白血病細(xì)胞免疫表型流式細(xì)胞儀史桂英

白血病細(xì)胞免疫表型流式細(xì)胞分型技術(shù)及意義（FlowCytometer）

SSMUShiGuiYing分析細(xì)胞學(xué)FALSSensorLaser細(xì)胞的形態(tài)學(xué)參數(shù)生物學(xué)特征細(xì)胞化學(xué)成分及含量細(xì)胞的功能定量分析細(xì)胞學(xué)年青的交叉學(xué)科

激光技術(shù)數(shù)字計(jì)算機(jī)技術(shù)電子物理技術(shù)電子攝像技術(shù)光電測(cè)量技術(shù)熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)單克隆抗體技術(shù)等FCMHistory1934Moldavanlfirsttry（從固定式細(xì)胞分析-流動(dòng)式）1953Crosland-Taylor:laminarflow（解決難題）1956Coulter（初次應(yīng)用）1965Kamentsky:spectrometerprinciple(Ortho（開拓）1967VandillaandLosAlamosgroup:Feulgen,DNAHistogram（完善）1969Hulett:Sorter(Icp-22)1973B-D:FirstcommercialFCM--FACSI（發(fā)展）1979SSMU:FCMDeveloping（推廣）1980BJNU:FirstFCM(FACSIII)inChinaAbout450FCMsinChina1979年國(guó)家科委重點(diǎn)項(xiàng)目：研制國(guó)內(nèi)第一臺(tái)激光流式細(xì)胞儀1982年國(guó)內(nèi)第一臺(tái)三參數(shù)激光流式細(xì)胞儀誕生1984年國(guó)家科委組織科研成果的鑒定驗(yàn)收1985年獲國(guó)家衛(wèi)生部科技成果乙等獎(jiǎng)1985年--1990年靈敏度、信噪比、更多參數(shù)流式分選儀研制開發(fā)計(jì)算機(jī)四參數(shù)軟件樣品制備、醫(yī)學(xué)生物學(xué)應(yīng)用BD公司不同型號(hào)流式細(xì)胞儀FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCantoCoulter公司不同型號(hào)流式細(xì)胞儀EPICSXL/XL-MCL

臺(tái)式機(jī)

CytomicsTMFC500系列最新型EPICSAltra細(xì)胞分選儀大型科研型

什么是流式細(xì)胞術(shù)(FCM)？

FCM是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。FALSSensorLaser特點(diǎn):

流動(dòng)的可以是活細(xì)胞的定量的多參數(shù)的高統(tǒng)計(jì)學(xué)精度的分選細(xì)胞

FCM的一般結(jié)構(gòu)和原理速度軌跡檢測(cè)散射光熒光InjectorTip熒光信號(hào)激光束Sheathfluid流動(dòng)室2-3mm方形石英內(nèi)徑直200-300m

流速慢,細(xì)胞信號(hào)大,小型化。通過流動(dòng)室后細(xì)胞一個(gè)一個(gè)排列成單行,依次通過檢測(cè)區(qū).把流動(dòng)室稱為單細(xì)胞流發(fā)生器.流動(dòng)室LaserFlowCell孔徑50-200m

檢測(cè)區(qū)離噴口200m有分選功能

液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)（示意圖）流速與壓力的關(guān)系服從Bernoulli方程，即P=(1/2)V2

(忽略高度的變化)。改變氣壓,就可獲得不同的流速。

FACSVantageFluidSystem激光（Laser,Lightamplificationbystimulatedemissionofradiation)是一種相干光源。單譜線，高強(qiáng)度.

細(xì)胞在1-2us內(nèi)就可以收集到足夠強(qiáng)的熒光信號(hào).一般采用Ar+激光器,有多條可調(diào)譜線,與多種熒光染料激發(fā)譜匹配.激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)

球透鏡和柱面透鏡：20×200m

橢圓形光，短軸和細(xì)胞流平行，長(zhǎng)軸與細(xì)胞流垂直。

光束成形與細(xì)胞受照方式激發(fā)光焦斑這種橢圓形光斑的檢測(cè)區(qū)保證每個(gè)細(xì)胞分別受到光照且受檢時(shí)受到一致的光照

FCM的單細(xì)胞照明技術(shù).光束成形與細(xì)胞受照方式低速高速

不同樣本速率形成的樣本流

LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系統(tǒng)：濾光片信號(hào)轉(zhuǎn)換系統(tǒng):光電數(shù)字信號(hào).FCM細(xì)胞分選裝置488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFSCSensorFluorescencedetector

