食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 蔬菜中阿維菌素殘留的測定 酶聯(lián)免疫吸附法

食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)蔬菜中阿維菌素殘留的測定酶聯(lián)免疫吸附法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蔬菜中阿維菌素殘留量的酶聯(lián)免疫吸附測定法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于蔬菜中阿維菌素殘留量的測定。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法原理采用直接競爭酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）方法，在微孔條上包被偶聯(lián)抗原，試樣中殘留的阿維菌素與酶標(biāo)板上的偶聯(lián)抗原競爭酶標(biāo)記的阿維菌素抗體后，顯色劑顯色，終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度，吸光值與阿維菌素殘留量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出阿維菌素殘留含量。試劑和材料4.1阿維菌素試劑盒4.1.196孔板（12條×8孔）包被有阿維菌素偶聯(lián)抗原。4.1.2阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液（至少有5個倍比稀釋濃度水平，外加1個空白）。4.1.3過氧化物酶標(biāo)記阿維菌素抗體溶液。4.1.4過氧化物酶標(biāo)記物。4.1.5底物顯色溶液A液：過氧化尿素。4.1.6底物顯色溶液B液：四甲基聯(lián)苯胺。4.1.7反應(yīng)終止液：1mol/L硫酸。4.1.8復(fù)溶液（2倍濃縮液）。4.1.9洗滌液（20倍濃縮液）。4.2甲醇（分析純）4.3水GB/T6682規(guī)定的一級水。4.4復(fù)溶液工作液用水將2倍的濃縮復(fù)溶液按1∶1體積比進(jìn)行稀釋（1份2倍濃縮復(fù)溶液＋1份水），用于溶解干燥的殘留物及稀釋試樣，復(fù)溶液工作液在4℃可保存一個月。4.5洗滌液工作液用水將20倍的濃縮洗滌液按1∶19體積比進(jìn)行稀釋（1份20倍濃縮洗滌液＋19份水），用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌液工作液在4℃可保存一個月。儀器酶標(biāo)儀配有450nm濾光片。均質(zhì)器天平感量0.01g。渦旋儀離心機轉(zhuǎn)速≥3000r/min。氮氣吹干裝置恒溫箱恒溫箱微量移液器單道20μL～200μL、100μL～1000μL可調(diào)，多道250μL。試樣制備與保存取蔬菜樣品，剪碎，10000r/min均質(zhì)1min。制備好的試樣，應(yīng)即刻進(jìn)行提取和檢測。試樣測定提取稱取蔬菜試樣1.0g±0.05g于50mL聚苯乙烯離心管中，加10mL甲醇，渦動5min，3000r/min以上，20～25℃離心5min，取上層澄清液1mL于10mL潔凈干燥的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮氣流下吹干，加入100μL甲醇，渦動30s，再加入900μL復(fù)溶工作液，渦動1min，充分混合，取50μL用于分析。測定使用前將試劑盒在20～25℃下放置1～2h。7.2.1將標(biāo)準(zhǔn)和試樣（至少按雙平行實驗計算）所有數(shù)量的孔條插入微孔架，記錄標(biāo)準(zhǔn)和試樣的位置。7.2.2加100μL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（4.1.2）或處理好的試樣溶液到各自的微孔中。標(biāo)準(zhǔn)和試樣至少做兩個平行試驗。7.2.3加過氧化物酶標(biāo)記阿維菌素抗體溶液（4.1.3）100μL到每一個微孔中，充分混合，于25℃恒溫箱中孵育30min。7.2.4倒出孔中液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體。用250μL洗滌液工作液充入孔中，再次倒掉微孔中的液體，再重復(fù)操作兩遍以上（或用洗板機洗滌）。7.2.5加50μL底物顯色溶液A液（4.1.4）和50μL底物顯色溶液B液（4.1.5），混合并在25℃恒溫箱避光顯色15min。7.2.6加50μL反應(yīng)終止液（4.1.6），輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在450nm處測量吸光度值。結(jié)果計算用所獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液吸光度值與空白溶液吸光度值的比值進(jìn)行計算，見式（1）： （SEQ標(biāo)準(zhǔn)自動公式\*ARABIC1）式中：Ar——相對吸光度值，%；B——標(biāo)準(zhǔn)（試樣）溶液的吸光度值；B0——空白（濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)溶液）的吸光度值。將計算的相對吸光度值（%）對應(yīng)阿維菌素（μg/L）的自然對數(shù)做半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，對應(yīng)的試樣濃度可從校正曲線算出，見式（2）： （SEQ標(biāo)準(zhǔn)自動公式\*ARABIC2）式中：X——試樣中阿維菌素的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；A——試樣中相對吸光度值（%）對應(yīng)的阿維菌素含量，單位為微克每升（μg/L）；f——試樣稀釋倍數(shù)；m——試樣的取樣量，單位為克（g）。計算結(jié)果表示到小數(shù)點后兩位。陽性結(jié)果應(yīng)用確證法確證。檢測限、準(zhǔn)確度和精密度檢測限本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢測限：