20120615分析方法驗證的基本思路-張俊山

分析方法驗證的基本思路測定方法HPLCGC滴定分析方法類型含量有關物質或溶殘溶劑殘留含量驗證項目系統(tǒng)適應性YesYesYesNo專屬性YesYesYesYes(空白校正)精密度YesYesYesYes線性及范圍YesYesYesYes準確度YesYesYesNo定量限及檢測限NoYesYesNo耐用性YesYesYesYes12含量（HPLC）一系統(tǒng)適應性2.專屬性3.精密度線性及范圍準確度耐用性2系統(tǒng)適應性是分析方法達到其分析目的的前提；嚴格說來，作為方法驗證的一個項目是合適的；在分析方法驗證前應進行系統(tǒng)適應性的測試，并在驗證過程中確保系統(tǒng)適應性符合要求。3含量（HPLC）1.系統(tǒng)適應性溶液配制空白溶液；系統(tǒng)適應性溶液；對照液可接受標準滿足專論的系統(tǒng)適應性要求；對稱因子應在0.8~1.5之間（EP2.2.46）；RSD（EP2.2.46&USP621）需報告內容主峰與已知雜質RT（RRT）；分離度；主峰峰面積及RSD；可能包括拖尾因子或對稱因子或理論塔板數(shù)

。34含量（HPLC）2.專屬性溶液配制空白溶液；對照液；供試液可接受標準空白溶液在供試液和對照液中主峰RT處無干擾；供試液中主峰RT與對照液中主峰RT保持一致；供試液與對照液中主峰的峰純度因子≥995或者符合色譜系統(tǒng)默認參數(shù)需報告內容主峰RT及主峰純度因子4中間精密度：同一實驗室內不同人、不同日期、不同儀器

重現(xiàn)性：不同實驗室之間3.精密度——對方法n次重復，不是對某個溶液n次重復重復性溶液配制對照液，2份；供試液，6份可接受標準RSD（n=6）≤2.0%重現(xiàn)性溶液配制同重復性可接受標準RSD（n=6）≤2.0%；RSD（n=12）≤2.0%；（作用不大）重復性與重現(xiàn)性均值的絕對差值≤2.0%；樣品檢測溶液配制ATS和基地對不同于驗證使用的另一批次樣品進行檢測?？山邮軜藴蔄TS與基地QC檢測的含量的絕對差值≤2.0%。重現(xiàn)性中已經進行，此項不一定必需需報告內容主峰峰面積；6份及12份含量單值，Mean±SD，RSD；95%CI（n=6）；含量均值的絕對差值。5溶液名稱進樣針數(shù)目的空白溶液1或2針消除殘留，排除干擾，通常必需專屬性溶液1或2針若非綜合驗證，不必需系統(tǒng)適應性溶液1針看系統(tǒng)適應性項目和要求對照液15針/6針這是真正的系統(tǒng)適應性對照液22針供試液6份各1針對照液12針重現(xiàn)性下進樣序列：6線性和范圍是兩個不同的概念。應根據(jù)方法的特征首先確定范圍，然后在范圍內驗證方法的線性Y軸截距的大小應當根據(jù)范圍的開始點設定，對于含量等范圍較窄，且范圍起始點離遠點較遠的方法，Y軸截距不必需或者應放寬。7含量（HPLC）4.線性及范圍溶液配制

50%~150%的線性溶液（至少5個點）可接受標準r≥0.9990;Y軸截距/100%濃度時Y軸響應值的絕對值≤2.0%需報告內容線性點的實際濃度及峰面積；線性圖；線性范圍；線性方程；相關系數(shù)；殘差平方和；Y軸截距；Y軸截距的95%CI；Y軸截距/100%濃度時Y軸響應值的絕對值。78含量（HPLC）5.準確度溶液配制

80%，100%，120%的準確度溶液各三份，可用一個母液稀釋?？山邮軜藴蕟蝹€回收率及平均回收率應在98.0%~102.0%；回收率（n=9）的RSD≤2.0%。需報告內容實際測得值；理論值；單個回收率；平均回收率及其95%CI及RSD。86.耐用性溶液穩(wěn)定性溶液配制系統(tǒng)適應性溶液；對照液；供試液可接受標準系統(tǒng)適應性溶液：如分離度符合要求；對照液及供試液：各時間點主峰含量（或峰面積）與0h相比應在98.0~102.0%；

