辣椒疫霉菌防治中病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)的應(yīng)用,植物保護(hù)論文

辣椒疫霉菌防治中病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)的應(yīng)用,植物保護(hù)論文內(nèi)容摘要：由辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)引起的辣椒疫病是生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一。本研究利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virusinducedgenesilencing,VIGS)技術(shù),通過(guò)瞬時(shí)表示出疫霉菌基因沉默信號(hào),在本氏煙草(Nicotianabenthamiana)-疫霉菌互作系統(tǒng)中建立寄主誘導(dǎo)的基因沉默(host-inducedgenesilencing,HIGS)體系,為防治辣椒疫病提供新思路。首先,在TRV2-GFP和對(duì)照TRV2-GUS的本氏煙葉片上接種表示出GFP的致病疫霉菌菌株14-3-GFP,結(jié)果顯示TRV2-GFP植株中致病疫霉菌的GFP表示出顯著降低,表示清楚利用VIGS技術(shù)構(gòu)建的HIGS體系在本氏煙草疫霉菌體系中可行。除此之外,選取辣椒疫霉菌致病相關(guān)基因PcAvh1、Pchmp1和PcGK4,構(gòu)建到TRV2載體上,通過(guò)在本氏煙草中表示出結(jié)合接種辣椒疫霉菌,結(jié)果顯示,與對(duì)照相比植物生長(zhǎng)表型無(wú)明顯變化,表示出TRV2-PcGK4的植株對(duì)辣椒疫霉菌表現(xiàn)抗病,表示出TRV2-PcAvh1和TRV2-Pchmp1的植株對(duì)辣椒疫霉菌的抗感性沒(méi)有顯著影響,表示清楚PcGK4可能是辣椒疫霉菌致病必須的基因之一。以上結(jié)果表示清楚,利用HIGS技術(shù)沉默辣椒疫霉菌PcGK4基因可有效降低辣椒疫霉菌對(duì)寄主的侵染,HIGS技術(shù)可用于辣椒疫霉菌致病關(guān)鍵基因的挑選和鑒定。本文關(guān)鍵詞語(yǔ)：VIGS;HIGS;辣椒疫霉菌;抗病;Host-inducedGeneSilencingisEffectiveagainstPhytophthoracapsiciinNicotianabenthamianaGUOYaluLIUZhengYANTingDUYuSHANWeixingCollegeofHorticulture,NorthwestAFUniversityCollegeofAgronomy,NorthwestAFUniversityAbstract：Phytophthoracapsiciisoneofthemostnotoriousdiseasesinpepperproduction.Thisstudy,weusedVIGStechniquetotransientexpressgenesilencingsignalsofPhytophthoratoestablishtheNicotianabenthamiana-Phytophthorahostinducedgenesilencing(HIGS)systemtoprovidenewideasforcontrolling.Firstofall,weinoculatedGFPlabeledPhytophthorainfestansisolate14-3-GFPonTRV-GFPandTRV-GUSexpressedN.benthamianaleaves,andobservedaclearreductionofGFPfluorescentinmyceliumof14-3-GFPonTRV-GFPplantsthancontrol,whichindicatetheHIGSisapplicableinNicotianabenthamiana-Phytophthorasystem.Furthermore,weclonedtheP.capsicivirulencerelatedgenesPcAvh1,Pchmp1andPcGK4,andconstructedthemintoTRV2vector.AfterexpressingtheminN.benthamiana,weinoculatedP.capsiciandscreenedforplantresistance.Resultsshowedthat,TRV-PcAvh1,TRV-Pchmp1andTRV-PcGK4plantsshowednodifferenceinplantgrowthandmorphology.TRV-PcGK4plantsareresistanttoP.capsicicomperingtocontrol,showedbyreducedlesionarea.ThelesionareasandP.capsicibiomassofTRV-Pchmp1andTRV-PcAvh1plantswerecomparabletocontrol.PcGK4maybeoneofthenecessarygenesforP.capsicipathogenicity.Takentogether,ourresultsindicatePcGK4isagoodtargetforHIGSandHIGStechniquecanbeusedtoscreenandidentifykeypathogenicgenesofP.capsici.寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(host-inducedgenesilencing,HIGS),指將連有病原菌目的基因片段的反義發(fā)卡構(gòu)造轉(zhuǎn)入寄主植物中,引發(fā)寄主植物產(chǎn)生與病原菌中目的基因同源的特異雙鏈RNA(dsRNA),植物辨別dsRNA后通過(guò)核酸內(nèi)切酶將其切割成21～35個(gè)堿基的SiRNA,當(dāng)病原菌侵染寄主植物時(shí),這些siRNA被病原菌吸收,使病原菌中的特定序列產(chǎn)生雙鏈RNA(dsRNA),導(dǎo)致病原菌中的目的基因下調(diào)[1,2]。HIGS技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是靶向性高、通用性強(qiáng)和操作簡(jiǎn)便快速,既能夠鑒定病菌基因的功能,又能夠控制病菌擴(kuò)展,提高植物抗病性。HIGS技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在寄生植物、真菌、線蟲(chóng)、以及卵菌等病原系統(tǒng)中[3,4,5,6,7,8,9,10,11,12]。在卵菌的應(yīng)用中,利用HIGS技術(shù)將致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)效應(yīng)基因PiAvr3a沉默,馬鈴薯植株表現(xiàn)出一定程度的抗病現(xiàn)象[13]。Jahan等[14]選取在致病疫霉菌侵染經(jīng)過(guò)中起重要作用的PiGPB1、PiCESA2和PiPEC以及介入基礎(chǔ)細(xì)胞維持的PiGAPDH基因作為HIGS靶標(biāo),發(fā)現(xiàn)比照野生型的非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株,沉默PiGPB1降低了致病疫霉菌的生物定殖量,植物表現(xiàn)抗病表型,PiGPB1在轉(zhuǎn)錄水平表示出量下降,轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)出特異的siRNA,講明HIGS技術(shù)能否成功高度依靠目的基因的選擇。同樣,研究證明采用HIGS技術(shù)提高了萵苣對(duì)霜霉病菌卵菌盤(pán)梗霉(Bremialactucae)的抗性[12]。以上研究表示清楚,HIGS技術(shù)在植物-卵菌互作中能夠有效利用。以上卵菌HIGS研究均采用RNAi載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物,試驗(yàn)周期較長(zhǎng),工作量較大。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virusinducedgenesilencing,VIGS)技術(shù)可快速地在植物中實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)沉默,已用于真菌HIGS研究[15],有潛力用于提高HIGS研究效率。本研究通過(guò)采用VIGS技術(shù)在寄主植物中表示出疫霉菌基因片段,研究其用于提高HIGS效率鑒定疫霉菌致病關(guān)鍵基因的潛力。致病疫霉菌Pihmp1編碼吸器細(xì)胞膜特異蛋白,其沉默顯著減弱致病疫霉菌的致病性[16];G蛋白偶聯(lián)受體蛋白基因GK4與致病疫霉菌的孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)發(fā)育以及毒性功能相關(guān)[17];PcAvh1是辣椒疫霉菌的一個(gè)RXLR效應(yīng)蛋白基因,具有重要的毒性功能[18];SGT1介入植物防衛(wèi)信號(hào)和抗病途徑[19],其沉默導(dǎo)致植物表現(xiàn)更感病,植株生長(zhǎng)矮小,葉片皺縮卷曲;PDS(八氫番茄紅素脫氫酶)介入植物類胡蘿卜素的合成,其沉默導(dǎo)致葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象[20]。