第10章 酶的作用機制和酶的調節(jié)

第10章酶的作用機制和

酶的調節(jié)TheMechanismandRegulationofEnzymeCatalysis內容提要EnzymeactivesiteUniquecharactersofenzymecatalysisFactorseffectingenzymecatalysisRegulationofEnzymesIsozyme10.1酶的活性部位Enzymeactivesite10.1.1酶活性部位的特點酶分子中直接和底物結合，并和酶催化作用直接有關的部位稱為酶的活性部位(activesite)或活性中心(activecenter)Thecatalyticactivityofenzymesdependsontheintegrityoftheirnativeproteinconformation.Theprimary,secondary,tertiary,andquaternarystructuresofproteinenzymesareessentialtotheircatalyticactivity.NativestateDenaturedstateunfoldingrefolding一般是特異的氨基酸殘基比較集中的區(qū)域，即與酶活力直接相關的區(qū)域。活性部位又分為：1）結合部位（Bindingsite）

----負責與底物的結合，決定酶的專一性。2）催化部位(Catalyticsite)----負責催化底物鍵的斷裂形成新鍵，決定酶的催化能力。酶的活性部位ActivesiteBindingsiteCatalyticsiteBindingsiteTheenzymeDihydrofolateReductasewithitstwosubstratesNADP+

(red)andtetrahydrofolate(yellow)Gly216Gly226Gly216Ser189Gly226Val216Thr226Ser189BindingsiteThebindingsitedeterminesthesubstratespecificityoftheenzymeElastase

彈性蛋白酶Asp102His57ThecatalyticsiteofChymotrypsin（His57,Asp102,Ser195）CatalyticsiteTheActiveSitesofEnzymesHaveSomeCommonFeatures1.Theactivesitetakesuparelativelysmallpartofthetotalvolumeofanenzyme.

2.Theactivesitehasthree-dimensionalstructurewhichisformedbygroupsthatcomefromdifferentpartsoftheaminoacidsequence.folding3.Activesitesareclefts開裂orcrevices裂縫.

4.Substratesareboundtoenzymesbymultipleweakattractions.5.Thespecificityofbindingdependsonthepreciselydefinedarrangementofatomsinanactivesite.酶的活性部位的共同點：1）活性部位通常只占整個酶分子體積的1%--2%。酶分子的催化部位一般只有2—3個氨基酸殘基組成。2）酶的活性部位是一個三維實體。3）酶的活性部位并不是和底物的形狀正好互補的，而是在酶和底物結合的過程中，底物分子或酶分子，有時是兩者的構象同時發(fā)生了一定的變化后才互補的。酶的活性部位4）酶的活性部位是位于酶分子表面的一個裂縫(crevice)內,是相當疏水的區(qū)域,在裂縫內底物有效濃度可達到很高。5）底物通過次級鍵較弱的力結合到酶上。6）活性部位具有柔性或可運動性。酶的活性部位酶活性部位的特點10.1.2研究酶活性部位的方法酶分子側鏈基團的化學修飾法選擇一種化合物，當其與被研究的酶作用時能專門與活性部位氨基酸殘基側鏈基團共價結合，然后將這個帶標記化合物的酶水解，肽鍵被打開，但標記化合物共價鍵不被打開，因此可以分離得到帶有標簽的肽段，即可分析出活性部位的氨基酸殘基。巰基、羥基、咪唑基、氨基、羧基和胍基化學修飾法有一定的缺陷：化學修飾有可能使活性部位之外的某個氨基酸殘基的側鏈改變，而影響酶分子的正常結構，因而導致酶活性的喪失。研究酶活性部位的方法A.非特異性共價修飾化學試劑已和活性部位基團結合的鑒別：一.酶活力的喪失程度和修飾劑濃度成一定的比例關系。二.底物或與活性部位結合的可逆抑制劑可保護共價修飾劑的抑制作用，此法不但可以肯定某種基團是必需基團，還可以確信此基團位于酶的活性部位。研究酶活性部位的方法B.特異性共價修飾某一化學試劑專一地修飾酶活性部位的某一氨基酸殘基，使酶失活。二異丙基氟磷酸(DFP)能專一性地與酶活性部位的絲氨酸殘基的羥基共價結合，使酶活力喪失。二異丙基磷?；?DIP—酶)研究酶活性部位的方法DFP一般不與蛋白質反應，也不與胰凝乳蛋白酶原和變性的胰凝乳蛋白酶反應，它也不和天然胰凝乳蛋白酶活性部位Ser195以外的27個Ser結合，可見活性部位Ser處于一個特殊的結構中，對DFP敏感。對含有DFP集團的片段進行分析，不僅知道該酶活性部位附近的氨基酸順序，也可得知DIP標記在該酶分子的Ser195殘基上。研究酶活性部位的方法C.親和標記(affinitylabeling)法

