選修3基因工程

回憶：（1）生物的主要遺傳物質(zhì)是什么？（2）DNA的空間結(jié)構(gòu)和基本組成單位是什么？（3）你還能畫出四種脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)簡式嗎？（4）一條鏈上的脫氧核苷酸相互連接是通過什么來完成的？（5）基因控制蛋白質(zhì)的合成過程。（6）中心法則的圖解。定向基因改造設(shè)想設(shè)想一能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？設(shè)想二能否讓微生物產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？設(shè)想三經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術(shù)——基因工程。選修3現(xiàn)代生物科技專題基因工程欽州二中高中生物備課組段敏一、基因工程的基本內(nèi)容：基因工程的概念：原理基因重組操作環(huán)境生物體外操作對象基因（DNA）操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)結(jié)果優(yōu)點①打破生殖隔離②定向改造生物③時間短人類需要的基因產(chǎn)物基因工程的理論基礎(chǔ)：剪切熒光蛋白基因水母培育轉(zhuǎn)基因熒光斑馬魚的過程是怎樣的呢？普通斑馬魚拼接導(dǎo)入熒光斑馬魚表達(dá)“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“分子運輸車”限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體二、基因工程的基本操作工具：（1）分布：主要在微生物中。

（2）限制性內(nèi)切酶的特性：一種限制性內(nèi)切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列，并且能在特定的切點切割DNA分子。（3）舉例：大腸桿菌的一種限制酶（EcoRⅠ)能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開；SmaⅠ能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切割。１、基因的手術(shù)刀──限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶）①識別回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與互補鏈反向讀的順序完全一致。CGAATTATAGTC磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵EcoRⅠEcoRⅠ②作用的部位：磷酸二酯鍵

思考：結(jié)果產(chǎn)生幾個切口？產(chǎn)生幾個末端？會產(chǎn)生黏性末端或平末端③作用的結(jié)果：錯位切平切拓展補充：獲取一個目的基因需限制酶剪切

次，共產(chǎn)生

個黏性末端或平末端。兩4練習(xí)使用EcoRI剪切目的基因CTTCATGAATTCCCTAA

GAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAGCTTCATGAATTCCCTAA

GAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG

目的基因黏性末端主要來源種類

特點結(jié)果主要從原核生物中分離（約4000種）專一性

切割磷酸二酯鍵，一個切口產(chǎn)生兩個黏性末端或兩個平末端。

EcoRⅠ黏性末端（識別GAATTC序列）SmaⅠ平末端（識別CCCGGG序列）錯位切平切（舉例）小結(jié)：２、基因的縫合針──DNA連接酶類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別作用結(jié)果作用部位形成單鏈DNA分子堿基對間的氫鍵DNA分子形成新的DNA分子（形成）磷酸二酯鍵游離脫氧核苷酸形成重組DNA分子（形成）磷酸二酯鍵DNA分子片段形成黏性末端或平末端（斷開）磷酸二酯鍵DNA分子作用底物解旋酶DNA聚合酶DNA連接酶限制酶比較項目幾種酶的比較：3、基因的運輸車——載體將外源基因送入受體細(xì)胞①作用：②具備的條件：能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定地保存具有多個限制酶切點具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選③種類：（抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。）質(zhì)粒、動植物病毒、λ噬菌體衍生物質(zhì)粒：細(xì)菌或酵母菌等生物細(xì)胞中，是擬核或細(xì)胞核外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子質(zhì)粒---最常用的載體最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒判斷：質(zhì)粒只存在于原核細(xì)胞中？小結(jié)限制酶DNA連接酶載體來源特點結(jié)果作用種類特點種類特點條件DNA重組技術(shù)的基本工具1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定三、基因操作的基本操作程序舉例：與生物抗逆性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因，以及與工業(yè)所需用酶相關(guān)的基因等，也可以是具有一些調(diào)控作用的因子。第一步：目的基因的獲取目的基因：主要是指編碼特定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。補充：基因的結(jié)構(gòu)1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)：2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)：1.直接從自然界中已有的物種中分離出來供體生物細(xì)胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。2、從基因文庫中獲取目的基因1）基因組文庫2）部分基因文庫用適當(dāng)限制酶切割與載體連接導(dǎo)入受體菌群提取某生物全部DNA許多DNA片段該生物基因組文庫例如：cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成與載體連接導(dǎo)入受體菌群該生物cDNA文庫互補DNA雙鏈DNA(目的基因)逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶mRNADNA雙鏈復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列原理：前提：PCR：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)3、利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR擴增儀1.四種脫氧核苷酸2.DNA的兩條模板鏈3.熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）4.一對引物條件：過程：目的基因DNA受熱(90℃-95℃)變性后解鏈成單鏈；2.引物與單鏈互補結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。4.人工合成法蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學(xué)合成③化學(xué)合成法：適用范圍：已知核苷酸序列，基因的核苷酸數(shù)量較少。①DNA合成儀合成：利用合成儀按照人們預(yù)先設(shè)定的DNA序列,從無到有,從頭合成②反轉(zhuǎn)錄法：（cDNA文庫）小結(jié)：目的基因的獲取1.獲取目的基因的常用方法從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴增人工合成PCR技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結(jié)果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制(PCR擴增儀內(nèi))主要在細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）大量的DNA片段形成整個DNA分子解旋酶、普通的DNA聚合酶等人工合成法：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學(xué)合成③化學(xué)合成法：適用范圍：已知核苷酸序列，基因的核苷酸數(shù)量較少。①DNA合成儀合成：利用合成儀按照人們預(yù)先設(shè)定的DNA序列,從無到有,從頭合成②反轉(zhuǎn)錄法：（cDNA文庫）①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代②使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用1、基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的？（P11）第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心

