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4-3

同步熒光光譜法(SynchronousFluorescence)1精選ppt一、同步熒光分析原理同步熒光技術(shù)是同時(shí)掃描激發(fā)單色器和發(fā)射單色器波長(zhǎng)的情況下來(lái)測(cè)繪熒光光譜圖。由測(cè)得的熒光強(qiáng)度信號(hào)對(duì)發(fā)射或激發(fā)波長(zhǎng)作圖,稱為同步熒光光譜。2精選pptSYNCHR.EX.SCANNOR.EM.SCANNOR.EX.SANNOFLUORESCATTERLINE/nmnm3精選ppt1、固定波長(zhǎng)的同步熒光光譜(Constantwavelengthsynchronousluminescence,CWSL)(1)在同步掃描中,使激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)保持固定的波長(zhǎng)間距,即常數(shù)。將同步熒光信號(hào)對(duì)發(fā)射或激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)繪熒光光譜圖,則為固定波長(zhǎng)的同步熒光光譜。4精選ppt(2)定量依據(jù)激發(fā)光譜強(qiáng)度分布發(fā)射光譜強(qiáng)度分布(2)同步掃描激發(fā)波長(zhǎng)時(shí)的發(fā)射光譜(3)同步掃描發(fā)射波長(zhǎng)時(shí)的激發(fā)光譜(2)(3)(1)5精選ppt(3)同步熒光光譜的特點(diǎn)

a.同步光譜與激發(fā)光譜及發(fā)射光譜都有關(guān)系。它同時(shí)利用了化合物的吸收特性和發(fā)射特性,因而使光譜分析的選擇性得到改善。b.有利于多組分混合物的分析。同步熒光光譜可以把強(qiáng)帶增強(qiáng)而減小弱帶的干擾。c.可消除Raylei干擾,使Roman強(qiáng)度降低且拉寬。6精選ppt(4)的選擇只有當(dāng)恰好相當(dāng)于某吸收帶和其發(fā)射帶之間波長(zhǎng)間距時(shí),才能觀察到同步信號(hào)。

=斯托克斯位移(發(fā)射波長(zhǎng)與激發(fā)波長(zhǎng)之差)

與狹縫寬度d的大致原則:只受瑞利:當(dāng)同時(shí)受瑞利和拉曼散射干擾

—測(cè)定波—拉曼散射光的波長(zhǎng)7精選ppt

2、固定能量的同步熒光光譜constantenergysynchronousluminescence(CESL)固定能量的同步熒光光譜,是指在同步掃描過程中,使激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)之間保持著固定的能量差。RayRoman8精選ppt常數(shù)表示波數(shù)差與

成正比拉曼光與入射光之間的頻率差稱為拉曼位移9精選ppt當(dāng)或時(shí)固定能量的同步熒光光譜可消除瑞利散射和拉曼散射,而固定波長(zhǎng)的同步熒光光譜只能消除瑞利散射,使拉曼散射拉寬。二者皆能降低光譜的復(fù)雜性,提高選擇性。abcF10精選ppt二、同步掃描儀器設(shè)備1、固定波長(zhǎng)的熒光光譜的獲得

對(duì)于以光柵為單色器的熒光分光光度計(jì),只要分別設(shè)置激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)單色器所需的起始波長(zhǎng),并使它們以同樣的速率進(jìn)行掃描,便可進(jìn)行固定波長(zhǎng)同步掃描熒光測(cè)定。2、固定能量同步掃描是非線性的可變角同步掃描,需通過微處理機(jī)控制而加以實(shí)現(xiàn)。11精選ppt三、應(yīng)用1、在多環(huán)芳烴分析中的應(yīng)用減小光譜的重疊(1)固定波長(zhǎng)同步熒光法用于煤中多環(huán)芳烴的測(cè)定