合成與底物結構相似的共價修飾劑。一.可以較專一地引入酶的活性部位，接近底物結合位點。二.具有活潑的化學基團可以與活性部位的某一基團結合形成穩(wěn)定的共價鍵。利用酶對底物的特殊親和力將酶加以修飾標記，故稱親和標記。試劑稱“活性部位指示試劑”。研究酶活性部位的方法胰凝乳蛋白酶對甲苯磺?！狶—苯丙氨酸乙酯(TPE)是底物對甲苯磺?！狶—苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK)是它的親和試劑可使組氨酸咪唑基烷化。鄒承魯研究酶必需基團的化學修飾和酶活性喪失的定量關系。圖p387中科院鄒承魯：科學家有責任說明真相科學道德敗給了廣告中國科學院資深院士、第三世界科學院院士，我國著名生物化學家鄒承魯11月23日凌晨5點在北京逝世，享年83歲?！澳弥嚬芎蜔康膽?zhàn)士”

鄒承魯1923年5月17日生于山東省青島市，祖籍江蘇無錫。1941年，他畢業(yè)于由天津遷到重慶的南開中學高中部；同年，考入設在昆明的由北京大學、清華大學、南開大學三校聯(lián)合組成的西南聯(lián)合大學，就讀于化學系。1946年，在招考英庚款公費出國留學生的考試中，他以第一名的優(yōu)異成績被錄取。赴英后，師從英國劍橋大學著名生物化學家D基林(Keilin)教授。1951年，鄒承魯獲英國劍橋大學生物化學博士學位。1951年回國后與王應睞及汪靜合作純化了琥珀酸脫氫酶，并發(fā)現(xiàn)其輔基為與蛋白部分共價結合的FAD。此外，他們對呼吸鏈及其他酶系也進行了一系列的工作，為我國酶學及呼吸鏈的研究奠定了良好基礎。1958年，他參加發(fā)起人工合成胰島素工作，并負責胰島素A和B鏈的拆合。這項工作的完成確定了胰島素全合成的路線，為胰島素的人工合成做出了重要貢獻。定點誘變法利用定點突變技術（sitedirectedmutagenesis）,改變編碼蛋白質基因中的DNA序列，研究酶活性部位的氨基酸。定點誘變法1987年，Craik將胰蛋白酶Asp102誘變?yōu)锳sn102。酶活性降低5000倍。羧肽酶A中Tyr248原認為催化所必須，Tyr248的密碼子（TAT）→Phe(TTT)，kcat不變，Km高6倍。10.2酶催化反應的獨特性質Uniquecharactersofenzymecatalysis1）酶反應可分成兩類：一類反應僅僅涉及到電子的轉移，反應速率或轉換數(shù)在108S-1數(shù)量級；另一類反應涉及到電子和質子兩者或其他基團的轉移，反應速率在103S-1數(shù)量級。2）酶的催化作用是由氨基酸側鏈上的功能基團和輔酶為媒介的。主要的是His、Ser、Cys、Lys、Glu和Asp。3）酶催化反應的最適pH范圍通常是狹小的。4）與底物相比較，酶分子很大，而活性部位通常只比底物大一點。酶催化反應的獨特性質10.3影響酶催化效率的有關因素Factorseffectingenzymecatalysis10.3.1酶和底物的鄰近效應與定向效應鄰近效應與定向效應鄰近效應有效濃度得以極大的升高，從而使反應速率大大增加如乙酸對硝基苯脂以咪唑催化水解的反應。底物有效濃度增加24倍，反應速率加快24倍。底物和酶的鄰近效應與定向效應咪唑催化對-硝基苯酚乙酸酯水解的反應：將咪唑和對-硝基苯酚乙酸酯結合到一個分子上后，反應速率增加24倍。底物和酶的鄰近效應與定向效應定向反應正確取位產(chǎn)生的效應鄰近效應與定向效應底物和酶的鄰近效應與定向效應例如，酯與羧基結合形成酐的反應相對速度和結構關系.10.3.2底物的形變和誘導契合敏感鍵“電子張力”底物底物分子發(fā)生形變影響酶催化效率的有關因素誘導契合學說（1958，DanielE.Koshland)：該學說認為酶表面并沒有一種與底物互補的固定形狀，而只是由于底物的誘導才形成了互補形狀。底物的形變和誘導契合Inmanyenzymes,theactivesiteshaveshapescomplementarytothoseoftheirsubstratesonlyafterthesubstratesarebound(theinducedfit).Weakinteractionsbetweensubstratesandenzymesmaygenerateconformationalchangesontheenzymefortheinducedfiteffect.Inducedfitmayservetobringspecificfunctionalgroupsontheenzymeintotheproperorientation定向