主峰峰純度因子≥990。需報告內容系統(tǒng)適應性要求；主峰含量（或峰面積）及峰純度因子；各時間點含量（或峰面積）與0h的比值；符合要求測試點的RSD。色譜條件的影響溶液配制系統(tǒng)適應性溶液；對照液色譜條件流動相比例；流速；pH值；柱溫；色譜柱批號。可接受標準同系統(tǒng)適應性項下的可接受標準。需報告內容同系統(tǒng)適應性項下各報告內容9耐用性——個人理解

耐用性的目的是通過有意識地對測定參數(shù)進行調整，來測試方法對檢測條件變化的容許能力，從而為日常檢測提供指導。通常以系統(tǒng)適應性指標來評估

目前的方法驗證中，關于耐用性的驗證操作方法太過復雜，且對實際檢測的指導意義不大。

需思考和討論的問題：EP、USP中都有在保證系統(tǒng)適應性滿足要求的前提下，允許對系統(tǒng)進行調整的參數(shù)范圍。這里面允許的參數(shù)范圍要遠寬于耐用性驗證的范圍。請問你怎么考慮這兩個參數(shù)的范圍差別。

1011有關物質或溶殘（HPLC）二系統(tǒng)適應性2.專屬性精密度檢測限及定量限線性及范圍準確度耐用性1112含量（HPLC）1.系統(tǒng)適應性溶液配制空白溶液系統(tǒng)適應性溶液對照液

靈敏度溶液可接受標準滿足專論的系統(tǒng)適應性要求；對稱因子應在0.8~1.5之間（EP2.2.46）RSD（EP2.2.46&USP621）S/N≥10需報告內容分離度或拖尾因子或對稱因子或理論塔板數(shù)；主峰及已知雜質RT，RRT；主峰峰面積及RSD；主峰信噪比。12132.專屬性空白干擾及增敏試驗溶液配制空白溶液；供試液；對照液；系統(tǒng)適應性溶液，增敏溶液。可接受標準空白溶液在各雜質及主峰RT處（和/或RRT）無干擾供試液和對照液中已知單雜及主峰與相鄰峰的R≥1.5供試液和對照液中主峰及已知雜質的RT保持一致供試液與對照液中主峰的峰純度因子≥990增敏溶液與系統(tǒng)適應性溶液中的已知雜質RT保持一致增敏溶液與供試液相比，已知雜質RT處峰面積增強需報告內容分離度；主峰及已知雜質峰RT（和/或RRT）及其峰面積；主峰峰純度因子。13142.專屬性（續(xù)上）強制降解試驗溶液配制未破壞供試液；各破壞試驗空白溶液；酸破壞試驗；堿破壞試驗；氧化破壞試驗；光照破壞試驗；高溫破壞試驗。注：1.光照強度總量：ICHQ1B要求要達到1.2×106Luxhours；2.破壞后主峰含量的計算：用未破壞供試液為對照液進行外標計

算破壞后主峰含量，降解率在5~10%，降解率與總雜偏差≤5%可接受標準各破壞溶液中新增降解雜質與主峰及已知雜質R≥1.5（可調整，至少保留主峰與相鄰雜質的R的標準）各破壞溶液中主峰的峰純度因子≥990。需報告內容分離度；主峰峰純度；主峰含量及降解率；對比破壞前后各雜質變化情況（包括RRT，含量及總雜）；列出主要降解雜質。143.精密度分析重復性溶液配制對照液，1份；供試液或100%加標液或雜質限度濃度的主成分考察溶液，6份可接受標準RSD（n=6）≤10.0%重現(xiàn)性溶液配制同分析重復性可接受標準RSD（n=6）≤10.0%RSD（n=12）≤10.0%；重復性與重現(xiàn)性已知單雜含量均值（或主成分則以主峰計）的絕對差值≤0.05%（可調整）。樣品檢測溶液配制ATS和基地對不同于驗證使用的另一批次樣品進行檢測?？山邮軜藴蔄TS與基地QC檢測的已知雜質含量的絕對差值≤0.05%，總雜的絕對差值≤0.10%（可調整）需報告內容主峰或已知單雜峰面積；6份及12份主峰或已知單雜含量單值，Mean±SD，RSD；95%CI（n=6）；含量均值的絕對差值。15溶液名稱進樣針數(shù)空白溶液1或2針系統(tǒng)適應性溶液1針靈敏度溶液1針專屬性溶液（如必要）1或2針對照液3、5、6針（根據(jù)RSD定）供試液6份各1針靈敏度溶液1針系統(tǒng)適應性溶液1針應考慮成本重現(xiàn)性下進樣序列：16含量（HPLC）4.檢測限及定量限溶液配制對照液逐級稀釋至S/N≥3和S/N≥10時的濃度溶液，連續(xù)進樣三針。可接受標準檢測限：S/N≥3;定量限：S/N≥10；RSD（n=3）≤10.0%或15.0%；