本試驗(yàn)以GUS、GFP、PDS和SGT1作為報(bào)告基因,研究基于VIGS基因瞬時(shí)沉默技術(shù)的HIGS技術(shù)用于本氏煙草-疫霉菌互作的潛力。1材料與方式方法1.1材料培養(yǎng)基LB、CA、RSA、抗生素卡那霉素、四環(huán)素、農(nóng)桿菌感受態(tài)C58C1、大腸桿菌感受態(tài)DH5、辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)菌株1112、致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)菌株14-3-GFP、病毒載體TRV1和TRV2均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室配制與保存。所用試劑主要有高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、rTaqDNA聚合酶、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等。所用儀器主要有Eppendorf4308電擊儀、PCR儀(BioRad)、熒光顯微鏡(Olympus)、旋轉(zhuǎn)搖床及生化培養(yǎng)箱等。1.2方法1.2.1載體構(gòu)建試驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1,克隆基因PcGK4(PITG_05519)、PcAvh1(EU282489.1)和Pchmp1(PITG_00375),酶切目的基因與TRV2載體片段,用T4連接酶進(jìn)行連接,產(chǎn)物通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,培養(yǎng)在選擇培養(yǎng)基上,采用菌落PCR方式方法檢測(cè)陽(yáng)性克隆,測(cè)序確認(rèn)載體構(gòu)建成功。1.2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及農(nóng)桿菌注射載體構(gòu)建成功后,電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58C1感受態(tài)。挑取陽(yáng)性單菌落培養(yǎng)在帶有抗性的液體LB培養(yǎng)基中至OD600為0.8～1.0,收集菌體,配制加有乙酰丁香酮(110-4mol/L)的MES重懸液,重懸菌體OD600為0.6,將TRV1和TRV2按體積比1∶1混合后室溫靜置1～3h,用注射器注射3周左右本氏煙草的第1片和第2片真葉,選擇TRV2-GUS,TRV2-SGT1作為對(duì)照,TRV2-PDS作為報(bào)告基因,每個(gè)試驗(yàn)組選取8棵植物,注射18d后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。表1引物序列1.2.3離體葉片接種致病疫霉菌及熒光觀察致病疫霉菌中參加5mL預(yù)冷的無(wú)菌蒸餾水,至菌絲完全浸潤(rùn),置于4℃,用2h觀察游動(dòng)孢子的釋放,并于顯微鏡下計(jì)數(shù)。取TRV2-GUS和TRV2-GFP葉片涮洗干凈,吸干多余水分用濕水脫脂棉包裹葉柄處,放于底部鋪有濕水濾紙的塑料托盤(pán)中,在葉子左右兩邊對(duì)稱位置各接種1000個(gè)致病疫霉菌的游動(dòng)孢子(15～20L),保鮮膜封閉后放置于16℃黑暗培養(yǎng)箱,3d后觀察發(fā)病情況。用刀片劃取小塊平整致病疫霉菌侵染的病斑區(qū)域置于載玻片上,用水浸潤(rùn)后用蓋玻片壓片,用奧林巴斯熒光顯微鏡(BX-51TRF,濾光器BP450-480)進(jìn)行初步觀察并進(jìn)行圖像采集。1.2.4離體葉片接種辣椒疫霉菌及病斑統(tǒng)計(jì)參考Fan等[21]的方式方法培養(yǎng)辣椒疫霉菌及誘孢,取TRV2-GUS、TRV2-Pchmp1、TRV2-PcGK4和TRV2-PcAvh1葉片,在葉片左右兩邊對(duì)稱位置各接種辣椒疫霉菌的游動(dòng)孢子1000個(gè)(10～12L),放于25℃黑暗保濕培養(yǎng),2d后觀察發(fā)病情況,并測(cè)量病斑直徑計(jì)算病斑面積和顯著性分析(*代表P0.05,**代表P0.01)。1.2.5半定量測(cè)定辣椒疫霉菌的定殖量接種辣椒疫霉菌2d后,用打孔器收取接種點(diǎn)周?chē)“呓M織,參考Fan等[21]用CTAB法提取組織DNA,本氏煙草、辣椒疫霉菌內(nèi)參基因NbActin、PcActin(表1)引物序列參照Fan等[21]和Zhang等[22]的研究。