間接熒光法測水果的抗氧化活性

羅丹明6G-Mn2+-H2O2體系熒光分光光度法測定水果的抗氧化活性1前言羥自由基(?0H)是活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基。它可以通過電子轉移、加成以及脫氫等方式與生物體內的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、蛋白質、核酸和脂類等物質的氧化性損傷，使細胞壞死或突變。羥自由基還與衰老、腫瘤、輻射損傷和細胞吞噬有關。對機體適當補充外源性抗氧化劑或給予能促使機體內源性物質恢復到一定水平的藥物，可改善這些狀況。由于長期使用化學合成的抗氧化劑對人體有一定的副作用，所以，尋找天然、安全、無毒的抗氧化劑就越來越受到人們的重視。對羥自由基的研究有許多，例如：熒光法研究高粱紅色素清除羥自由基活性，為高粱紅色素的合理開發(fā)和利用提供了一定的參考依據(jù)；羅丹明6G-Co2+-H2O2體系熒光法測定常見蔬菜的抗氧化活性，測定了14種常見的蔬菜的抗氧化活性，其中菠菜、油菜、韭菜、香菜、雪里蕻5種綠葉蔬菜的抗氧化活性較強；目前，離體檢測羥自由基的方法主要有電子自旋共振(ESR)法⑴、化學發(fā)光法［2］、光度法⑶及熒光法⑷，這些方法多是用傳統(tǒng)的Fe2+-H2O2體系產(chǎn)生羥自由基，或Cu+、C02+、代替Fe2+［5、6］使靈敏度提高，對水果抗氧化活性的研究已有報道［7】。本文采用同步熒光法⑻和普通熒光法繪制熒光譜圖，進行譜圖比較，根據(jù)前人做過的試驗預測采用同步熒光法比普通熒光法的靈敏度高，有效減少光譜干擾，用羅丹明6G作指示劑，在Mn2+-H2O2體系產(chǎn)生羥自由基(?0H)，測定水果的抗氧化活性。從常見水果中尋找抗氧化劑，充分利用豐富的水果資源，具有實際意義。2測定原理傳統(tǒng)的Fenton反應是用Fe2+-H2O2體系產(chǎn)生羥自由基。本文研究發(fā)現(xiàn)，Mn2+亦可與也02作用，類似Fenton反應產(chǎn)生羥自由基，產(chǎn)率比FeSO4還要高，其反應原理可類推如下：Mn2++H2O2fMn(III)+?OH+OH-Mn(III)十H2O2—Mn(IV)+?OH+OH-然后，利用羥自由基迅速氧化羅丹明6G，使羅丹明6G的熒光強度顯著降低，降低程度隨羥自由基的增加而加大，從而間接測定羥自由基的產(chǎn)生量。而水果提取物可以部分清除溶液中的羥自由基，從而使其熒光碎滅程度減弱，據(jù)此可以測定水果抗氧化性。3實驗部分

