從質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定多肽蛋白質(zhì)

從質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定多肽蛋白質(zhì)第一頁，共六十四頁，2022年，8月28日開場白在之前的講座中，我們已經(jīng)學到了關于蛋白質(zhì)組學中的重要工具—質(zhì)譜儀的知識。蛋白質(zhì)組學里，質(zhì)譜儀的作用是鑒定混合物中的蛋白質(zhì)。然而，沒有數(shù)據(jù)分析的輔助，它是做不到這一點的。第二頁，共六十四頁，2022年，8月28日講座大綱本講座中，將分別講述兩種鑒定蛋白質(zhì)的方法。其一是質(zhì)量紋鑒定法（PeptideMassFingerprinting），另外一種是二級質(zhì)譜的數(shù)據(jù)庫搜索鑒定法（MS/MSDatabaseSearching）。我們將簡略的介紹質(zhì)量紋鑒定法。而用更多的時間討論用于二級質(zhì)譜上的方法。第三頁，共六十四頁，2022年，8月28日多肽質(zhì)量紋鑒定多肽質(zhì)量紋（PeptideMassFingerprinting，PMF）是從一級質(zhì)譜（MS）中鑒定多肽的主要方法。多肽質(zhì)量紋一般都是在MALDI-TOF儀器的結(jié)果上進行。其原理就是利用了蛋白序列數(shù)據(jù)庫中的多肽質(zhì)量的信息。我們下面的討論，先假設一張質(zhì)譜圖對應一個蛋白。后面會討論處理多個蛋白的情況。第四頁，共六十四頁，2022年，8月28日一級質(zhì)譜圖蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解后，送入質(zhì)譜儀，得到一級質(zhì)譜。目前來說，由MALDI-TOF質(zhì)譜儀產(chǎn)生的質(zhì)譜圖精度較高，而由ESI質(zhì)譜儀產(chǎn)生的質(zhì)譜圖精度相對較低。另一個問題是，ESI產(chǎn)生的質(zhì)譜圖中的離子通常帶有很多電荷，而MALDI質(zhì)譜圖中的離子一般只帶一個電荷，比較容易計算。所以從一級質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的算法（質(zhì)量紋）主要用在MALDI-TOF產(chǎn)生的質(zhì)譜圖上。第五頁，共六十四頁，2022年，8月28日SampleMSSpectrum第六頁，共六十四頁，2022年，8月28日蛋白序列數(shù)據(jù)庫在美國國家生物信息中心的網(wǎng)站上可以查詢到最新的蛋白序列數(shù)據(jù)庫。NCBI上的數(shù)據(jù)庫中，信息最豐富的是Genpept格式，包括有蛋白的序列，各種性質(zhì)，甚至于參考文獻。但是對我們來說，我們只需要蛋白序列的信息就夠了。第七頁，共六十四頁，2022年，8月28日Genpept示例第八頁，共六十四頁，2022年，8月28日Genpept示例第九頁，共六十四頁，2022年，8月28日FASTA格式FASTA格式就是蛋白的氨基酸序列。第十頁，共六十四頁，2022年，8月28日虛擬酶解對應于送進質(zhì)譜儀的樣品，我們可以對數(shù)據(jù)庫里的序列作一次虛擬的酶解。第十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日質(zhì)量排列虛擬酶解的結(jié)果，產(chǎn)生了一系列的多肽，我們可以計算每個多肽的質(zhì)量。最后一個R的質(zhì)量多加了18，這是因為我們寫在下面的是殘基的分子量。第十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日質(zhì)量排列的把所有多肽的質(zhì)量排序。第十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日質(zhì)量紋如此，質(zhì)譜圖上的質(zhì)量就可以與多肽上的質(zhì)量相匹配。第十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日質(zhì)量紋這就是多肽質(zhì)量紋（PMF）的最基礎的思路。但是，真正的將之作為一個鑒定蛋白質(zhì)的方法，還有很多需要考慮的問題。在討論這些問題之前，我們先看一看目前常用的質(zhì)量紋算法。第十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日常用的質(zhì)量紋算法現(xiàn)在試驗中可用的算法有：Mascot:Profound:Expasytools:PeptideSearch:第十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日PMF中的問題第一個問題：質(zhì)量相近的多肽怎么處理？在現(xiàn)實的蛋白數(shù)據(jù)庫中，多肽的數(shù)量是很龐大的。這里面難保不會有質(zhì)量非常相近的多肽。這樣，就造成了質(zhì)譜圖上的一個峰可能匹配不止一個多肽，于是我們就難以知曉這張質(zhì)譜圖究竟代表哪個蛋白。第十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日質(zhì)量相近的多肽多肽[M+H+]DGAPLESSSR1019.0490REGESTPSR1019.0520DFPIANGER1019.0940DPLASSSWR1019.0940YVPLKDQR1019.1800HLQLPAPSR1019.1830VLFLNGIDK1019.2200Peakm/z:1019.08第十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日解決方案第一個解決的辦法是限制用來搜索的數(shù)據(jù)庫。比如，你如果做的試驗用的是小白鼠的組織，那么你可以只在鼠類的數(shù)據(jù)庫中搜索，這樣就可以減低出現(xiàn)這種情況的可能性。第二個解決的辦法是要求必須有多個多肽和數(shù)據(jù)庫相匹配，才做出最后的蛋白質(zhì)鑒定。第十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日多匹配DFPIANGER 1019.09EPISVSSQQMLK 1347.56VLDALDSIK 974.13CarbonicanhydraseII