定量限≤忽略限（或報告限）。需報告內容信噪比；主峰峰面積及RSD（RSD僅是用于定量限）

；定量限及檢測限的濃度及其相當于供試液中主峰濃度的百分比。1718含量（HPLC）5.線性及范圍溶液配制報告限~雜質限度的150%（至少5個點）注：若方法描述中對照液的濃度超過了雜質限度，則線性最高點做到對照液濃度的150%?？山邮軜藴蕆≥0.990;Y軸截距/最低雜質限度時Y軸響應值的絕對值≤5.0%（最大可放寬至10.0%）需報告內容線性點實際濃度及峰面積；線性圖；線性范圍；線性方程；相關系數(shù)；殘差平方和；Y軸截距；Y軸截距的95%CI；Y軸截距/雜質限度對應的響應值的絕對值。18雜質準確度測定通常采用回收率的方式檢測，雜質標準品可得時可行對于原料藥，雜質標準品不可得時不可行。對于制劑，雜質標準品不可得時可用主成分代替。應考慮檢測驗證成本。不一定為做準確度而進行雜質標準品的制備和標定。從定量限起做準確度，有回收率超標的風險。含量（HPLC）6.準確度溶液配制

報告限，雜質限度，及線性最高點的準確度溶液各3份，可用一個母液稀釋。供試液，1份（供試品加標雜質）和/或對照液，1份（主成分方法）注：若本底太高，最低點可從50%做起，或用對照品代替供試品?？山邮軜藴蕟蝹€回收率及平均回收率應在90.0%~110.0%；回收率（n=9）的RSD≤10.0%。需報告內容實際測得值；理論值；單個回收率；平均回收率及其95%置信區(qū)間及RSD。197.耐用性溶液穩(wěn)定性溶液配制系統(tǒng)適應性溶液；對照液；供試液可接受標準系統(tǒng)適應性溶液：滿足要求；對照液：主峰峰面積與0h相比應在0.9~1.1之間；供試液：總雜含量與0h相比應在0.9~1.1之間；各原單雜含量的極差|An-A0|≤0.05%；不得出現(xiàn)大于0.05%的新雜質。主峰面積變化可以增加，重點考慮雜質峰需報告內容系統(tǒng)適應性要求；主峰峰面積或含量，RRT；各時間點主峰峰面積與0h比值；單雜含量及極差；總雜質含量與0h的比值。色譜條件的影響溶液配制系統(tǒng)適應性；對照液（方法開發(fā)時應考慮供試液）色譜條件流動相比例；流速；pH值；柱溫；色譜柱批號?？山邮軜藴释到y(tǒng)適應性項下的可接受標準。注：在RSD符合要求的情況下，可減少為3針。需報告內容同系統(tǒng)適應性項下各報告內容。2021溶劑殘留（GC）三系統(tǒng)適應性2.專屬性精密度檢測限及定量限線性及范圍準確度耐用性2122含量（HPLC）1.系統(tǒng)適應性溶液配制空白溶液；對照液可接受標準對照液中待測溶劑峰與相鄰峰的分離度≥1.5；RSD(n=6)≤5.0%或10.0%；需報告內容分離度；待峰溶劑峰的峰面積及RSD。2.專屬性溶液配制空白溶液；對照液；供試液；100%加標溶液；專屬性溶液（峰鑒別溶劑+對照液）；可接受標準空白溶液在待測溶劑峰的RT處（或RRT）無干擾；供試液和100%加標液與對照液中待測峰RT保持一致；專屬性溶液及100%加標液中待測峰與相鄰峰的R≥1.5100%加標液和供試液相比，待測峰的峰面積增加。需報告內容分離度；各溶劑峰的RT（或RRT）及峰面積。223.精密度重復性溶液配制對照液，1份；供試液或100%加標液，6份可接受標準RSD（n=6）≤10.0%重現(xiàn)性溶液配制同分析重復性可接受標準RSD（n=6）≤10.0%；RSD（n=12）≤10.0%；重復性與重現(xiàn)性均值的絕對差值≤1/10溶殘限度（對于痕量分析的可以放寬到限度的1/2）；樣品檢測溶液配制ATS和基地對不同于驗證使用的另一批次樣品進行檢測.可接受標準ATS與基地QC檢測的含量的絕對差值≤1/10溶殘限度（對于痕量分析的可以放寬到限度的1/2）。需報告內容待測溶劑峰面積；6份及12份含量單值，Mean±SD，RSD；95%CI（n=6）；含量均值的絕對差值。23溶液名稱進樣針數(shù)空白溶液1或2針專屬性溶液（如必要）1或2針對照液6份各1針供試液6份（或100%供試品加標液6份）各1針重現(xiàn)性下進樣序列：2425含量（HPLC）4.檢測限及定量限溶液配制對照液逐級稀釋至S/N≥3和S/N≥10時的濃度，各平行配制3份。可接受標準檢測限：S/N≥3;定量限：S/N≥10；RSD（n=3）≤10.0%或15.0%需報告內容信噪比；待測溶劑峰峰面積及RSD（RSD僅用于定量限）；定量限及檢測限的濃度及其相當于供試液濃度的百分比（或ppm）。2526含量（HPLC）5.線性及范圍溶液配制