半定量RT-PCR方式方法程序設(shè)置為:95℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,50℃退火,延伸80s,28個(gè)循環(huán),PCR產(chǎn)物電泳跑膠后用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BIO-RAD)拍照。2結(jié)果與分析2.1基于VIGS的本氏煙草-疫霉菌HIGS體系的建立為確定VIGS載體能否能夠成功應(yīng)用于疫霉菌HIGS研究,在TRV2-GUS和TRV2-GFP的葉片上接種帶有GFP標(biāo)記的致病疫霉菌株,觀察致病疫霉菌菌絲中的GFP熒光。圖1顯示,比照對(duì)照TRV2-GUS和TRV2-GFP病斑區(qū)域的綠色熒光明顯減弱,講明TRV2-GFP成功沉默了致病疫霉菌菌絲中的GFP。表示清楚本研究利用VIGS技術(shù)在本氏煙草中可實(shí)現(xiàn)疫霉菌基因的沉默,為挑選和鑒定能夠抑制辣椒疫霉菌侵染的靶標(biāo)基因提供根據(jù)。圖1TRV2-GFP成功沉默了GFP標(biāo)記的致病疫霉菌株中的GFP在TRV2-GUS和TRV2-GFP葉片上接種致病疫霉菌14-3-GFP的游動(dòng)孢子GFPlabeledP.infestansisolate14-3-GFPzoosporeswereinoculatedwithTRV2-GUSandTRV2-GFP;3d后，使用奧林巴斯熒光顯微鏡〔BX-51TRF，過(guò)濾器BP450-480〕在白平衡處理4倍鏡下進(jìn)行觀察并拍照After3days,Olympusfluorescencemicroscope(BX-51TRF,filterBP450-480)wasusedandpicturesweretakenunder4timesocularwithwhitebalance2.2基于VIGS的候選基因同源siRNA的表示出對(duì)植株生長(zhǎng)表型的影響本研究將對(duì)照基因GUS、GFP、SGT1和辣椒疫霉菌基因Pchmp1、PcGK4和PcAvh1構(gòu)建到TRV2載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化在本氏煙草上進(jìn)行表示出,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化18d后觀察植物表型,結(jié)果顯示報(bào)告基因TRV2-PDS出現(xiàn)白化現(xiàn)象,TRV2-SGT1表現(xiàn)植株矮小,葉面卷曲,TRV2-Pchmp1、TRV2-PcGK4和TRV2-PcAvh1比照對(duì)照TRV2-GUS在植株大小、葉片顏色及形態(tài)方面沒(méi)有明顯變化(圖2)。圖2沉默候選基因18d后本氏煙草的生長(zhǎng)表型2.3表示出TRV2-PcGK4的植物接種辣椒疫霉菌后的表現(xiàn)對(duì)TRV2-Pchmp1、TRV2-PcGK4和TRV2-PcAvh1的離體葉片接種辣椒疫霉菌的游動(dòng)孢子,2d后觀察病斑,結(jié)果顯示,與對(duì)照TRV2-GUS相比,TRV2-PcGK4葉片上的病斑面積顯著減小(圖3-A,3-B),植物表現(xiàn)抗病表型,表示清楚PcGK4在辣椒疫霉菌侵染的經(jīng)過(guò)中起關(guān)鍵作用。TRV2-Pchmp1和TRV2-PcAvh1的病斑面積與對(duì)照TRV2-GUS無(wú)顯著差異,植物無(wú)明顯抗病表型(圖3)。2.4辣椒疫霉菌的定殖量在TRV2-PcGK4中的表現(xiàn)對(duì)辣椒疫霉菌侵染的TRV2-GUS、TRV2-PcGK4、TRV2-Pchmp1和TRV2-PcAvh1的葉片病斑進(jìn)行打孔收樣,用CTAB法提取基因組DNA,以本氏煙草和辣椒疫霉菌的內(nèi)參基因作為引物,通過(guò)半定量RT-PCR測(cè)定辣椒疫霉菌生物量。結(jié)果顯示,本氏煙草內(nèi)參基因條帶在對(duì)照TRV-GUS以及TRV2-PcGK4、TRV2-Pchmp1、TRV2-PcAvh1植物樣品中亮度一致,而辣椒疫霉菌內(nèi)參基因條帶在TRV2-PcGK4樣品中比對(duì)照TRV2-GUS亮度明顯減弱(圖4-A),表示清楚定殖在TRV2-PcGK4中的辣椒疫霉菌生物量顯著降低。TRV2-Pchmp1和TRV2-PcAvh1檢測(cè)出的辣椒疫霉菌內(nèi)參基因條帶與對(duì)照亮度無(wú)明顯差異,表示清楚定殖在上述樣品中的辣椒疫霉菌生物量沒(méi)有變化(圖4-B,4-C)。圖3TRV-PcGK4植物表現(xiàn)出對(duì)辣椒疫霉菌的抗性A、C、E為病斑面積統(tǒng)計(jì)情況A,CandErepresentstatisticalanalysisoflesionarea;B、D、F為接種辣椒疫霉菌2d后的葉片B,DandFrepresentleavesinoculatedwithP.capsiciafter2days。