andposition(alignment調整為直線)tocatalysis(needtoovercometheentropy熵

increase).Theinducedconformationofenzymeactivesiteiscomplementarynottothesubstratesperse本身

buttothe

transitionstates.10.3.3酸堿催化acid-basecatalysis

酸堿催化是通過瞬時的向反應物提供質子或從反應物接受質子以穩(wěn)定過渡態(tài)，加速反應的一類催化機制。專一的酸堿催化或狹義的酸堿催化?；瘜W反應無催化劑催化劑（H+）蔗糖水解1339.8kJ/mol104.7kJ/molReactionNocatalystH+Hydrolysisofsucrose1339.8kJ/mol104.7kJ/molThechangesofactivationenergyintheabsenceandpresenceofcatalystGeneralacid-basecatalysis總酸堿催化或廣義的酸堿催化氨基、羧基、巰基、酚羥基及咪唑基酸堿催化Generalacid-basecatalysisHis是酶的酸堿催化作用中最活潑的氨基酸殘基。Generalacid-basecatalysisAcidcatalysisisaprocessinwhichpartialprotontransferfromcatalysttoreactantlowersthefreeenergyofareaction'stransitionstate.Areactionmayalsobestimulatedbybasecatalysisifitsrateisincreasedbypartialprotonabstractionbycatalyst.Somereactionsmaybesimultaneously同時地

subjecttobothprocesses:aconcerted協(xié)作的

acid-basecatalyzedreaction.Manybiochemicalreactionsinvolvetheformationofunstablechargedintermediatesthattendtobreakdownrapidlytotheirconstituentreactantspecies,thusimpeding阻礙

thereaction.?Chargedintermediatescanoftenbestabilizedbytransferringprotonstoorfromthesubstrateorintermediatetoformaspeciesthatbreaksdowntoproductsmorereadilythantoreactants.Generalacid-basecatalysisIntheactivesiteofanenzyme,anumberofaminoacidsidechainscansimilarlyactasprotondonorsandacceptors.Thesegroupscanbepreciselypositionedinanenzymeactivesitetoallowprotontransfers,providingrateenhancementsoftheorderof102to105.Generalacid-basecatalysis10.3.4共價催化Covalentcatalysis共價催化，親核催化，親電子催化不穩(wěn)定的共價中間復合物底物中典型的親電中心：磷?；?、?；吞腔F(xiàn)已知100多種酶在催化過程中形成共價中間物。底物與酶分子中親核基團分別形成酰基—絲氨酸、酰基—半胱氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸組胺酸和西佛堿。Covalentcatalysis磷酰基?；腔鵖omeenzymesacceleratereactionsbyformingtransientcovalent

