無創(chuàng)產(chǎn)前檢測

無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測簡介

內(nèi)容提要sd_bao@常見染色體疾病概述染色體非整倍體病發(fā)病機(jī)理傳統(tǒng)產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)介紹無創(chuàng)產(chǎn)前項(xiàng)目、院內(nèi)流程四一二三一，染色體非整倍體概述（唐氏綜合征為例）sd_bao@7世紀(jì)考古學(xué)家挖掘出典型唐氏綜合征體征顱骨。素描畫中見到具有唐氏綜合征樣面容的兒童。JohnLangdonDown醫(yī)生第一次對唐氏綜合征的典型體征進(jìn)行完整的描述并發(fā)表。Down’ssyndrome.法國遺傳學(xué)家(JeromeLeJeune)發(fā)現(xiàn)唐氏綜合征是由人體的第21號染色體的三體變異造成的現(xiàn)象。16世紀(jì)1866年1959年21、18、13-三體綜合征是人類最常見的三種染色體疾病，患兒面容特殊，絕大多數(shù)為嚴(yán)重智力障礙及器官畸形，對家庭和社會造成巨大危害和負(fù)擔(dān)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對胎兒染色體疾病尚無有效治療方法，最好的方法是在孕期通過產(chǎn)前篩查及診斷，發(fā)現(xiàn)異常并及時采取相應(yīng)措施染色體非整倍體疾病臨床表現(xiàn)21－三體照片a.同源染色體不分離;b.姐妹染色單體不分離

二，染色體非整倍體病發(fā)病機(jī)理減數(shù)分裂中染色體不分離第一次減數(shù)分裂第二次減數(shù)分裂三，現(xiàn)有的產(chǎn)前篩查與診斷手段sd_bao@產(chǎn)前篩查母血清學(xué)篩查頸項(xiàng)透明膜厚度篩查產(chǎn)前診斷羊水穿刺絨毛取樣

臍靜脈穿刺7侵入性診斷方式風(fēng)險計(jì)算現(xiàn)有產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的缺陷性來源：Estimatedprenatalscreeningperformance1991-2006(2006dataareprovisional),EnglandandWales.sd_bao@產(chǎn)前篩查（S）100,000篩查結(jié)果陽性（SP）7,000篩查結(jié)果陰性（SN）93,000唐氏綜合征胎兒400真陽性（TSP）340假陰性（FSN）60非唐氏綜合征胎兒99,600假陽性（FSP）6,660真陰性（TSN）92,9401992-2006傳統(tǒng)診斷方法（穿刺）導(dǎo)致的正常胎兒流失5619最緊迫任務(wù)：新方法的探索：提高檢測的準(zhǔn)確性與檢出率、降低檢測過程中的假陽性率和假陰性率。sd_bao@

四，無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)產(chǎn)生前提一：孕婦外周血中存在胎兒DNA

胎兒DNA來源和特點(diǎn)來源：1胎兒細(xì)胞通過胎盤滲透到母血中，被母體免疫系統(tǒng)破壞，胎兒DNA殘留下來；2胎兒細(xì)胞凋亡；3胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的凋亡基本特點(diǎn)：1含量有一定的變化規(guī)律。妊娠第4周開始可檢出胎兒游離DNA，隨著孕周增加而增加，存在個體差異，平均濃度。2分娩后短時間內(nèi)消失，平均半衰期為16.3min(4-30min)，2h就無法檢出。再次妊娠不影響檢測結(jié)果。3DNA片段較小，平均166bp左右。常規(guī)技術(shù)很難檢測前提二：第二代高通量測序儀發(fā)明6億個DNA片段/次，全基因組測序只要10天/臺；90個DNA片段/次，全基因組測通要50年/臺。（2012年）無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測：母血漿DNA+高通量測序2023/1/11母體和胎兒ＤＮＡ的混合物13Uniquereads(單一序列讀取）:nomismatch,onelocation(Loetal,PNAS,2008)理論模型