本氏煙草重復(fù)3次結(jié)果一致，每個(gè)柱形圖中用于分析的病斑面積來(lái)自于8片葉片，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，**表示P0.01Theexperimentswererepeatedthreetimeswithsimilarresults(nonesidedStudentsttest，**indicatingP0.01圖4病斑部位辣椒疫霉菌生物量檢測(cè)行辣椒疫霉菌的生物量檢測(cè)RNAsfromleavesat2daysafterP.capsici1112inoculationwasusedforP.capsicibiomassquantification;1和2使用辣椒疫霉菌內(nèi)參引物1and2usingtheP.capsiciinternalprimerforamplification;3和4使用本氏煙草內(nèi)參引物3and4usingN.benthamianainternalprimerforamplification;2和4以TRV2-GUScDNA為模板2and4UsingTRV2-GUSastemplate;1和3以TRV-PcGK4,TRV-Pchmp1,TRV-PcAvh1cDNA為模板1and3usingTRV-PcGK4orTRV-Pchmp1orTRV-PcAvh1astemplate；本氏煙草內(nèi)參基因條帶大小為600bp，辣椒疫霉菌內(nèi)參基因條帶大小為179bpThesizeofthebandfromN.benthamianainternalgeneis600bp,andfromP.capsiciinternalgeneis179bp；該試驗(yàn)結(jié)果在3次生物學(xué)重復(fù)中表現(xiàn)一致Theexperimentwasrepeatedthreetimeswithsimilarresult3討論VIGS是利用植物對(duì)RNA病毒防御機(jī)制發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù),當(dāng)前應(yīng)用于卵菌HIGS的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究將VIGS技術(shù)應(yīng)用于疫霉菌HIGS研究,通過(guò)在TRV2-GFP和對(duì)照TRV2-GUS的葉片上接種帶有GFP標(biāo)簽的致病疫霉菌,發(fā)現(xiàn)TRV2-GFP病斑區(qū)域的致病疫霉菌菌絲中的GFP顯著降低,證明VIGS技術(shù)在卵菌HIGS體系中可行。隨后成功挑選到在辣椒疫霉菌侵染經(jīng)過(guò)中起關(guān)鍵作用的候選基因PcGK4。在植物病原菌傳播和感染寄主的經(jīng)過(guò)中,病菌孢子構(gòu)成和發(fā)病機(jī)制由包括g蛋白和磷脂信號(hào)的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。卵菌GPCR-PIPKs(GKs)蛋白家族由7個(gè)跨膜構(gòu)造域(7-TM)和磷脂酰肌醇磷酸酯激酶(PIPK)構(gòu)造域組成,在這里基礎(chǔ)上GKs有可能連接g蛋白和磷脂信號(hào)通路。致病疫霉菌GK4是G蛋白偶聯(lián)受體,屬于GKS(GPCR-PIPKS)蛋白家族,GK4基因的沉默和過(guò)表示出不僅介入孢子萌發(fā)和菌絲延伸,而且介入孢子囊的裂解和早期侵染,在致病疫霉菌的侵染經(jīng)過(guò)中起重要作用[20]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)沉默辣椒疫霉菌PcGK4后能夠顯著降低辣椒疫霉菌的致病力,講明PcGK4在辣椒疫霉菌侵染經(jīng)過(guò)中起關(guān)鍵作用。并不是所有的目的基因沉默后都能夠抑制病原菌侵染[13],目的基因的選擇直接決定沉默效率的高低。本試驗(yàn)挑選到的PcGK4能顯著抑制辣椒疫霉菌的侵染,Pchmp1和PcAvh1處理的植物比照對(duì)照沒(méi)有明顯的抗病表型。分析原因,可能是在辣椒疫霉菌中存在Pchmp1功能冗余基因或者該基因沒(méi)有成功被沉默。PcAvh1已被報(bào)道是辣椒疫霉菌中的一個(gè)重要的RXLR毒性效應(yīng)分子,在辣椒上能夠引起嚴(yán)重的黃化褪綠現(xiàn)象[20],但在本試驗(yàn)中沒(méi)有表型,可能是由于該基因在侵染初期高量表示出,沒(méi)有被HIGS有效沉默。