4細(xì)胞凍存的基礎(chǔ)知識(shí)

細(xì)胞凍存與復(fù)蘇技術(shù)概述細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)自1907年開創(chuàng)以來，歷經(jīng)一個(gè)世紀(jì)現(xiàn)已成為自然科學(xué)領(lǐng)域不可缺少的研究方法之一。在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛用于科學(xué)研究領(lǐng)域的令天，細(xì)胞株的冷凍保存和解凍復(fù)蘇這一基礎(chǔ)技術(shù)日益得到重視。低溫保存是活體組織保存最常用的方法之一。冷凍保存一般是指在0-196oC進(jìn)行保存，就是將體外培養(yǎng)物懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度，并在此溫度下對(duì)其長(zhǎng)期保存的過程。主要存20?-40°C冰箱保存、-60?-80°C深低溫冰箱和液氮（一196C）超低溫保存等。應(yīng)用方向醫(yī)學(xué)方面近年來干細(xì)胞的研究越來越被人們關(guān)注，由于它是一種具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，可分化為多種功能細(xì)胞。根據(jù)發(fā)育階段和取材來源，干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞兩大類。骨髓和臍血是成體干細(xì)胞的主要來源。骨髓干細(xì)胞在骨髓中含量極少，約占骨髓有核細(xì)胞的十萬分之一，所以要在臨床上廣泛應(yīng)用首先必須具備先進(jìn)的凍存與復(fù)蘇技術(shù)。而干細(xì)胞研究的深入將解決包括癌癥等一系列為人們所知的“絕癥”。而“冬眠”技術(shù)對(duì)醫(yī)學(xué)的發(fā)展有著里程碑式的意義。生物學(xué)方面細(xì)胞凍存技術(shù)是生物學(xué)保存物種的重要手段。在環(huán)境遭到史無前例的破壞動(dòng)物、植被隨時(shí)可能面臨滅絕危險(xiǎn)的今天，更是尤為關(guān)鍵，雖然不是治本的方法，但至少可以盡可能的留下那些曾經(jīng)存在的生命痕跡。發(fā)展歷史1776年.Spallanzani最早發(fā)表了“冷”處理對(duì)“細(xì)胞”生命活動(dòng)影響的報(bào)道。十九世紀(jì)中后葉，許多早期的工作者（Prevost，1840；deQuatrefages，1853；Mantegazza，1866；Scheuk，1870）重復(fù)研究了低溫處理對(duì)精子活動(dòng)的影響，得出了和Spallanzani相似的結(jié)論。即“冷不能殺死精子”。1900年前后，科學(xué)家基本上肯定了生物成份能夠在零下溫度儲(chǔ)存的事實(shí)。二十世紀(jì)50年代Luyet等多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)了電解質(zhì)濃度對(duì)儲(chǔ)存細(xì)胞的損傷作用，他們的基本結(jié)論是。電解質(zhì)濃度增大是造成儲(chǔ)存細(xì)胞損傷的主要原因。1972年.Mazur等首先根據(jù)中國(guó)倉(cāng)鼠組織培養(yǎng)細(xì)胞的低溫保存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，提出關(guān)于冷凍損傷的兩因素假說目，即冰晶損傷和溶液損傷假說。這個(gè)假說認(rèn)為隨著溫度的下降，細(xì)胞內(nèi)外的水分結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞并引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷即就是冰晶損傷（Intracellularicedamage）。