超聲振蕩器:20-40KC液流斷離點(diǎn):離噴口5-8mmf=v/4.5d液滴沖電:脈沖幅度,荷電多少,寬度大小同時(shí)帶電液滴數(shù)多少.靜電高壓偏轉(zhuǎn)板:幾千伏電壓分選細(xì)胞的收集裝置:96孔板,載玻片或試管利用單克隆抗體分離細(xì)胞亞群陽性選擇陰性選擇MACS-MagneticCellSorting磁珠分離通道式分選電荷式分選細(xì)胞分選系統(tǒng)PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser1234Flowcell

細(xì)胞信號(hào)檢測(cè)與分析處理系統(tǒng)光電管細(xì)胞散色光的波長(zhǎng)是與激發(fā)光波長(zhǎng)一致的.前向散色光信號(hào):光電二極管側(cè)向及熒光信號(hào)用光電倍增管PMT可將散色光及熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電脈沖信號(hào),電脈沖信號(hào)通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器(ADC)量化為數(shù)字信號(hào).FALSSensorLaserForwardAngleLightScatter(FSC)細(xì)胞散色光信號(hào)細(xì)胞對(duì)光的散色現(xiàn)象與細(xì)胞樣品制備無關(guān).90DegreeLightScatter(SSC)FALSSensor90LSSensorLaser細(xì)胞對(duì)光的散色現(xiàn)象與細(xì)胞樣品制備無關(guān).FSCFSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小和活力相關(guān)SSCSSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)顆粒多少相關(guān)細(xì)胞散色光信號(hào)細(xì)胞熒光測(cè)量細(xì)胞的自發(fā)熒光

未經(jīng)染色的樣品細(xì)胞在激發(fā)光的照射下可測(cè)到有微弱的熒光信號(hào).細(xì)胞熒光

經(jīng)過各種特異染色的細(xì)胞在激發(fā)光的照射下可測(cè)到較強(qiáng)的熒光信號(hào).自發(fā)熒光信號(hào)與特異染色的熒光信號(hào)分析圖自發(fā)熒光信號(hào)特異染色的熒光信號(hào)細(xì)胞熒光信號(hào)AMPAMP

經(jīng)過PMT將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖信號(hào)，并增加PMT的電壓及增益，可將脈沖信號(hào)進(jìn)行放大。放大方式有兩種：線性放大(Lin):對(duì)數(shù)放大(Log):熒光信號(hào)的測(cè)量：

熒光檢測(cè)器檢測(cè)特定熒光的特定發(fā)射波長(zhǎng)

線性放大對(duì)數(shù)放大細(xì)胞熒光信號(hào)熒光光譜重疊

FITC和PE熒光光譜重疊

UncompensatedvsCompensatedFL1FL2利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號(hào)加以扣除的技術(shù)稱“熒光補(bǔ)償”熒光補(bǔ)償FCM測(cè)量數(shù)據(jù)的存貯、顯示和分析（一）FCM數(shù)據(jù)的存貯（二）FCM數(shù)據(jù)的顯示方式（一）FCM數(shù)據(jù)的存貯

ListMode方式就是用表格的方式將每一個(gè)被測(cè)細(xì)胞的眾多原始測(cè)量數(shù)據(jù)全部記錄下來，成為一個(gè)數(shù)據(jù)文件。1.單參數(shù)直方圖（Histogram）2.雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示：

二維點(diǎn)圖(DotPlot)

等高線圖(ContourPlot)

二維密度圖(DensityPlot)

假三維圖(Pseudo3DPlot)3.三維圖(3DPlot)（二）FCM數(shù)據(jù)的顯示方式１.單參數(shù)直方圖的顯示

以分布直方圖(distributionhistogram)來顯示，橫軸為該參數(shù)測(cè)量強(qiáng)度相對(duì)值，單位是道數(shù)。強(qiáng)度分布可以是線性的，也可以是對(duì)數(shù)的?？v軸一般是細(xì)胞數(shù)或細(xì)胞出現(xiàn)的頻數(shù)。Single-ParameterHistogramDisplays單參數(shù)直方圖的顯示２.雙參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示

細(xì)胞雙參數(shù)測(cè)定不僅能提供二個(gè)參數(shù)各自與細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系，更重要的是獲得了這二參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系，其中包含了更多的生物學(xué)信息。雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示最常用的是二維的散點(diǎn)圖(DotPlot)。在二維圖上，X軸代表第一個(gè)測(cè)量參數(shù)，Y軸代表第二個(gè)測(cè)量參數(shù)。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞.Two-ParameterDataDisplays點(diǎn)圖(dotplot)二維等高圖