HIGS技術(shù)當(dāng)前已應(yīng)用于多個(gè)病原菌系統(tǒng)中,但在卵菌系統(tǒng)中存在爭(zhēng)議,在Zhang等[22]的報(bào)道中,利用HIGS技術(shù)以寄生疫霉菌的PnPMA1基因(內(nèi)源質(zhì)膜氫離子通道蛋白)和報(bào)告基因GFP為研究對(duì)象進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化dsGFP的擬南芥未干擾寄生疫霉菌中的GFP熒光信號(hào),寄生疫霉菌的靶標(biāo)基因PnPMA1轉(zhuǎn)錄水平未遭到影響,同樣從病原組織分離的疫霉菌中未檢測(cè)到同源靶基因siRNA分子的存在。在之后Sanju等[13]的報(bào)道中,以馬鈴薯為寄主植物,對(duì)致病疫霉菌Avr3a基因運(yùn)用HIGS技術(shù)進(jìn)行沉默,比照非轉(zhuǎn)基因植株,轉(zhuǎn)基因植株Avr3a基因的表示出量下降,致病疫霉菌的生物定殖量降低,轉(zhuǎn)基因植物特異地表示出siRNA,證明HIGS技術(shù)在馬鈴薯-致病疫霉菌系統(tǒng)中能夠有效應(yīng)用。Jahan等[14]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化dsGFP的馬鈴薯成功沉默了致病疫霉菌菌絲中的GFP基因。與Jahan等[14]研究結(jié)果類似,本研究利用TRV載體在本氏煙草中也沉默了致病疫霉菌菌絲中的GFP信號(hào)。比照Z(yǔ)hang等[22]在擬南芥中的研究,筆者以為可能是寄主植物的差異導(dǎo)致HIGS技術(shù)在卵菌中的應(yīng)用上產(chǎn)生了差異。HIGS技術(shù)應(yīng)用在辣椒疫霉菌研究中的報(bào)道比擬少見(jiàn),Vega-Arregun等[23]利用HIGS技術(shù)對(duì)一個(gè)被煙草(N.tabacum)辨別的效應(yīng)蛋白PcAvr3a1進(jìn)行沉默,結(jié)果促進(jìn)了辣椒疫霉菌在非寄主煙草(N.tabacum)上的定殖,表示清楚HIGS技術(shù)在辣椒疫霉菌體系中應(yīng)用可行,但并沒(méi)有牽涉抑制辣椒疫霉侵染的相關(guān)基因,本試驗(yàn)初次利用HIGS技術(shù)挑選到抑制辣椒疫霉菌侵染的基因PcGK4,對(duì)辣椒疫病的防控有指導(dǎo)意義?，F(xiàn)前階段,HIGS技術(shù)非常關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題是怎樣證明植物產(chǎn)生的siRNA成功進(jìn)入病原菌細(xì)胞并且誘導(dǎo)了靶標(biāo)基因的沉默,siRNA是通過(guò)何種途徑向疫霉菌進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和累積的,在這些方面未有成熟的機(jī)制闡述。本試驗(yàn)中固然挑選到沉默PcGK4在植物中具有抗病表型,但沒(méi)有檢測(cè)候選基因能否成功進(jìn)行沉默,之后能夠通過(guò)定量PCR,Northernblot和RNA測(cè)序的方式方法檢測(cè)疫霉菌中目的基因的沉默,并且能夠在辣椒疫霉菌真正的寄主植物辣椒上驗(yàn)證之前的結(jié)果,解析PcGK4介入辣椒疫霉菌侵染的機(jī)理。以下為參考文獻(xiàn)[1]ESQUELA-KERSCHERA,SLACKFJ.Oncomirs-microRNAswitharoleincancer[J].NatureReviewsCancer,2006,6(4):259-269.[2]NUNESCC,DEANRA.Host-inducedgenesilencing:atoolforunderstandingfungalhostinteractionandfordevelopingnoveldiseasecontrolstrategies[J].MolecularPlantPathology,2020,13(5):519-529.[3]WESTWOODJH,RONEYJK,KHATIBIPA,etal.RNAtranslocationbetweenparasiticplantsandtheirhosts[J].PestManagementScience,2018,65(5):7.[4]LILLEYCJ,BAKHETIAM,CHARLTONWL,etal.RecentprogressinthedevelopmentofRNAinterferenceforplantparasiticnematodes[J].MolecularPlantPathology,2007,8(5):701-711.[5]ZHANGT,JINY,ZHAOJH,etal.Host-inducedgenesilencingofthetargetgeneinfungalcellsconferseffectiveresistancetothecottonwiltdiseasepathogenVerticilliumdahliae[J].MolecularPlant,2021,9(6):939-942.