冰晶損傷是由冷卻速度過快造成，冷卻速度越快，冰晶損傷越大。同時(shí)隨著溫度的下降.細(xì)胞外部的水分會(huì)先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高，細(xì)胞膜上的脂質(zhì)會(huì)因長(zhǎng)時(shí)問暴露在高溶質(zhì)的溶液中而受到損壞，細(xì)胞發(fā)生滲漏，導(dǎo)致在復(fù)溫時(shí)大量水分滲入細(xì)胞內(nèi)造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷被稱為溶液損傷（Solutiondamage）o溶液損傷是由冷卻速度過慢，使細(xì)胞在高濃度的溶液中暴露的時(shí)間過長(zhǎng)而造成，冷卻速度越慢，此損傷越嚴(yán)重。目前低溫醫(yī)學(xué)生物學(xué)對(duì)溫度的界限尚無明確規(guī)定，一般將溫度降至0°C?-200°C時(shí)，統(tǒng)稱為冷凍或低溫。冷凍有兩種截然不同的生物學(xué)效應(yīng)：一是維持細(xì)胞生命，達(dá)保存組織的目的；二是促使細(xì)胞壞死，達(dá)破壞組織的目的。影響細(xì)胞生死的主要因素，可以歸結(jié)為：（1）冷卻的溫度和速度；（2）復(fù)溫速度；（3）組織細(xì)胞對(duì)低溫感受性；（4）冷凍保護(hù)劑、冷凍免疫增強(qiáng)效應(yīng)和佐劑（免疫強(qiáng)化劑）。這些因素決定著細(xì)胞和組織的命運(yùn)。冷凍對(duì)組織細(xì)胞殺傷的主要機(jī)理尚未完全明瞭，目前認(rèn)為是多種因素綜合作用的結(jié)果，這些因素是；細(xì)胞內(nèi)外冰晶的機(jī)械性挫傷，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)毒性濃縮、細(xì)胞膜受損直至破裂、溫度休克、血流郁滯與微血管栓塞致使細(xì)胞缺氧而死亡等。（一） 相變制冷指利用致冷劑物態(tài)變化（液體蒸發(fā)、固體熔解或升華）的物理過程而達(dá)到制冷的目的。凡溶點(diǎn)、升華點(diǎn)和沸點(diǎn)溫度低的物質(zhì)均可作制冷技術(shù)中的致冷劑。（1）熔解過程（固態(tài)變液態(tài)）如鹽冰冷劑。（2）升華過程（固態(tài)變氣態(tài)）如固體二氧化碳（干冰）。（3）蒸發(fā)過程（液態(tài)變氣態(tài)）如作表面麻醉用的氯乙烷等。醫(yī)用制冷設(shè)備中常用的致冷劑有：二氧化碳，氟里昂和液態(tài)氮等。在相變制冷式冷凍治療器中，目前臨床廣泛采用的是液氮冷凍治療器，有手持式、軟管式和雙相傳輸式液氮冷凍治療器，液氮浸冷式冷刀及特種冷刀，以及自增壓杜瓦連體式醫(yī)用冷刀等，其結(jié)構(gòu)、體積、管道系統(tǒng)、杜瓦瓶等不斷改進(jìn)，并設(shè)有?？朴孟盗欣漕^，還配備測(cè)溫、定溫、復(fù)溫、監(jiān)視和記錄溫度等自控裝置。（二） 氣體膨脹制冷（等焓膨脹制冷）使壓縮氣體迅速通過閥門孔隙以降低壓力的方法稱為節(jié)流。氣體在節(jié)流膨脹時(shí)，改變自身溫度（冷卻或加熱）的現(xiàn)象稱為焦耳一湯姆遜效應(yīng)，是氣體節(jié)流膨脹制冷的基本原理。醫(yī)療上一般采用的氧氣節(jié)流式冷凍治療器，是一內(nèi)裝微型焦耳一湯姆遜效應(yīng)的筆形制冷器。由冷頭與人體組織進(jìn)行熱交換，使組織凍結(jié)。（三） 熱電效應(yīng)制冷（半導(dǎo)體制冷）把任何兩種不同的導(dǎo)體焊接起來構(gòu)成一個(gè)閉合電路，輸入一定電流后，在不同導(dǎo)體的兩個(gè)接點(diǎn)間就產(chǎn)生了溫度差，當(dāng)電流向某一方向流過時(shí)，接點(diǎn)發(fā)熱，當(dāng)電流方向相反時(shí)，該接點(diǎn)則變冷。