用等高線來表示細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。假三維等高圖

縱軸與橫軸分別代表被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù),Z軸為細(xì)胞數(shù)。３.多參數(shù)數(shù)據(jù)的顯示

在單一圖上同時(shí)顯示多參數(shù)是不可能的。實(shí)際工作中是用若干個(gè)單參數(shù)直方圖和各種不同組合的雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示來反映各種信息的。多參數(shù)測(cè)量另一重要意義是通過有關(guān)參數(shù)進(jìn)行“設(shè)門”分析(gatinganalysis)可以是單參數(shù)設(shè)門，也可以是雙參數(shù)設(shè)門。單參數(shù)設(shè)門調(diào)出雙參數(shù)顯示簡(jiǎn)稱“一調(diào)二”。不難理解也有“一調(diào)一”和“二調(diào)一”和“二調(diào)二”等。Multiple-ParameterDataDisplays多參數(shù)直方圖

三維坐標(biāo)勻?yàn)閰?shù)（散射光或熒光）而非細(xì)胞數(shù)。多參數(shù)顯示

一般利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設(shè)門（Gate)技術(shù)，來分析參數(shù)之間的相互關(guān)系。Pseudo3DPlot3DPlot多參數(shù)顯示通過雙參數(shù)調(diào)閱單參數(shù)通過單參數(shù)調(diào)閱雙參數(shù)１.單參數(shù)分布直方圖的設(shè)區(qū)分析２.細(xì)胞DNA含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析３.雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設(shè)門分區(qū)分析４.多參數(shù)數(shù)據(jù)的分析FCM數(shù)據(jù)的分析１.單參數(shù)分布直方圖的設(shè)區(qū)分析細(xì)胞DNA含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析細(xì)胞DNA含量分布直方圖的數(shù)據(jù)分析DNA分析比較

縱軸與橫軸分別代表被測(cè)細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù),在圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設(shè)門分區(qū)分析雙參數(shù)數(shù)據(jù)的設(shè)門分區(qū)分析正常造血細(xì)胞分化成熟的抗原表達(dá)正常造血細(xì)胞不同階段的抗原表達(dá)是受一系列基因嚴(yán)密控制的,在一定的分化階段哪些抗原表達(dá)上調(diào)、哪些抗原表達(dá)下調(diào)及抗原表達(dá)量多少存在著明顯的規(guī)律性.一部分白血病細(xì)胞反映了這種分化模式,但白血病細(xì)胞經(jīng)常出現(xiàn)異常的抗原表達(dá)模式.這些異常的抗原表達(dá)模式可以作為診斷白血病的有用指標(biāo),也可以作為檢測(cè)殘存白血病的重要指標(biāo).FCM白血病細(xì)胞免疫表型診斷I:粒細(xì)胞表達(dá)CD34HLA-DRCD13CD45較高水平的CD33,不表達(dá)成熟標(biāo)志.II:CD34HLA-DR下調(diào)變?yōu)殛幮?CD15高表達(dá)CD33輕度減低,CD13/CD45不變.III:出現(xiàn)中水平CD11b,CD13減弱,CD33與II相同,CD45陽性.IV:CD13增強(qiáng),出現(xiàn)CD10,CD33進(jìn)一步減低.CD11b和CD15表達(dá)增強(qiáng).V:CD11b、CD13、CD45表達(dá)最強(qiáng),CD15陽性,CD33弱陽性.分選出:I為原粒細(xì)胞II早幼粒細(xì)胞III中幼粒細(xì)胞IV晚幼粒細(xì)胞V中性分葉核粒細(xì)胞分選出:I原單核細(xì)胞II幼單核細(xì)胞III成熟單核細(xì)胞I:表達(dá)中等程度的CD34CD13CD45CD33和HLA-DR.與原粒細(xì)胞不能區(qū)分.II:CD11b快速上調(diào),CD13CD33增加,CD45保持中等水平.HLA-DR減弱,仍為陽性.III:CD14快速上調(diào),CD45也增加.CD13CD33HLA-DR陽性.成熟粒細(xì)胞與單核細(xì)胞HLA-DR表達(dá)不同,前者為陰性,后者為陽性:CD14在成熟單核細(xì)胞為陽性,而粒細(xì)胞為陰性.分選出:I原始B淋巴細(xì)胞II胞質(zhì)IgM陽性IIIFMC7及表面IgM也在此期出現(xiàn)I:原始B細(xì)胞，表達(dá)CD34HLA-DRTdTCD10高表達(dá)，CD19CD45CD22較弱.II:CD19CD45量增加,CD10量減少.CD34TdT變陰性.CD20開始表達(dá),CD22強(qiáng)度不變,仍較弱.III:CD20CD45到最