LOQ~150%的線性溶液（至少5個點）可接受標準r≥0.990;Y軸截距/100%濃度時Y軸響應值的絕對值≤5.0%（最大可放寬至10.0%）。需報告內容線性實際濃度及峰面積；線性圖；線性方程；線性范圍；相關系數(shù)；殘差平方和；Y軸截距；Y軸截距95%CI；Y軸截與/100%濃度對應響應值的絕對值。6.準確度溶液配制

50%，100%，150%的加標液各三份，可用一個母液稀釋；供試液，2份注：若本底太高，低濃度點可用對照品代替供試品?？山邮軜藴蕟蝹€回收率及平均回收率應在90.0%~110.0%；回收率（n=9）的RSD≤10.0%。注：痕量分析回收率最多可以放寬到70.0-130.%。需報告內容實際測得值；理論值；單個回收率；平均回收率及其95%CI及RSD。267.耐用性溶液穩(wěn)定性溶液配制對照液，1份；可接受標準對照液中待測溶劑峰的峰面積與0h相比應在0.90~1.10之間。需報告內容各時間點主峰峰面積及與0h的比值。氣相色譜法，溶液穩(wěn)定性測試可不考慮色譜條件的影響溶液配制對照液，1份；（方法開發(fā)時應考慮供試液）色譜條件色譜柱初始溫度；頂空瓶加熱溫度；載氣流速；色譜柱批號；頂空瓶平衡時間。注：可根據(jù)實際情況考察對色譜耐用性影響較大的因素，如頂空的進樣時間及加樣時間?？山邮軜藴释到y(tǒng)適應性項下的可接受標準。注：在RSD符合要求的情況下，可減少為3針。需報告內容同系統(tǒng)適應性項下各報告內容。2728含量（酸堿滴定）四空白校正2.滴定曲線的繪制3.精密度線性與范圍溶液穩(wěn)定性281.空白校正溶液配制空白溶液，2份可接受標準空白消耗體積不能超過0.10mL，約相當于樣品消耗滴定體積的1%（根據(jù)具體情況而定）。需報告內容空白溶液消耗的體積空白溶液校正時檢驗操作程序的必要步驟，不是驗證項目。而且驗證也沒有意義，每次操作，空白都會不同。當然，可以從