intermediateswiththesubstrates--covalentcatalysis.CovalentcatalysisReactionmechanismsofcovalentcatalysisaresomewhatarbitrarilyclassifiedasoccurringwitheithernucleophiliccatalysisorelectrophiliccatalysis.Aminoacidsidechains(e.g.,Ser,Cys,His)andprostheticgroupscanfunctionasnucleophilesinformingcovalentintermediateswithsubstrates.Freeenzymeisalwaysregeneratedattheendofthereaction.Covalentcatalysis10.3.5金屬離子催化1/3的酶催化需要金屬離子：①金屬酶：含緊密結合的金屬離子②金屬-激活酶：含松散結合的金屬離子Manyenzymeshavemetalionsintheiractivesiteplayingimportantrolesincatalysis.Metalionscanbetightlyboundtotheenzymeortakenupfromthesolutionalongwiththesubstrate.Metalionscanparticipateincatalysisinseveralways.MetalioncatalysisMetalions(boundtotheenzymes)canhelporient使朝向thesubstrateforreactionorstabilizechargedreactiontransitionstates.Mg2+-ATPMetalioncatalysisMetalionscanmediateoxidation-reductionreactionsbyreversiblychangetheiroxidationstates(electrondonorandacceptor).10.3.6多元催化和協(xié)同效應多種作用配合在一起起作用：胰凝乳蛋白酶：Asp102/His57/Ser159:電荷中繼網(wǎng)（親核催化和堿催化）

Mostenzymesmayuseacombinationofseveralcatalyticstrategiestobringaboutarateenhancement.Chymotrypsinusesbothcovalentcatalysisandgeneralacid-basecatalysis.Onceasubstrateisboundtoanenzyme,properlypositionedcatalyticfunctionalgroupsaidinthecleavageandformationofbondsbyavarietyofmechanisms,includinggeneralacid-basecatalysis,covalentcatalysis,andmetalioncatalysis.Thesearedistinctfrommechanismsbasedonbindingenergy,becausetheygenerallyinvolvetransientcovalentinteraction(bond)withasubstrateorgrouptransfertoorfromasubstrate.Inmanycases,thesereactionsoccuronlyintheenzymeactivesite.10.3.7活性部位微環(huán)境的影響非極性環(huán)境中兩個帶電集團之間的靜電作用比在極性環(huán)境中高，疏水微環(huán)境有利于酶的作用。10.5酶活性的調節(jié)控制別構調節(jié)酶原的激活可逆的共價修飾Theenzymaticactivityofsomeenzymesarepreciselyandtightlyregulatedinlivingorganismstomeetphysiologicalrequirements.RegulationofEnzymesWaysforregulatingactivityofenzymesTochangethequantityanddistributionofenzymes.Tochangetheactivityofasingleenzyme.Tochangethestructureofenzymes.Todirectlyinfluencetheinteractionbetweenenzymesandsubstrates.WaysforregulatingactivityofenzymesbychangingtheirstructureAllostericregulationReversiblecovalentmodificationsActivationofzymogens酶原10.5.1別構調節(jié)allostericregulation酶分子的非催化部位與某些化合物可逆地非共價地結合后發(fā)生構像的改變，進而改變酶的活性狀態(tài)，稱為酶的別構調節(jié)別構酶（allostericenzyme）正效應物（postitiveeffector）別構激活劑負效應物（negativeeffector）別構抑制劑同促效應異促效應AllostericregulationAllostericenzymes(similartohemoglobin)areregulatedbyreversible,noncovalentbindingofmodulators(allostericmodulatorsorallostericeffectors)Theallostericmodulatorsareoftensmallmetabolitesorcofactors.Themodulatorsforallostericenzymesmaybeinhibitoryorstimulatory(negativeorpositiveeffector).

