間接熒光法測水果的抗氧化活性

羅丹明6G-Mn2+-H2O2體系熒光分光光度法測定水果的抗氧化活性1前言羥自由基(?0H)是活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基。它可以通過電子轉(zhuǎn)移、加成以及脫氫等方式與生物體內(nèi)的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和脂類等物質(zhì)的氧化性損傷，使細(xì)胞壞死或突變。羥自由基還與衰老、腫瘤、輻射損傷和細(xì)胞吞噬有關(guān)。對(duì)機(jī)體適當(dāng)補(bǔ)充外源性抗氧化劑或給予能促使機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)恢復(fù)到一定水平的藥物，可改善這些狀況。由于長期使用化學(xué)合成的抗氧化劑對(duì)人體有一定的副作用，所以，尋找天然、安全、無毒的抗氧化劑就越來越受到人們的重視。對(duì)羥自由基的研究有許多，例如：熒光法研究高粱紅色素清除羥自由基活性，為高粱紅色素的合理開發(fā)和利用提供了一定的參考依據(jù)；羅丹明6G-Co2+-H2O2體系熒光法測定常見蔬菜的抗氧化活性，測定了14種常見的蔬菜的抗氧化活性，其中菠菜、油菜、韭菜、香菜、雪里蕻5種綠葉蔬菜的抗氧化活性較強(qiáng)；目前，離體檢測羥自由基的方法主要有電子自旋共振(ESR)法⑴、化學(xué)發(fā)光法［2］、光度法⑶及熒光法⑷，這些方法多是用傳統(tǒng)的Fe2+-H2O2體系產(chǎn)生羥自由基，或Cu+、C02+、代替Fe2+［5、6］使靈敏度提高，對(duì)水果抗氧化活性的研究已有報(bào)道［7】。本文采用同步熒光法⑻和普通熒光法繪制熒光譜圖，進(jìn)行譜圖比較，根據(jù)前人做過的試驗(yàn)預(yù)測采用同步熒光法比普通熒光法的靈敏度高，有效減少光譜干擾，用羅丹明6G作指示劑，在Mn2+-H2O2體系產(chǎn)生羥自由基(?0H)，測定水果的抗氧化活性。從常見水果中尋找抗氧化劑，充分利用豐富的水果資源，具有實(shí)際意義。2測定原理傳統(tǒng)的Fenton反應(yīng)是用Fe2+-H2O2體系產(chǎn)生羥自由基。本文研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+亦可與也02作用，類似Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，產(chǎn)率比FeSO4還要高，其反應(yīng)原理可類推如下：Mn2++H2O2fMn(III)+?OH+OH-Mn(III)十H2O2—Mn(IV)+?OH+OH-然后，利用羥自由基迅速氧化羅丹明6G，使羅丹明6G的熒光強(qiáng)度顯著降低，降低程度隨羥自由基的增加而加大，從而間接測定羥自由基的產(chǎn)生量。而水果提取物可以部分清除溶液中的羥自由基，從而使其熒光碎滅程度減弱，據(jù)此可以測定水果抗氧化性。3實(shí)驗(yàn)部分

3.1主要儀器與試劑3.1.1主要儀器WGY-10型分子熒光分光光度計(jì)WGY-10型分子熒光分光光度計(jì)SQ2119多功能食品加工機(jī)TD4臺(tái)式離心機(jī)電子分析天平PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)3.1.2主要試劑MnSO4?H2O（含量不少于99%）抗壞血酸（含量不少于99.7%）H2O2（含量不少于30%）羅丹明6G氯化銨（含量不少于99.5%）氨水（含量不少于25%-28%）所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。