此現(xiàn)象稱為帕爾帖效應(yīng)，在半導(dǎo)體焊接的回路中最明顯，故又稱半導(dǎo)體制冷?？捎枚嗉?jí)串連法制成半導(dǎo)體制冷器，但極數(shù)增加則體積加大，不便臨床使用。目前多為1—2級(jí)半導(dǎo)體制冷器，可用于眼科、耳鼻喉科等。低溫貯藏、低溫貯藏是使生物物質(zhì)在冷凍假死狀態(tài)下保存生命力的一種方法。近年來在理論和應(yīng)用方面都有較大的進(jìn)展，已應(yīng)用于許多方面。細(xì)胞貯存低溫貯存細(xì)胞比細(xì)胞培養(yǎng)傳代優(yōu)越，可避免遭受污染和繁殖活力的喪失。血液細(xì)胞：紅細(xì)胞回復(fù)率已可達(dá)85—95%；白細(xì)胞中以淋巴細(xì)胞回復(fù)率最高；血小板回復(fù)率可達(dá)42—97%。骨髓干細(xì)胞回復(fù)率可達(dá)65—100%。精、卵細(xì)胞回復(fù)率可達(dá)98—99%。組織貯存皮膚冷藏后活力高，優(yōu)于不冷藏者。角膜在深低溫下保存時(shí)間平均可達(dá)2個(gè)月，在4°C下保存須于48小時(shí)內(nèi)使用，胰島冷藏復(fù)溫后，其分泌量約達(dá)冷藏前的50—75%。硬腦膜經(jīng)冷凍干燥保存后，移植效果更好。器官貯存狗腎臟冷藏、移植實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功。大鼠心肺整塊摘除冷藏2年復(fù)溫后，心臟可重新跳動(dòng)。胚胎貯存低溫貯存的胚胎，已可供導(dǎo)地運(yùn)送和移植。人體貯存即人生命貯存。今天患有不治之癥的病人，希望貯藏起來，若干年能治愈時(shí)，再?gòu)?fù)蘇治療。于是人體保存應(yīng)運(yùn)而生。美國(guó)、法國(guó)等已建立了冷凍活人的機(jī)構(gòu)，據(jù)報(bào)道現(xiàn)已低溫貯存100多人。法國(guó)聲稱將于2000年復(fù)活一位腦瘤患者，人們正拭目以待。超低溫醫(yī)學(xué)簡(jiǎn)況（了解）液氦溫區(qū)三個(gè)特殊的物理效應(yīng)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，帶來了超低溫醫(yī)學(xué)的發(fā)展。（一） 超導(dǎo)效應(yīng)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用利用液氦冷卻的超導(dǎo)磁場(chǎng)技術(shù)，已研制成以下幾種設(shè)備：（1）超導(dǎo)n一介子加速器：用于治療惡性腫瘤，取得了比一般放射治療更好的療效；（2）小型超導(dǎo)磁鐵系統(tǒng)：臨床已對(duì)舌癌治療成功，對(duì)腦、腎腫瘤亦取得預(yù)期效果，對(duì)肺、肝、甲狀腺等惡性腫瘤的治療亦很有成功希望；（3）高分辨率核磁共振波譜儀：不僅生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)中獲得重要應(yīng)用，還可用于腫瘤標(biāo)本的快速鑒別。（二） 超流效應(yīng)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用真空超紫外激光器即是4He的超流效應(yīng)在醫(yī)學(xué)中的最新應(yīng)用，正用于生物醫(yī)學(xué)、分子反應(yīng)等方面。（三） 超導(dǎo)隧道效應(yīng)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用超導(dǎo)強(qiáng)磁計(jì)即是根據(jù)超導(dǎo)隧道效應(yīng)這一原理制成的超導(dǎo)量子干涉器件（SQUID）在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。將超導(dǎo)強(qiáng)磁計(jì)置于病人身邊，即可接收到心臟、腦和肌肉所產(chǎn)生的極微弱的