3.1主要儀器與試劑3.1.1主要儀器WGY-10型分子熒光分光光度計WGY-10型分子熒光分光光度計SQ2119多功能食品加工機TD4臺式離心機電子分析天平PHSJ-3F實驗室pH計3.1.2主要試劑MnSO4?H2O（含量不少于99%）抗壞血酸（含量不少于99.7%）H2O2（含量不少于30%）羅丹明6G氯化銨（含量不少于99.5%）氨水（含量不少于25%-28%）所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。3.2儲備液的配制天津港東科技發(fā)展有限公司上海帥佳電子科技有限公司湖南儀器表總廠離心機長梅特勒-托利多儀器上海有限公司上海精密科學儀器有限公司天津市北方天醫(yī)化學試劑廠天津市福晨化學試劑廠天津市凱通化學試劑有限公司天津市津科精細化工研究所天津市津東天正精細化學試劑廠天津市贏達希貴化學試劑廠500mL干燥的小燒杯若干，1L容量瓶1只，100mL容量瓶3只，1000mL的容量瓶，塑料瓶,500mL容量瓶兩只，50mL容量瓶5只，10mL容量瓶20只。2mL移液管4只，貼上標簽（羅丹明6G，Mn2+,H2O2，buffer。），100ml量桶（H2O2）,10mL移液管3只（緩沖）3.2.1硫酸錳儲備液的配制準確稱取MnSO4?H2O0.3397g，在小燒杯中用少量水溶解轉移100mL容量瓶中定容，配制成20mmol/L溶液作為儲備液。實驗所用的濃度是2mmol/L，移取10mL20mmol/L儲備液于100mL的容量瓶中定容至刻度。3.2.2羅丹明6G儲備液的配制準確稱取羅丹明6G0.01g，在小燒杯中溶解，轉移定容在1000mL的容量瓶中，配成1x10-2g/L的儲備液。3.2.31%雙氧水儲備液的配制準確移取30%H2O23mL于聚乙烯的塑料瓶中，再加87mL的蒸餾水。3.2.4氨水儲備液的配制準確移取3.33mL濃氨水，稀釋至500mL的容量瓶中，定容至刻度，配制成0.1mol/LNH3?H2O的儲備液。3.2.5氯化銨儲備液的配制準確稱取2.6855g氯化銨，在小燒杯中用少量水溶解，轉移定容在500mL的容量瓶中,配制成0.1004mol/LNH4Cl的儲備液。3.2.6根據(jù)化學手冊配制成不同pH值0.1mol/LNH?H0-0.1004mol/LNHCl的緩沖溶液：3 2 4NH4C1V/mL3232302515nh3?h2oV/mL14152530pH8.08.589.19.59.810mL移液管，配于50mL容量瓶中，注意不要定容！3.2.7抗壞血酸儲備液的配制準確稱取抗壞血酸0.3523g,在小燒杯中用少量水溶解，轉移定容在100mL的容量瓶中，得到20mmol/L的儲備液。實驗時，移取2.5mL20mmol/L的抗壞血酸，轉移定容在100mL的容量瓶中得到0.5mmol/L的抗壞血酸。3.3實驗方法3.3.1羥自由基的測定在10mL容量瓶中，pH9.5的緩沖溶液1.0mL，加入1X10-2g/L的羅丹明6G1.6mL，2.0mmol/L的Mn2+溶液1mL,1%的H202溶液0.8mL,加蒸餾水至刻度，混勻。測定542nm波長處的熒光強度F，計算其與空白參比(羅丹明6G與緩沖液)熒光強度F0之差△F，通過測定?OH形成前后羅丹明6G的熒光強度變化，來反映?OH的產(chǎn)生量。3.3.2羥自由基清除率的測定在上述體系中加入一定量的羥自由基清除劑，同樣操作側定熒光強度Fs；羅丹明6G和緩沖溶液作為空白體系，其熒光強度為F。，未加清除劑的體系，其熒光強度為F，則清除率=(Fs-F)/(F0-F)x100%3.3.3水果水提取物清除?OH的作用新鮮水果洗凈，晾干，準確稱取40g，加入200mL蒸餾水，勻漿3min，過濾，離心5min，取上層清液0.6mL按上述方法進行測定。4結果與討論4.1.熒光光譜羅丹明6G本身能產(chǎn)生特征熒光，其激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為350nm和542nm,發(fā)射譜-350.0發(fā)射厝-350.0圖1同步熒光分光光度法測得的熒光光譜1、 羅丹明6G+緩沖溶液2、 羅丹明6G+緩沖溶液+Mn2++H2O2+水果提取物3、 羅丹明6G+緩沖溶液+Mn2++H2O24.2實驗參數(shù)工作模式：發(fā)射掃描 掃描間隔：2nm激發(fā)狹縫：6nm 發(fā)射狹縫：6nm負高壓：130V4.3實驗條件實驗條件對羥自由基的產(chǎn)生有影響，也對抗氧化劑對羥自由基的清除率有影響，應綜合考慮這兩方面的因素，選擇適宜的測定條件。4.3.1酸度的影響空白和羥自由基體系的AF受pH值的影響如圖2所示。可以看出，在-一范圍內，AF有較大值，故選用弱堿性介質pH 的緩沖溶液。（注意溶液加入順序）序號①②③④⑤緩沖各1mL(pH=)8.08.589.19.59.8羅丹明6G(1X10-2g/L)11111/mLMn2+(2.0mmol/L)/mL11111H2O2(1%)/mL0.80.80.80.80.8

4.3.2羅丹明6G的用量加入不同體積1XIO-2g/L羅丹明6G溶液，按試驗方法測定空白體系和?OH體系的△F,如圖3所示，結果表明羅丹明6G用量為 mL。①②③④⑤緩沖(pH=y)/mL11111羅丹明6G(1X10-2g/L)0.60.811.41.6/mLMn2+(2.0mmol/L)/mL11111H2O2(1%)/mL0.80.80.80.80.81'2'3'4'5'緩沖(pH=y)/mL11111羅丹明6G(1X10-2g/L)/mL0.60.811.41.64.3.3硫酸錳的用量按實驗方法加入不同體積2mmol/L的MnSO4溶液，測定熒光強度，選用MnSO4溶液為 mL。①②③④⑤緩沖(pH=y)/mL11111羅丹明6G(1X10-2g/L)1.61.61.61.61.6/mLMn2+(2.0mmol/L)/mL0.811.21.62H2O2(1%)/mL0.80.80.80.80.8

緩沖(pH=y)/mL1羅丹明6G(1XIO-2g/L)1.6/mL4.3.4過氧化氫的用量用不同體積1%的h2o2按試驗方法測定熒光強度，本實驗選用h2o2溶液①②③④⑤緩沖(pH=y)/mL11111羅丹明6G(1X10-2g/L)1.61.61.61.61.6/mLMn2+(2.0mmol/L)/mL22222H2O2(1%)/mL0.30.50.81.01.41'緩沖(pH=y)/mL1羅丹明6G(1X10-2g/L)1.6/mL4.5抗氧化劑清除羥自由基作用的測定于體系中加入抗壞血酸，按試驗方法測定空白體系的F0，?OH體系的F,加清除劑體系的Fs。熒光強度變化如圖1所示，結果表明，隨抗壞血酸用量增加，清除率加大。說明本體系中抗壞血酸與?OH的清除作用有明顯的量效關系。4.6水果的抗氧化作用測定了3種新鮮水果的水提取物對?OH的清除率，結果見表2。從表中看出，具有較強的清除?OH的功能。F0=7O.1 F=26.7表2各種水果的清除率水果Fs清除率（％西紅柿64.787.56梨27.51.84橙子55.967.285結果討論從這次實驗中可以看出水果盤蔬菜中含有大量天然抗氧化劑、且提取率高、抗氧化活性強，其與機體親和力強和安全性高等優(yōu)點具有取代合成抗氧化劑趨勢，是今后的研究重點。另外，天然抗氧化劑尚需在有效成分的抗氧化機理