母親Chr21：95×2=190母體外周血中Chr21=190+10=200以21-三體為例：100DNA單位/毫升血漿。其中，95個單位來源于母親，5個單位來源于胎兒通過大規(guī)模并行測序，獲得分布在每條染色體上的真實(shí)的核酸片段數(shù)量，經(jīng)過計(jì)數(shù)與比較：正常胎兒或者

21-三體胎兒

正常胎兒

Chr21：5×2=10

母親Chr21：95×2=190

21-三體胎兒

Chr21：5×3=15母體外周血中Chr21=190+15=205醫(yī)院華大基因無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測流程sd_bao@準(zhǔn)確性高于99%；早期診斷，12孕周即可檢測；減少妊娠晚期引產(chǎn)對孕婦造成的傷害；非侵入性，減輕孕婦心理負(fù)擔(dān)，無流產(chǎn)風(fēng)險以及產(chǎn)前診斷引起的并發(fā)癥；可以同時檢測其它染色體異常所需樣本量少，只需5毫升母體外周血。無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的優(yōu)勢：無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的優(yōu)勢：保險保障檢測結(jié)果為高風(fēng)險受檢者產(chǎn)前診斷所產(chǎn)生的費(fèi)用{含：羊膜腔穿刺術(shù)(或經(jīng)皮臍靜脈穿刺術(shù))和染色體核型分析和染色體熒光原位雜交（或FISH）}，保險公司給予報(bào)銷超過2500元。檢測結(jié)果為低風(fēng)險，若受檢者嬰兒出生后一年內(nèi)經(jīng)縣級以上檢測醫(yī)院?？漆t(yī)生明確診斷患有“21-三體綜合征”、“18-三體綜合征”、“13-三體綜合征”，保險公司支付受檢者保險二十萬元整

孕期各項(xiàng)檢測信息圖10-13.5周早孕期篩查(檢出率85%)中孕期篩查(檢出率81%)15-20周16-22周羊水穿刺（流產(chǎn)率0.5-1%）9-11周絨毛取樣（流產(chǎn)率1-5%）

24-28周臍帶血取樣（流產(chǎn)率1-3%）040周12-24周無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測（準(zhǔn)確率>99%）適應(yīng)人群和適應(yīng)癥經(jīng)B超確認(rèn)為單、活胎孕婦；可檢測胎兒-13三體、18三體和21三體；孕12周以上均可進(jìn)行檢測。禁忌人群、禁忌癥懷多胞胎的孕婦；孕婦本人為染色體非整倍體疾病患者；孕婦接受過異體輸血、移植手術(shù)、干細(xì)胞治療、接受過配偶或親屬淋巴細(xì)胞免疫治療等；無法精確檢測胎兒染色體嵌合型、易位型、微缺失、微重復(fù)、微缺失等結(jié)構(gòu)性異常；院內(nèi)流程檢測前確認(rèn)事項(xiàng)：1.單活胎（超聲確認(rèn)）2.孕后未接受過異體的血液制品；3.孕12周以后開始檢測產(chǎn)前診斷中心/產(chǎn)科就診,醫(yī)生解釋該項(xiàng)目孕婦簽署知情同意書/送檢單,領(lǐng)取保險卡孕婦交費(fèi)后返回產(chǎn)前診斷護(hù)士站抽血（附知情同意/送檢單）采血：EDTA抗凝管采集外周血5ml（輕微顛倒采血管4次）護(hù)士打印2張條形碼1張貼于采血管上，1張貼于申請單的右上角采血后護(hù)士立即交給標(biāo)本處理人員（附申請單）（產(chǎn)前診斷中心3樓標(biāo)本接收處（標(biāo)本4℃保存，不可室溫放置）；標(biāo)本處理人員8小時內(nèi)分離血漿，并填寫樣本信息單全血采集

抽取孕婦外周血5mL，采用EDTA抗凝；采血完畢后，輕微顛倒采血管4次，并及時將采血管放置于4℃冰箱中，在4小時內(nèi)進(jìn)行血漿分離工作?！咀⒁馐马?xiàng)】采血時孕婦無需空腹；采血管為5mLEDTA抗凝管；顛倒混勻時動作不能太劇烈，防止溶血。血漿分離（本步驟在華大基因完成）

