或有水汽，或光源損耗（以鹵鎢燈為光源的），需更換光源；或需調(diào)節(jié)檢測(cè)元件靈敏度；⑤儀器工作時(shí)出現(xiàn)噪音。以上故障部分可自行檢查，部分需工程師檢修。

（二）PCR擴(kuò)增儀的常見故障及排除95五、PCR擴(kuò)增儀的應(yīng)用

（一）感染性疾病的分子診斷和研究（二）遺傳性疾病的分子診斷和研究（三）惡性腫瘤的分子診斷和研究（四）PCR擴(kuò)增儀在移植配型上的應(yīng)用（五)PCR擴(kuò)增儀在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

(六)PCR擴(kuò)增儀在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

返回節(jié)目錄96思考題

1．簡(jiǎn)述流式細(xì)胞儀生物學(xué)顆粒分析原理。2.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)由哪幾部分組成？

3.PCR基因擴(kuò)增儀的工作關(guān)鍵是什么？按照變溫方式的不同可分哪幾類？返回節(jié)目錄97以不同溫度的水浴鍋串聯(lián)成一個(gè)控溫體系。樣品與水直接無縫接觸，控溫準(zhǔn)確，溫度均一性好，無邊緣效應(yīng)。體積大