苊(Ace),2,3-苯并芴(BF),蒽(Ant),苯并芘(Bap),苝(Per)用標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算2,3-苯并芴(2)低溫固定能量同步熒光法12精選ppt煤液化樣品中各種有機(jī)物的同步熒光光譜煤液化樣品的固定波長(zhǎng)同步熒光光譜13精選ppt2、同步熒光法在醫(yī)藥檢驗(yàn)方面的應(yīng)用(1)違禁藥品中苯丙胺和嗎啡加奎寧麥角酸二乙酰胺的測(cè)定(2)二苯并呋喃中痕量咔唑和蒽14精選ppt(3)酪氨酸和色氨酸嚴(yán)重重疊CWSL的同步熒光色氨酸的光譜特征的同步熒光酪氨酸的光譜特征

or70nm的二階導(dǎo)數(shù)同步熒光可對(duì)Trp和Tyr分辨同步熒光可對(duì)Trp、Tyr、Phe分辨15精選ppt(4)維生素B1、B2混合物中維生素B1的測(cè)定用鐵氰化鉀將B1氧化硫胺熒(5)尿液中腎上腺素和去甲腎上腺素的同時(shí)測(cè)定16精選ppt總結(jié):熒光測(cè)量穩(wěn)態(tài)測(cè)量時(shí)間依賴的測(cè)量17精選ppt

4-4時(shí)間分辨熒光法(Time–DomainFluorometry)(Time–ResolvedFluorometry)18精選ppt一、時(shí)間分辨法原理用短脈沖光源激發(fā)的熒光體群體,隨時(shí)間而衰變,其衰變率為受激分子的壽命19精選ppt用F(t)或N(t)對(duì)t作圖1/eF(t)orN(t)tort熒光壽命為熒光強(qiáng)度衰變到初始值的1/e所需要的時(shí)間。20精選ppt特點(diǎn):采用適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光源和檢測(cè)體系,可以得到在固定波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度—時(shí)間曲線和在固定時(shí)間的熒光發(fā)射光譜。(1)可以對(duì)混合物中光譜重疊但壽命差異的組分進(jìn)行分辨;(2)可消除雜質(zhì)與背景熒光;(3)可測(cè)量溶劑松弛的時(shí)間。21精選ppt二、時(shí)間分辨儀器設(shè)備激發(fā)光源、時(shí)間延遲設(shè)備、激發(fā)單色器、樣品池、熒光單色器及設(shè)有門控的檢測(cè)器1、激發(fā)光源短脈沖的激發(fā)光源閃光燈氮閃光燈幾條高強(qiáng)度射線氫閃光燈氘閃光燈連續(xù)線強(qiáng)度低22精選ppt激光器氮分子激光器337.1nm氬離子激光器351nm染料激光器所需波長(zhǎng)光子通量大、峰值功率高、單色性好、發(fā)生的光脈沖持續(xù)時(shí)間短,激光熒光法具有較高的靈敏度和選擇性。23精選ppt2、檢測(cè)器如光電倍增管帶有門控的24精選ppt三、時(shí)間分辨熒光的分析應(yīng)用熒光體的熒光壽命的測(cè)定時(shí)間分辨熒光光譜熒光發(fā)射的衰變曲線25精選ppt1、熒光體混合物中兩組分的同時(shí)測(cè)定例用8-羥基喹啉-5-磺酸(R)同時(shí)測(cè)定Al和Ga15.20ml樣品+1ml0.045%R+

2ml20%NH4Ac(or20%NH4Cl)調(diào)pH至4.5,稀釋至25ml氘燈激發(fā)測(cè)定熒光強(qiáng)度—時(shí)間曲線26精選ppt(1)測(cè)定熒光衰變曲線

Al–RGa–R可利用上述兩個(gè)熒光化合物的差異對(duì)它們進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。27精選ppt(2)計(jì)算含量鋁配合物和鎵配合物的衰變曲線鋁配合物和鎵配合物的對(duì)數(shù)衰變曲線比較(1)和(4)的熒光強(qiáng)度得Al的含量比較(2)和(5)的熒光強(qiáng)度得Ga的含量28精選ppt2、芳基的測(cè)定例用ps雙色熒光法對(duì)鹵素芳族化合物光離解作用所產(chǎn)生的芳基進(jìn)行檢測(cè)(1)用25ps,266nm激光脈沖使1-(氯甲基)萘,1-(溴甲基)萘,2-(氯甲基)萘,2-(溴甲基)萘等化合物離解產(chǎn)生芳基。(2)在延遲60ps后,用25ps,355nm激光脈沖激發(fā)芳基的熒光,產(chǎn)生橙色熒光,600nm,