天冬氨酸轉氨甲酰酶Aspartatetranscarbamylase

(ATCase)AllostericregulationAllostericregulationFeedbackinhibitionATCase的結構c:催化肽鏈；r:調節(jié)肽鏈催化亞基調節(jié)亞基ATCase的構象改變

與底物結合后，ATCase兩個催化肽鏈

的三級與四級結構變化圖解

CTP

是酶的抑制劑ATP

是酶的激活劑異促效應（heterotropiceffect）：非底物分子的調節(jié)物對別構酶的調節(jié)作用。Allostericregulation別構酶的性質一般都是寡聚酶別構酶的動力學協(xié)同指數(shù)(cooperativityindex,CI)：鑒別不同的協(xié)同作用及協(xié)同的程度。又稱飽和比值Rs別構酶的性質位點被90%飽和時的底物濃度CI=Rs=———————————————位點被10%飽和時的底物濃度

=811/nn協(xié)同系數(shù)(Hill系數(shù))米氏類型的酶Rs=81正協(xié)同效應的酶Rs<81負協(xié)同效應的酶Rs>81別構酶的性質別構模型別構模型10.5.2Activationofzymogens消化系統(tǒng)蛋白酶原的激活胰凝乳蛋白酶原（紫）與胰凝乳蛋白酶（綠）的構象比較ProteolyticactivationofchymotrypsinogenActivationofzymogensActivationofzymogens凝血機制凝血機制：※被傷害的血管收縮以減少血液的流失※血小板粘聚形成栓塞堵住傷口※通過一連串酶原激活反應和凝血因子的作用使血液凝聚ActivationofzymogensManyenzymesareactivatedbyspecificproteolyticcleavage.Theseenzymesaresynthesizedasinactiveprecursorscalledzymogens.Theyareactivatedbycleavageofoneorseveralspecificpeptidebonds.Proteolyticactivation,incontrastwithallostericcontrolandreversiblecovalentmodification,canoccurjustonceinthelifeoftheenzymemolecule-irreversibleprocess.ActivationofzymogensThedigestiveenzymesthathydrolyzeproteinsaresynthesizedaszymogensinthestomachandpancreas.Bloodclottingismediatedbyacascadeofproteolyticactivation.Someproteinhormonesaresynthesizedasinactiveprecursors(e.g.,insulinisderivedfromproinsulinbyproteolyticremovalofapeptide).Specificproteolysisisacommonmeansofactivatingenzymesandotherproteinsinbiologicalsystems.10.5.3可逆的共價修飾Reversiblecovalentmodifications通過共價調節(jié)酶進行已知的修飾類型：☆磷酸化☆腺苷酰化☆尿苷?；預DP-核糖基化☆甲基化

Reversiblecovalentmodifications蛋白質的磷酸化糖原磷酸化酶（無活性）糖原磷酸化酶-P(有活性)底物被蛋白質磷酸化的氨基酸有Ser,Thr,TyrTheactivityofmanyenzymesareregulatedbyreversiblecovalentmodifications(thecovalentattachmentofanothermolecule).Modifyinggroupsincludephosphoryl,adenylyl,uridylyl,methyl,andadenosinediphosphate

ribosylgroups.Thesegroupsaregenerallylinkedtoandremovedfromtheregulatoryenzymebyseparateenzymes.ReversiblecovalentmodificationsPhosphorylationPhosphorylationPhosphorylation,themostcommonreversiblecovalentmodification,isahighlyeffectivemeansofswitchingtheactivityoftargetenzymes.TheadditionofaphosphorylgrouptoaSer,Thr,orTyrresidueintroducesabulky(大塊的),chargedgroupintoaregionthatwasonlymoderatelypolar.Theoxygenatomsofaphosphorylgroupcanhydrogen-bondwithone