含抗凋亡基因bcl 2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體的構(gòu)建及鑒定

含抗凋亡基因bcl-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體的構(gòu)建及鑒定【摘要】目的：構(gòu)建并鑒定含鼠bl-2基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。方法：將抗凋亡基因bl-2片段從載體pDNA3.1中切下，定向插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLNX2中，酶切鑒定；脂質(zhì)體法將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)入包裝細胞系PT67，G418挑選建立穩(wěn)定表達bl-2的細胞株。結(jié)果：雙酶切鑒定,成功構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體;重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)入包裝細胞PT67,經(jīng)G418挑選,形成了抗性克隆,并測得病毒滴度為3×1011fu/L,提示構(gòu)建的含鼠bl-2基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及穩(wěn)定的包裝細胞系成功。結(jié)論：含抗凋亡基因bl-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建成功?！娟P(guān)鍵詞】逆轉(zhuǎn)錄病毒載體重組bl-2基因0引言隨著一些常見致盲眼病已有較好的防治措施，難治性或不可治性眼病已成為眼科研究的熱點和焦點。難治性眼病主要是指一些累及視網(wǎng)膜的變性性疾病，如遺傳性視網(wǎng)膜變性、老年性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素上皮細胞〔RPE〕和錐桿〔光感受器〕細胞的漸進性變性死亡，迄今尚無防止這些細胞變性死亡的有效方法。我們構(gòu)建抗凋亡基因bl-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，將其導(dǎo)入培養(yǎng)的正常的SD大鼠RPE細胞，然后將其顯微注射入視網(wǎng)膜色素變性鼠的視網(wǎng)膜下腔，對視網(wǎng)膜變性性疾病基因治療進展探究性研究，為構(gòu)建并鑒定bl-2基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的工作報道如下。1材料和方法1.1材料PLNX2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝細胞系PT67為第二軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室潘衛(wèi)提供，含鼠bl-2基因的pDNA3.1〔酶切位點〔KPnⅠ+XbaⅠ〕〕由中國科學(xué)院細胞生化所劉新垣教授惠贈，質(zhì)粒提取試劑盒和DNA純化回收試劑盒均購于上海博彩生物科技；TP10F’和DH5α大腸桿菌菌株由微生物教研室提供，以al2方法制成感受態(tài)細胞；各種限制性內(nèi)切酶及pD18T載體購于TaKaRa寶生工程〔大連〕；NIH3T3細胞、脂質(zhì)體及G418均購自lnteh公司；瓊脂糖及各種生化制劑購于上海華舜生物工程公司產(chǎn)品。1.2方法①pDNA3.1〔bl-2〕的擴增：將小鼠pDNA3.1〔bl-2〕質(zhì)粒用aL2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌TP10F′菌株中，LB培養(yǎng)基擴增，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，并用izard質(zhì)粒提取試劑盒加以純化質(zhì)粒DNA。②設(shè)計和合成引物〔帶有HindⅢ和StuⅠ兩酶酶切位點〕，上游5′-ATAAAGTTATGGGAAGGGGAGA-3′〔含HindⅢ酶切位點〕，下游5′-TATAGGTTATTGTGGAGGTA-3′〔含StuⅠ酶切位點〕，由上海生工生物工程公司合成。〔3〕PR擴增：50μL體系中，模板DNA1μL，dNTP1μL〔200μl/L〕，引物上游5′-ATAAAGTTATGGGAAGGGGAGA-3′〔含HindⅢ酶切位點〕，下游5′-TATAGGTTATTGTGGAGGTA-3′各1μL〔25pl〕，TaqBuffer5μL，Taq酶1μL，在PR儀(2400型，美國PE公司)擴增，94℃5in后94℃30s，55℃30s，72℃50s，35循環(huán)，72℃7in，4℃10in。擴增PR產(chǎn)物序列分析擴增得到的DNA電泳，低融點膠回收純化。按Prega操作手冊連接插入pGE-T載體后轉(zhuǎn)化到感受器DH5α大腸桿菌中，挑選出含有bl-2目的基因質(zhì)粒的菌落，提取酶切鑒定后，命名為pGE-bl-2。將所選出含有目的基因質(zhì)粒的大腸桿菌送上?；倒具M展測序。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和StuⅠ酶解質(zhì)粒pGE-bl-2，電泳、低融點膠回收小鼠bl-2DNA片段〔0.7kb〕，溶解于TE中，-20℃保存。