10ns,如圖所示。29精選ppt(a)和(c)一致,是1-萘甲基所致(b)和(d)一致,是2-萘甲基所致30精選ppt3、溶劑松弛時(shí)間的分辨測(cè)量許多分子在基態(tài)時(shí)具有從中等到大的偶極矩,在激發(fā)態(tài)時(shí)偶極矩發(fā)生變化,從而引起周圍溶劑分子中電子的重排和溶劑分子圍繞激發(fā)態(tài)溶質(zhì)分子偶極的重新定向,這個(gè)過程稱為溶劑松弛,這個(gè)過程所需的時(shí)間叫溶劑松弛時(shí)間。在松弛過程中,能量有所降低,因而發(fā)射向長(zhǎng)波位移。時(shí)間分辨熒光法可記錄不同時(shí)間的發(fā)射光譜,因而可測(cè)量松弛時(shí)間。31精選ppt例14-氨基苯鄰二酰亞胺(4-AP)的丙醇溶液在不同的溫度下的時(shí)間分辨的熒光光譜圖室溫下,-132℃熒光光譜與時(shí)間t無(wú)關(guān)在-77K,熒光光譜與t有關(guān)在4ns,溶劑還未重新取向在23ns,溶劑取向已完成32精選ppt例22-對(duì)-苯甲基萘-6-磺酸鹽染料溶劑甘油溫度A圖4℃1.8ns,8.0ns,12.2nsB圖57℃1.8ns,8.0ns,12.2ns33精選ppt

4-5相分辨熒光法(Frequency-DomainFluorometry/Phase-ModulationFluorometry)34精選ppt

Theobjectiveofbothtime-domainandfrequency-domainfluorometryistorecovertheparameterdescribingthetime-resolveddecay.35精選ppt

一、相分辨法原理1、單指數(shù)衰變的熒光當(dāng)樣品被激發(fā)光激發(fā)而發(fā)射熒光時(shí),如激發(fā)光的光強(qiáng)度被正弦調(diào)制,其角調(diào)制頻率為,則發(fā)射光也同樣被調(diào)制。由于吸收和發(fā)射之間的時(shí)間延遲,調(diào)制的發(fā)射光比起激發(fā)光在相上延遲了角。但發(fā)射光的調(diào)制比起激發(fā)光的調(diào)制小一些,也即是發(fā)射光的改變部分的相對(duì)幅度比起激發(fā)光要小些。36精選ppt—去調(diào)制因素激發(fā)光和發(fā)射光的光強(qiáng)正弦調(diào)制37精選ppt在測(cè)量相角()或去調(diào)制因素(m)之后,可以計(jì)算該熒光體的熒光壽命。相分辨法是熒光壽命的測(cè)量方法之一。38精選pptm10MHz30MHz10MHz30MHz、m與的關(guān)系如下:39精選pptm隨的增大而下降m=1發(fā)射光與激發(fā)光的調(diào)制幅度相同m越小發(fā)射光被調(diào)制的幅度越小隨的增大而增大,壽命越長(zhǎng),延遲的越大。當(dāng)熒光分子的壽命越長(zhǎng),發(fā)射相對(duì)于激發(fā)延遲的時(shí)間就越長(zhǎng)。40精選ppt2、多指數(shù)衰變的熒光如果樣品中含有兩種熒光體,或者單一熒光體而進(jìn)行進(jìn)一步激發(fā)態(tài)反應(yīng),則熒光是雙指數(shù)衰變。如果進(jìn)行多步反應(yīng),則熒光是多指數(shù)衰變。

由和m所計(jì)算的是表觀熒光壽命。如采用相靈敏檢測(cè)器的相熒光計(jì),—激發(fā)光的調(diào)制度(或振幅)—去調(diào)制因素單一熒光體41精選ppt對(duì)于相靈敏檢測(cè)器—穩(wěn)態(tài)熒光光譜—檢測(cè)角度在不同相角測(cè)定熒光光譜,稱為相靈敏熒光光譜,即為在固定時(shí)間的熒光光譜。42精選ppt若樣品溶液中含有A、B兩種熒光體,它們的熒光壽命分別為A和B。如,則該組分的發(fā)射被抑制43精選ppt