思考：一定數(shù)量的目的基因與載體混合后，加入DNA連接酶，兩兩連接的重組DNA有幾種？（含有目的基因）（載體）環(huán)狀啟動子：一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位。終止子：位于基因的尾端，也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來。標(biāo)記基因：為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來?；虮磉_(dá)載體的組成：目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因①目的基因②啟動子③終止子④標(biāo)記基因啟動子(DNA片段)≠起始密碼子(RNA);終止子(DNA片段)≠終止密碼子(RNA)。第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞思考1：常用的受體細(xì)胞有哪些？動物、植物、微生物。思考2：什么叫轉(zhuǎn)化？目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：常用于雙子葉植物和裸子植物1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞兩次拼接？兩次導(dǎo)入？組織培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)點：經(jīng)濟(jì)有效（3）花粉管通道法（2）基因槍法缺點：成本較高受體細(xì)胞(單子葉植物)我國科學(xué)家獨創(chuàng)，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉方法：顯微注射技術(shù)（最常用，最有效）受體細(xì)胞：常用受精卵過程：目的基因的表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵發(fā)育新性狀動物2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞：3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞2.微生物作受體細(xì)胞原因：3.轉(zhuǎn)化方法：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少1.常用菌：大腸桿菌等。Ca2+處理受體細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子用Ca2＋處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性思考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)胞？受體生物植物動物微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精卵體細(xì)胞受精卵細(xì)胞/個體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞小結(jié)：第四步：目的基因的檢測與鑒定1、導(dǎo)入檢測（1）目的：檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因（2）方法：DNA分子雜交技術(shù)（3）原理：互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進(jìn)行雜交。這種結(jié)合是嚴(yán)格按照堿基互補配對進(jìn)行。因此，當(dāng)用一段已知基因的核苷酸序列作為探針，與被測基因進(jìn)行接觸，若兩者的堿基完全配對成雙鏈，則表明被測基因中含有已知的基因序列。(4)基因探針:含目的基因的DNA片段用放射性同位素、熒光等作標(biāo)記,以此做探針。GTACAGCGTA基因探針15N15N14N探針轉(zhuǎn)基因生物的DNA變性變性14NGACATAGCTACA轉(zhuǎn)基因生物的DNACTGTATCGATGTGTACAGCGTA基因探針雜交判斷過程：使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中CGTCATGTCGCATGCT轉(zhuǎn)基因生物的DNAGCAGTACAGCGTACGAGTACAGCGTA基因探針2、轉(zhuǎn)錄檢測（1）目的：檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA（2）方法：分子雜交技術(shù)（3）雜交的對象：從轉(zhuǎn)基因生物中提取的mRNA.3、翻譯檢測（1）目的：檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)（2）方法：抗原抗體雜交技術(shù)從轉(zhuǎn)基因生物中提取的蛋白質(zhì)抗原：抗體：將目的基因編碼的蛋白質(zhì)注射進(jìn)動物體內(nèi)進(jìn)行免疫產(chǎn)生的相應(yīng)抗體4.個體生物學(xué)水平鑒定抗蟲、抗病接種實驗，活性比較等分子水平檢測個體水平鑒定：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)DNA分子雜交分子雜交抗原-抗體雜交如：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等④檢測鑒定重組性狀的表達(dá)小結(jié)：人體細(xì)胞質(zhì)粒大腸桿菌目的基因(人胰島素基因)用同一種限制酶進(jìn)行酶切DNA連接酶連接目的基因和質(zhì)粒重組質(zhì)粒(重組DNA)重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞繁殖人胰島素復(fù)制目的基因獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因利用PCR技術(shù)擴增目的基因化學(xué)方法人工合成目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞植物、動物、微生物目的基因的檢測與鑒定檢測：分子水平是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：個體水平小節(jié):基因工程的基本操作程序基因工程的基本工具？限制酶的特點？DNA連接酶和載體的種類？基因工程的基本操作程序？獲取目的基因的方法？基因工程的核心步