Biacore實(shí)驗(yàn)原理及流程

Biacore實(shí)驗(yàn)原理及流程Biacore可檢測樣品的范圍十分廣泛，包括蛋白、多肽、抗原、抗體、核酸、有機(jī)小分子、脂類、多糖、中草藥、納米材料、高分子材料、細(xì)胞、細(xì)菌、病毒，甚至組織裂解液、血清以及腹水等臨床樣品。目前，Biacore技術(shù)主要應(yīng)用于生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、新藥的篩選和開發(fā)、食品工業(yè)等，尤其在腫瘤、蛋白質(zhì)組學(xué)、免疫學(xué)和傳染病、生物制藥方面應(yīng)用較多。一、 實(shí)驗(yàn)原理Biacore是基于表面等離子體共振（SPR）技術(shù)來實(shí)時(shí)跟蹤在天然狀態(tài)下生物分子間的相互作用，無需任何標(biāo)記物。表面等離子體共振（surfaceplasmonresonance，SPR）是一種光學(xué)現(xiàn)象，在傳感芯片發(fā)生全反射界面上有一層約50nm厚的金屬膜，偏振光入射到棱鏡的一端，在棱鏡與金屬膜的界面會(huì)產(chǎn)生表面等離子波，當(dāng)入射光波的傳播常數(shù)與表面等離子波的傳播常數(shù)匹配時(shí)，金屬膜內(nèi)的自由電子會(huì)產(chǎn)生共振，即表面等離子共振體。分析時(shí)，先將一種生物分子即配體（蛋白、抗體等）偶聯(lián)在生物傳感器表面，再將含有另一種能與靶分子產(chǎn)生相互作用的生物分子（分析物）的溶液注入并流經(jīng)生物傳感器表面。生物分子間的結(jié)合引起生物傳感器表面質(zhì)量的增加，導(dǎo)致折射率的變化，通過監(jiān)測SPR的角度變化，可自動(dòng)獲得分析物的動(dòng)力學(xué)結(jié)合和解離常數(shù)、親和力及特異性等。生物分子間反應(yīng)的變化即被觀察到。二、 實(shí)驗(yàn)材料儀器：Biacore3000；Biacore8K樣品：a，樣品是否均一，多聚物還是異構(gòu)體；b，樣品中是否有高折光率物質(zhì)，甘油、蔗糖、咪唑等；c，分析物的純度如何，動(dòng)力學(xué)/親和力測定：純度〉90%；d，分析物是否有活性，要新鮮有活性；e，是否存在非特異性結(jié)合，檢查參比通道；f，使用運(yùn)行緩沖液稀釋，盡量減小容積誤差。傳感芯片:芯片類型葡聚糖CM5CM7SABNiotinTACAPProteinA，G，L芯片CHAPAu裸金芯片適用范圍最常用小捕芯片類型葡聚糖CM5CM7SABNiotinTACAPProteinA，G，L芯片CHAPAu裸金芯片適用范圍最常用小捕的傳感芯分子片，除HPA、檢測，C1和Au， 可達(dá)獲生物素標(biāo)記的配體逆性獲生物 His-ta所有芯片表到較面都覆蓋有高偶獲芯的配片體CM5 聯(lián)水平接捕用于獲脂分析質(zhì)體物是分子多價(jià)體或體積較大的分析物直適:用于以定膜系統(tǒng)模型的相關(guān)制表面(材料、研究高分子等)注意：葡聚糖表面的作用：親水性；溫和型：和2%濃度的葡萄糖水溶液環(huán)境相似；非特異性結(jié)合量低;高結(jié)合容量；易于進(jìn)行供價(jià)結(jié)合；出色的化學(xué)穩(wěn)定性。三、基本步驟1，芯片表面預(yù)處理偶聯(lián)分子：□直接偶聯(lián)：利用化學(xué)共價(jià)鍵，將分子直接偶聯(lián)至芯片表面。口捕獲：將捕獲分子偶聯(lián)在芯片表面，通過高度的親和作用捕獲分子。在偶聯(lián)分子時(shí)，通常進(jìn)行預(yù)富集(Pro-concentration)，預(yù)富集的目的是在化學(xué)偶聯(lián)過程中，通過靜電作用吸附并提高芯片表面附近的配體濃度，從而提高偶聯(lián)的效率和減少配體的消耗。有效的預(yù)處理pH，范圍處于芯片表面的pKa和配體的蛋白等電點(diǎn)(pI)之間。另外緩沖液中的離子強(qiáng)度必須較低，常用的緩沖液10mM醋酸鈉(pH4.0-5.5)。比如葡聚糖芯片時(shí)，3.5<pH<pI，蛋白帶正電，葡聚糖帶負(fù)電，通過靜電吸附可以富集配體。pH太低時(shí)，葡聚糖不帶電，無法富集°pH>pI時(shí)，蛋白和葡聚糖都帶負(fù)電，無法富集。進(jìn)樣通過進(jìn)樣，樣品以恒定的流速和濃度流過芯片表面。樣品中的待分析物（analyte）和偶聯(lián)在芯片上的分子（ligand）結(jié)合，芯片表面物質(zhì)的質(zhì)量發(fā)生改變，儀器記錄下對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值（response）的改變。進(jìn)樣結(jié)束后，使緩沖液流過芯片表面，以檢測叢配體上解離下來的分析物的量。再生將和配體結(jié)合的分析物分子從芯片表面徹底除去，必須保持芯片表面的活性。數(shù)據(jù)分析四、 總結(jié)1，選擇適合的配體固定方式：偶聯(lián)物、偶聯(lián)量、偶聯(lián)方式根據(jù)進(jìn)樣測試和預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇合適的分析物的濃度梯度：至少5個(gè)濃度梯度；濃度范圍：0.1KD-10KD；零濃度合適的再生條件設(shè)定程序，自動(dòng)運(yùn)行五、 注意事項(xiàng)1，對(duì)照表面的設(shè)計(jì)口空白表面：適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，檢查和葡聚糖表面相關(guān)的非特異性結(jié)合?？诮?jīng)活化-失活處理的表面：按照偶聯(lián)的步驟處理芯片，但不偶聯(lián)配體。減少了芯片表面攜帶的負(fù)電荷，從而減少非特異性結(jié)合。2，緩沖液加0.