要得到混合物中組分A的穩(wěn)態(tài)光譜,須把檢測(cè)器相角調(diào)節(jié)至和組分B正交。這是很費(fèi)時(shí)的,最好得到另外的信息:先得到任何一組分的穩(wěn)態(tài)熒光光譜,然后調(diào)節(jié)檢測(cè)器相角至該熒光光譜和混合物的熒光光譜重疊,則可得到與另一組分正交的相角。使用任何一組分的純?nèi)芤阂源_定檢測(cè)器的相角。44精選ppt

當(dāng)用相靈敏檢測(cè)器在各種不同檢測(cè)器相角測(cè)繪樣品的相靈敏熒光光譜。對(duì)于單一化合物,其熒光峰波長(zhǎng)基本上保持不變而與檢測(cè)器相角無(wú)關(guān)。如果不是均勻的發(fā)射,則熒光峰隨著檢測(cè)器相角而改變,在不同檢測(cè)器相角得到的相靈敏光譜是鑒別不均勻發(fā)射的有力工具。45精選ppt3、相分辨熒光法與時(shí)間分辨熒光法比較用于熒光參數(shù)測(cè)量的儀器可分為兩大類穩(wěn)態(tài)測(cè)量steady-state時(shí)間依賴的測(cè)量timedependent相分辨熒光法與時(shí)間分辨熒光法本質(zhì)上都是時(shí)間依賴或時(shí)間分辨的測(cè)量。46精選ppt(1)儀器時(shí)間分辨熒光法的局限性a.儀器常常非常復(fù)雜,常局限于有關(guān)專家使用;b.靈敏度常低于穩(wěn)態(tài)測(cè)量。相分辨法的優(yōu)點(diǎn)a.儀器類似于穩(wěn)態(tài)測(cè)量的儀器,使用簡(jiǎn)單;b.靈敏度高;c.數(shù)據(jù)處理快。47精選ppt(2)測(cè)量參數(shù)

a.F(t)-t曲線時(shí)間分辨b.m..相分辨48精選ppt(3)從實(shí)驗(yàn)的觀點(diǎn),相分辨有下列優(yōu)點(diǎn):在時(shí)間分辨的方法中,測(cè)量的延遲信號(hào)的去卷積對(duì)于計(jì)算測(cè)量系統(tǒng)的限定時(shí)間的響應(yīng)是必要的,而相分辨法不受此限制;相分辨法允許不同方向的直接測(cè)量。如在各向異性的延遲測(cè)量中,平行和垂直偏振成份的和m的測(cè)定;相分辨法為基于熒光壽命差異的光譜成份之直接分辨提供了一種簡(jiǎn)單、有效的方法。49精選ppt二、相分辨儀器設(shè)備

與一般熒光分光光度計(jì)大致相似,但增加了光調(diào)制器及測(cè)量相角和去調(diào)制因素的設(shè)備。50精選ppt1、光調(diào)制器(1)Kerr調(diào)制器不能透射UV(2)Pockels調(diào)制器需要較低電壓,能透過紫外光,可在連續(xù)可變的頻率下操作,但要求高度準(zhǔn)直的光,適用于以激光器為光源的相分辨熒光計(jì)。(3)Dedye-Sears超聲波調(diào)制器能透過紫外光,對(duì)光準(zhǔn)直的要求不太高,可用于各種光源。

51精選ppt2、檢測(cè)系統(tǒng)

由單色器,光電倍增管,鎖定放大器組成。鎖定放大器只檢測(cè)與參比信號(hào)相同頻率且具有一定位相關(guān)系的信號(hào)成份,從而大大提高了信噪比。52精選ppt三、相分辨熒光的分析應(yīng)用1、熒光體兩組分混和物中個(gè)別組分的熒光光譜的直接記錄和熒光壽命的測(cè)定2-對(duì)-甲苯氨基-6-萘磺酸(TNS)和6-丙酰-2-(二甲基氨基)萘(PRODAN)混合物在乙醇溶液中穩(wěn)態(tài)熒光光譜相靈敏熒光光譜調(diào)整DPRODAN被抑制TNS的熒光光譜,=3.6nsTNS被抑制PRODAN的熒光光譜,=11.6ns當(dāng)當(dāng)53精選pptTNS和PRODAN的穩(wěn)態(tài)熒光光譜54精選pptTNS-PRODAN混合物的相靈敏熒光光譜55精選ppt從混合物直接記錄下的TNS和PRODAN的熒光光譜56精選ppt2、溶劑松弛的相分辨在溶劑松弛過程中,一般情況能量有些降低,松弛態(tài)發(fā)射光譜紅移。但降低溫度會(huì)使光譜藍(lán)移。