[6]CHENGW,SONGXSH,LIHP,etal.Host-inducedgenesilencingofanessentialchitinsynthasegeneconfersdurableresistancetoFusariumheadblightandseedlingblightinwheat[J].PlantBiotechnologyJournal,2021,13(9):1335-1345.[7]KOCHA,KUMARN,WEBERL,etal.Host-inducedgenesilencingofcytochromeP450lanosterolC14-demethylase-encodinggenesconfersstrongresistancetoFusariumspecies[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2020,110(48):19324-19329.[8]NOWARAD,GAYA,LACOMMEC,etal.HIGS:host-inducedgenesilencingintheobligatebiotrophicfungalpathogenBlumeriagraminis[J].ThePlantCell,2018,22(9):3130-3141.[9]PLIEGOC,NOWARAD,BONCIANIG,etal.Host-inducedgenesilencinginbarleypowderymildewrevealsaclassofribonuclease-likeeffectors[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2020,26(6):633-642.[10]DALLASTTARC,DIASB?RBARABA,MariaT,etal.Invivotrans-specificgenesilencinginfungalcellsbyinplantaexpressionofadouble-strandedRNA[J].BMCBiology,2018,8(1):27.[11]ANDRADECM,TINOCOMLP,RIETHAF,etal.Host-inducedgenesilencinginthenecrotrophicfungalpathogenSclerotiniasclerotiorum[J].PlantPathology2021,65(4):626-632.[12]GOVINDARAJULUM,EPSTEINL,WROBLEWSKIT,etal.Host-inducedgenesilencinginhibitsthebiotrophicpathogencausingdownymildewoflettuce[J].PlantBiotechnologyJournal,2021,13(7):875-883.[13]SANJUS,SIDDAPPAS,THAKURA,etal.Host-mediatedgenesilencingofasingleeffectorgenefromthepotatopathogenPhytophthorainfestansimpartspartialresistancetolateblightdisease[J].FunctionalIntegrativeGenomics,2021,15(6):697-706.[14]JAHANSN,ASMANAKM,CORCORANP,etal.Plant-mediatedgenesilencingrestrictsgrowthofthepotatolateblightpathogenPhytophthorainfestans[J].JournalofExperimentalBotany,2021,66(9):2785-2794.[15]趙玉蘭,蘇曉峰,程紅梅.利用寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)驗(yàn)證大麗輪枝菌糖代謝相關(guān)基因的致病力[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2021,48(7):1321-1329.ZHAOYL,SUXF,CHENGHM.Verificationofverticilliumdahliaepathogenicityofglycometabolismrelatedgenesbyusinghost-inducedgenesilencingmethod[J].ScientiaAgriculturaSinica,2021,48(7):1321-1329.[16]AVROVAA,BOEVINKP,YOUNGV,etal.AnovelPhytophthorainfestanshaustorium-specificmembraneproteinisrequiredforinfectionofpotato[J].CellularMicrobiology,2018,10(11):2271-2284.[