3.2儲(chǔ)備液的配制天津港東科技發(fā)展有限公司上海帥佳電子科技有限公司湖南儀器表總廠離心機(jī)長梅特勒-托利多儀器上海有限公司上海精密科學(xué)儀器有限公司天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠天津市福晨化學(xué)試劑廠天津市凱通化學(xué)試劑有限公司天津市津科精細(xì)化工研究所天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠天津市贏達(dá)希貴化學(xué)試劑廠500mL干燥的小燒杯若干，1L容量瓶1只，100mL容量瓶3只，1000mL的容量瓶，塑料瓶,500mL容量瓶兩只，50mL容量瓶5只，10mL容量瓶20只。2mL移液管4只，貼上標(biāo)簽（羅丹明6G，Mn2+,H2O2，buffer。），100ml量桶（H2O2）,10mL移液管3只（緩沖）3.2.1硫酸錳儲(chǔ)備液的配制準(zhǔn)確稱取MnSO4?H2O0.3397g，在小燒杯中用少量水溶解轉(zhuǎn)移100mL容量瓶中定容，配制成20mmol/L溶液作為儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)所用的濃度是2mmol/L，移取10mL20mmol/L儲(chǔ)備液于100mL的容量瓶中定容至刻度。3.2.2羅丹明6G儲(chǔ)備液的配制準(zhǔn)確稱取羅丹明6G0.01g，在小燒杯中溶解，轉(zhuǎn)移定容在1000mL的容量瓶中，配成1x10-2g/L的儲(chǔ)備液。3.2.31%雙氧水儲(chǔ)備液的配制準(zhǔn)確移取30%H2O23mL于聚乙烯的塑料瓶中，再加87mL的蒸餾水。3.2.4氨水儲(chǔ)備液的配制準(zhǔn)確移取3.33mL濃氨水，稀釋至500mL的容量瓶中，定容至刻度，配制成0.1mol/LNH3?H2O的儲(chǔ)備液。3.2.5氯化銨儲(chǔ)備液的配制準(zhǔn)確稱取2.6855g氯化銨，在小燒杯中用少量水溶解，轉(zhuǎn)移定容在500mL的容量瓶中,配制成0.1004mol/LNH4Cl的儲(chǔ)備液。3.2.6根據(jù)化學(xué)手冊(cè)配制成不同pH值0.1mol/LNH?H0-0.1004mol/LNHCl的緩沖溶液：3 2 4NH4C1V/mL3232302515nh3?h2oV/mL14152530pH8.08.589.19.59.810mL移液管，配于50mL容量瓶中，注意不要定容！3.2.7抗壞血酸儲(chǔ)備液的配制準(zhǔn)確稱取抗壞血酸0.3523g,在小燒杯中用少量水溶解，轉(zhuǎn)移定容在100mL的容量瓶中，得到20mmol/L的儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)時(shí)，移取2.5mL20mmol/L的抗壞血酸，轉(zhuǎn)移定容在100mL的容量瓶中得到0.5mmol/L的抗壞血酸。3.3實(shí)驗(yàn)方法3.3.1羥自由基的測定在10mL容量瓶中，pH9.5的緩沖溶液1.0mL，加入1X10-2g/L的羅丹明6G1.6mL，2.0mmol/L的Mn2+溶液1mL,1%的H202溶液0.8mL,加蒸餾水至刻度，混勻。測定542nm波長處的熒光強(qiáng)度F，計(jì)算其與空白參比(羅丹明6G與緩沖液)熒光強(qiáng)度F0之差△F，通過測定?OH形成前后羅丹明6G的熒光強(qiáng)度變化，來反映?OH的產(chǎn)生量。3.3.2羥自由基清除率的測定在上述體系中加入一定量的羥自由基清除劑，同樣操作側(cè)定熒光強(qiáng)度Fs；羅丹明6G和緩沖溶液作為空白體系，其熒光強(qiáng)度為F。，未加清除劑的體系，其熒光強(qiáng)度為F，則清除率=(Fs-F)/(F0-F)x100%3.3.3水果水提取物清除?OH的作用新鮮水果洗凈，晾干，準(zhǔn)確稱取40g，加入200mL蒸餾水，勻漿3min，過濾，離心5min，取上層清液0.6mL按上述方法進(jìn)行測定。