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PLNX2，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和StuⅠ酶切后去磷酸化，pGE-bl-2經(jīng)同樣酶切后別離出0.7bpbl-2全部編碼區(qū)片段，在T4DNA連接酶的作用下與載體連接、轉(zhuǎn)化，以及用快篩法挑選出基因重組子PLNX2－bl-2。轉(zhuǎn)染包裝細胞系PT67復(fù)蘇包裝細胞系PT67，在完全培養(yǎng)基〔含小牛血清〕培養(yǎng)中，在轉(zhuǎn)染前12～24h，將PT67細胞系接種于60的培養(yǎng)皿中，當(dāng)細胞生長至60％～80％交融時，參加預(yù)先準(zhǔn)備好的轉(zhuǎn)染混合液于37℃，2孵育箱中培養(yǎng)24h，其中包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒100μL和空載體100μL〔均為質(zhì)粒5μg，脂質(zhì)體30μg，用無血清培養(yǎng)液稀釋而成〕；次日更換新穎的完全培養(yǎng)基，于轉(zhuǎn)染72h后，吸出培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞2次后重新參加5L完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，以進步病毒滴度。將轉(zhuǎn)染后的包裝細胞按照1∶20的比例傳代于含G418〔300〕的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)3d，更換為G418〔400g/L〕培養(yǎng)基維持挑選，繼續(xù)培養(yǎng)2k，待長出抗性克隆后分選大而安康的克隆并轉(zhuǎn)移至另外的培養(yǎng)板各孔中，參加不含抗生素的培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)；病毒作相應(yīng)稀釋后感染NIH3T3細胞，測定病毒滴度。2結(jié)果測序與Genebank一致，證明PR成功擴增帶有HindⅢ和StuⅠ兩酶酶切位點的目的基因〔圖1，2〕。PLNX2－bl-2重組的表達載體的酶切鑒定見圖3。當(dāng)包裝細胞生長至60％～80％交融時，參加轉(zhuǎn)染混合液，約數(shù)分鐘后可發(fā)現(xiàn)許多微小的白色顆粒附著在細胞外表，約4～6h后白色顆粒逐漸進入細胞內(nèi)部。當(dāng)細胞培養(yǎng)在含G418的選擇培養(yǎng)基時，可見細胞大量死亡，隨著時間的推移，活著的細胞即為成功轉(zhuǎn)染的細胞，漸有克隆形成。擴增后測定的最大病毒滴度為3×1011fu/L。3討論細胞凋亡是能量依賴的細胞內(nèi)死亡程序活化而致的細胞自殺〔suiide〕。因此凋亡由基因控制，故又有人稱這種細胞死亡為編程性〔程序性〕細胞死亡〔prgraedelldeath，PD〕?，F(xiàn)有資料說明，無論在生理還是在病理狀態(tài)下的PD，bl-2基因都是關(guān)鍵的調(diào)控因素，bl-2基因首先被發(fā)現(xiàn)位于第14號和第18號染色體平衡異位部位，并存在于大多數(shù)人類濾泡細胞淋巴瘤中[1]。bl-2是B細胞淋巴瘤或白血病-2基因〔B-elllypha/leukeia-2〕英文首字母縮寫。該基因于1985年首先在大多數(shù)非霍奇金淋巴瘤〔nn-HndgkinB-elllyphas〕細胞染色體上因易位而激活的基因中發(fā)現(xiàn)。1990年提醒該基因有特殊的抑制PD的作用。bl-2有如此好的抑制細胞凋亡的作用，那我們對于那些以細胞凋亡為病理機制的神經(jīng)變性性疾病就有可能尋找到了一條出路，當(dāng)然我們需要尋找有效而平安的“運輸工具〞將之導(dǎo)入細胞才能使之發(fā)揮作用。目前一直在研究的病毒性載體，有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒和慢病毒等。Bennett等[2]用腺病毒將bl-2基因?qū)胄∈?，發(fā)現(xiàn)bl-2可使其感光細胞變性明顯減慢且延遲到小鼠出生后6k才發(fā)生。逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因?qū)爰毎倪\載工具，應(yīng)用最早，研究也相當(dāng)成熟，而且目前仍被廣泛應(yīng)用。國內(nèi)已報道成功構(gòu)建反義人bl-2基因逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體[3,4]，還有報道成功構(gòu)建具有完好bl-2表達區(qū)的重組表達載體，以及帶有bl-2閱讀框架起始部位的局部編碼區(qū)正反向逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達載體[5]。本文成功構(gòu)建PLNX2-bl-2重組表達載體。為后期的視網(wǎng)膜色素變性的研究實驗奠定了一定的理論根底和數(shù)據(jù)參考?！緟⒖嘉墨I】1任新堯,羅超權(quán).分子遺傳學(xué)與基因工程.第1版.北京:科學(xué)出版社,1999:346-3472BennettJ,ZengY,BajaR,KlattL,LiY,aguireA.Adenvirus-ediateddeliveryfrhdpsin-prtedbl-2resultsinadelayinphtreeptrelldeathintherd/rduse.GeneTher,1998;5:1156-11643陳協(xié)群,工文亮,黃高升,王成濟.bl-2反義RNA對白血病細胞株程序化死亡的調(diào)