N-乙酰基-L-色氨酸胺(NATA)solvent:丙稀甘油(1)不同T下的熒光光譜(2)相靈敏熒光光譜在固定D即t下所得到的熒光光譜57精選pptNATA在丙烯甘油中的熒光光譜58精選pptNATA在丙烯甘油中的相靈敏熒光光譜59精選ppt

4-6熒光動(dòng)力學(xué)分析法(FluorescentKineticAnalysis)60精選ppt一、動(dòng)力學(xué)法原理由于化學(xué)反應(yīng)的速率與反應(yīng)物的濃度有關(guān),在某些情況下與催化劑的濃度有關(guān),因此可以通過測(cè)量反應(yīng)的速率以確定待側(cè)物的含量。光度法電位法熒光法測(cè)速率以熒光法監(jiān)測(cè)反應(yīng)速率,這種方法則稱為熒光動(dòng)力學(xué)分析法。61精選pptaA+bBnC+mD=k[A]a[B]ba=1b=1=k[A][B]62精選ppt1、熒光動(dòng)力學(xué)分析的特點(diǎn)(1)優(yōu)點(diǎn)a.只觀測(cè)反應(yīng)初期的速率,可用于某些反應(yīng)速率慢、平衡常數(shù)小或可能發(fā)生副反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng);b.動(dòng)力學(xué)分析是一種相對(duì)測(cè)量,動(dòng)力學(xué)分析法有可能比平衡法具有更好的選擇性;c.靈敏度高、操作較快、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。63精選ppt(2)局限性a.所使用反應(yīng)的半衰期應(yīng)在5ms到1h之間;b.必須嚴(yán)格地控制溫度、pH、試劑濃度、離子強(qiáng)度等反應(yīng)條件和其它可能影響反應(yīng)速率的因素;c.動(dòng)力學(xué)測(cè)量的信噪比在本質(zhì)上要比平衡法小,只有反應(yīng)的一小部分用于測(cè)定;d.試樣基質(zhì)的干擾問題仍可能發(fā)生,如降低有效濃度,與分析物結(jié)合。64精選ppt2、熒光動(dòng)力學(xué)分析法非催化法催化法酶催化法(1)非催化法通過測(cè)量非催化反應(yīng)的速率而測(cè)定某種反應(yīng)物的濃度。65精選ppt(2)催化法以催化反應(yīng)為基礎(chǔ)來(lái)測(cè)定物質(zhì)含量的方法。催化反應(yīng)速率與催化劑的濃度成正比,因此可測(cè)定催化劑的濃度,也可用于測(cè)定某些對(duì)催化反應(yīng)起助催作用或抑制作用的物質(zhì)。例:8-羥基喹啉-5-磺酸+過硫酸銨Ag+66精選ppt(3)酶催化法基于酶催化的反應(yīng),這類反應(yīng)的突出優(yōu)點(diǎn)是它的特效性和高靈敏度,不僅可用來(lái)測(cè)定酶的活性,也可用來(lái)測(cè)定底物、活化劑和抑制劑.67精選ppt3、反應(yīng)速率的熒光法監(jiān)測(cè)假如化學(xué)反應(yīng)的某種反應(yīng)物或產(chǎn)物是熒光物質(zhì),便可利用熒光法來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)的速率。記F-t曲線可通過正切法(斜率法)或固定時(shí)間法或固定熒光強(qiáng)度法獲得校正曲線。68精選ppt(1)正切法從F-t曲線求反應(yīng)速率然后用作圖c69精選ppt(2)固定時(shí)間法使反應(yīng)準(zhǔn)確地進(jìn)行到某一固定的時(shí)刻t,立即測(cè)定F,得到F-c曲線cF70精選ppt(3)固定熒光強(qiáng)度法測(cè)量熒光強(qiáng)度的變化值達(dá)到某一規(guī)定值所需的時(shí)間t,得到1/t-c曲線。c1/t71精選ppt熒光動(dòng)力學(xué)分析法的優(yōu)點(diǎn):靈敏度高、選擇性好、線性范圍寬缺點(diǎn):a

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