4結(jié)果與討論4.1.熒光光譜羅丹明6G本身能產(chǎn)生特征熒光，其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為350nm和542nm,發(fā)射譜-350.0發(fā)射厝-350.0圖1同步熒光分光光度法測得的熒光光譜1、 羅丹明6G+緩沖溶液2、 羅丹明6G+緩沖溶液+Mn2++H2O2+水果提取物3、 羅丹明6G+緩沖溶液+Mn2++H2O24.2實(shí)驗(yàn)參數(shù)工作模式：發(fā)射掃描 掃描間隔：2nm激發(fā)狹縫：6nm 發(fā)射狹縫：6nm負(fù)高壓：130V4.3實(shí)驗(yàn)條件實(shí)驗(yàn)條件對(duì)羥自由基的產(chǎn)生有影響，也對(duì)抗氧化劑對(duì)羥自由基的清除率有影響，應(yīng)綜合考慮這兩方面的因素，選擇適宜的測定條件。4.3.1酸度的影響空白和羥自由基體系的AF受pH值的影響如圖2所示?？梢钥闯觯?一范圍內(nèi)，AF有較大值，故選用弱堿性介質(zhì)pH 的緩沖溶液。（注意溶液加入順序）序號(hào)①②③④⑤緩沖各1mL(pH=)8.08.589.19.59.8羅丹明6G(1X10-2g/L)11111/mLMn2+(2.0mmol/L)/mL11111H2O2(1%)/mL0.80.80.80.80.8

4.3.2羅丹明6G的用量加入不同體積1XIO-2g/L羅丹明6G溶液，按試驗(yàn)方法測定空白體系和?OH體系的△F,如圖3所示，結(jié)果表明羅丹明6G用量為 mL。①②③④⑤緩沖(pH=y)/mL11111羅丹明6G(1X10-2g/L)0.60.811.41.6/mLMn2+(2.0mmol/L)/mL11111H2O2(1%)/mL0.80.80.80.80.81'2'3'4'5'緩沖(pH=y)/mL11111羅丹明6G(1X10-2g/L)/mL0.60.811.41.64.3.3硫酸錳的用量按實(shí)驗(yàn)方法加入不同體積2mmol/L的MnSO4溶液，測定熒光強(qiáng)度，選用MnSO4溶液為 mL。①②③④⑤緩沖(pH=y)/mL11111羅丹明6G(1X10-2g/L)1.61.61.61.61.6/mLMn2+(2.0mmol/L)/mL0.811.21.62H2O2(1%)/mL0.80.80.80.80.8

緩沖(pH=y)/mL1羅丹明6G(1XIO-2g/L)1.6/mL4.3.4過氧化氫的用量用不同體積1%的h2o2按試驗(yàn)方法測定熒光強(qiáng)度，本實(shí)驗(yàn)選用h2o2溶液①②③④⑤緩沖(pH=y)/mL11111羅丹明6G(1X10-2g/L)1.61.61.61.61.6/mLMn2+(2.0mmol/L)/mL22222H2O2(1%)/mL0.30.50.81.01.41'緩沖(pH=y)/mL1羅丹明6G(1X10-2g/L)1.6/mL4.5抗氧化劑清除羥自由基作用的測定于體系中加入抗壞血酸，按試驗(yàn)方法測定空白體系的F0，?OH體系的F,加清除劑體系的Fs。熒光強(qiáng)度變化如圖1所示，結(jié)果表明，隨抗壞血酸用量增加，清除率加大。說明本體系中抗壞血酸與?OH的清除作用有明顯的量效關(guān)系。4.6水果的抗氧化作用測定了3種新鮮水果的水提取物對(duì)?OH的清除率，結(jié)果見表2。從表中看出，具有較強(qiáng)的清除?OH的功能。F0=7O.1 F=26.7表2各種水果的清除率水果Fs清除率（％西紅柿64.787.56梨27.51.84橙子55.967.285結(jié)果討論從這次實(shí)驗(yàn)中可以看出水果盤蔬菜中含有大量天然抗氧化劑、且提取率高、抗氧化活性強(qiáng)，其與機(jī)體親和力強(qiáng)和安全性高等優(yōu)點(diǎn)具有取代合成抗氧化劑趨勢(shì)，是今后的研究重點(diǎn)。另外，天然抗氧化劑尚需在有效成分的抗氧化機(jī)理