1、將采血管4℃

1600g離心10min，上清（血漿）分裝到置于冰盒上且已編號的2.0ml的EP管中?！咀⒁馐马?xiàng)】1）嚴(yán)格核對樣本編號、確保編號唯一；2）開啟離心管時，不能碰到管內(nèi)蓋；3）吸取血漿過程中不要吸到中間層的白細(xì)胞；2、上述血漿4℃

16000g離心10min，冰盒上將上清轉(zhuǎn)入已編號的2.0mlEP管中，每個離心管轉(zhuǎn)入600ul血漿。同時在每個2.0ml離心管上標(biāo)記樣本編號、血漿體積、分離日期?！咀⒁馐马?xiàng)】1）嚴(yán)格核對樣本編號、確保樣本編號唯一；2）開啟離心管管蓋時，不能碰到離心管內(nèi)蓋；3）將分離好的血漿貼上對應(yīng)的條碼并用封口膜密封，密封結(jié)束后立即將血漿放入-20℃或-80℃冰箱中，避免反復(fù)凍融?！咀⒁馐马?xiàng)】全血須保證在8小時內(nèi)進(jìn)行血漿分離；分離后的血漿在-20℃冰箱中可保存3天，長期保存需存放于-80℃冰箱。樣本儲存與運(yùn)輸

1、全血樣本在冰袋(4℃)條件下運(yùn)輸，且在4小時內(nèi)送達(dá)樣本接收處，樣本接收后要立即完成血漿分離。2、血漿樣本在干冰（-20℃

）條件下運(yùn)輸，并確保樣本送達(dá)時有干冰剩余，到達(dá)后及時存放于-80℃冰箱中，禁止將樣本在室溫下放置。【注意事項(xiàng)】1）泡沫箱的規(guī)格：壁厚6cm、外徑長39cm、外徑寬32cm、外徑高35cm。2）干冰用量：10公斤/2-3天；15公斤/4-5天；根據(jù)運(yùn)送時間的長短，相應(yīng)增加干冰用量。樣本數(shù)T21T18T13XOXXYXXXXYY樣本總數(shù)26619272891513753核型分析347619163108643假陽性—1101000假陰性—0000000檢出率—100%100%100%100%100%100%100%假陽性率—0.03%0.03%0.00%0.02%0.00%0.00%0.00%陽性預(yù)測值—99.48%98.44%100%88.89%100%100%100%假陰性率-0%0%0%0%0%0%0%陰性預(yù)測值—100%100%100%100%100%100%100%數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（截至2012年3月）全球100多家合作醫(yī)院。完成核型驗(yàn)證3476例，產(chǎn)后隨訪驗(yàn)證5489例。病例分析：單純型/標(biāo)準(zhǔn)型標(biāo)準(zhǔn)型T21樣本編號：

PDP10003761孕婦年齡：31唐篩：1/510（低風(fēng)險）無創(chuàng)檢測：T21核型分析：47，XX，+21T13樣本編號：PDP100003321孕婦年齡：32

無創(chuàng)檢測：T13核型分析：47，XX，+13病例分析：單純型/標(biāo)準(zhǔn)型T18樣本編號：PDP100002190孕婦年齡：32

無創(chuàng)檢測：T18核型分析：47，XY，+18T9PDB11AJ00026，41歲，孕23w+4周

無創(chuàng)檢測：T9羊水核型：T9T16PDB11AJ00783，30歲，孕19周

無創(chuàng)檢測：16號染色體偏多羊水FISH：T16病例分析：其它染色非整倍體病例分析：T9嵌合體PDB11AG00106，39歲，孕20周無創(chuàng)檢測：兩次測序結(jié)果均顯示9號染色體偏多羊水核型：47,XX,+9[55]/46,XX[33]臍血核型：47,XX,+9[3]/46,XX,[225]晚期B超發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重畸形，已引產(chǎn)羊水臍血母親核型正常父親核型正常胎