SHHWGYGKHBGPZHWHKDFPIANGERQSPVNIDTKAVVQDPALKPLALVYGEATSRRMVNNGHSFNVEYDDSQDKAVLKDGPLTGTYRLVQFHFHWGSSBBQGSEHTVDRKKYAAELHLVHWNTKYGDFGTAAQQPDGLAVVGVFLKVGDANPALQKVLDALDSIKTKGKSTDFPNFDPGSLLPNVLDYWTYPGSLTTPPLLESVTWIVLKEPISVSSQQMLKFRTLNFNAEGEPELLMLANWRPAQPLKNRQVRGFPK多匹配可以大大降低隨機匹配的概率,從而增加結(jié)果的可信度第二十頁，共六十四頁，2022年，8月28日長蛋白和短蛋白第二個問題：長蛋白可能會更容易的被匹配。因為長蛋白里的多肽數(shù)目較多，即以概率來算，匹配上的幾率也會比較大。質(zhì)量紋算法必須考慮這個問題，給短蛋白一定的補償。第二十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日多個蛋白的情況第三個問題就是在一張質(zhì)譜圖中可能有多個蛋白存在。通常，MALDI-TOF是與雙向電泳連接使用。雙向電泳的一個電泳點上可能有2-3個蛋白，這樣就增加了鑒定的難度。由于無法預知一個電泳點上有多少蛋白質(zhì)，PMF的效果可能會受到很大的影響。第二十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日多肽質(zhì)量紋：小結(jié)質(zhì)量紋算法是用一級質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法。質(zhì)量紋算法比較簡單，一般使用較簡單的統(tǒng)計模型，速度一般較快。質(zhì)量紋算法的效果受到很多方面的限制，首先是儀器精度的限制，其次是樣品中可能有多個蛋白的限制。這使得質(zhì)量紋算法不是理想的分析復雜混合物中蛋白成分的方法。返回第二十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日利用二級質(zhì)譜圖我們剛才談到了，多肽質(zhì)量紋有其先天的不足。其中，最糟糕的是它不能處理多個蛋白的混合物。如果我們能夠處理混合物，就可以減少很多用于純化上的時間和精力。那么，怎么才能從混合物中鑒定蛋白呢？這就要用到二級質(zhì)譜。第二十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日二級質(zhì)譜圖在一級質(zhì)譜圖中，選擇其中的一個峰，對其進行CID過程，就得到一張二級質(zhì)譜圖。這里的假設是一級質(zhì)譜中的一個峰就對應了一個多肽，實際情況可能并不是這樣。先看一張二級質(zhì)譜圖，然后我們來解釋CID過程。第二十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日典型二級質(zhì)譜圖第二十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日CIDCID，即Collision-inducedDissociation，是通過撞擊使得多肽的肽鍵斷裂的過程。在做二級質(zhì)譜的試驗時，質(zhì)譜儀選擇一級質(zhì)譜中的一個峰，也就是對應質(zhì)荷比的這些離子，讓這些離子高速撞擊質(zhì)譜儀中的惰性氣體，使其肽鍵斷裂，這就是CID。第二十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日肽鍵及其斷裂第二十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日一些常見的特殊情況除了普通的肽鍵斷裂以外，還經(jīng)常有一些特殊的情況。Neutralloss:某些酸性氨基酸可能會在CID中丟失一個水分子（H2O），而堿性氨基酸會在CID中丟失一個氨分子（NH3）。翻譯后修飾：有時，二級質(zhì)譜中需要考慮某些氨基酸可能被修飾（磷酸化、糖基化等），這些修飾可能改變殘基的分子量。第二十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日肽鍵斷裂的說明CID中，肽鍵的斷裂方式有非常多的可能性。關于具體的斷裂方式，可以去查詢生物化學方面的書籍。這些問題超過了本課程的范圍。通常，我們只考慮b系列和y系列。原因是我們使用的電壓較低，其他系列的離子不易產(chǎn)生。但實際上，如果能夠清楚的知道我們究竟需要考慮什么樣的斷裂方式，對搜索算法的設計會有很大的幫助。第三十頁，共六十四頁，2022年，8月28日通過殘基鑒定多肽第三十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日De-novoSequencing這種通過殘基來鑒定多肽的方法被稱為De-novoSequencing。當我們擁有近乎完美的二級質(zhì)譜圖時，我們可以采用這種De-novoSequencing的辦法。但是，實際情況中，我們并沒有完美的二級質(zhì)譜圖，而一點點的不完美，帶來的誤差是驚人的。第三十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日氨基酸質(zhì)量表Molecularweightsusedforcalculations.Button

codeShort

codeNameAveragemass

ofresidueMonoisotopic

massofresidueTwentyNaturally-OccurringAminoAcidsAlaAAlanine71.078871.03711CysCCysteine103.1448103.00919AspDAsparticAcid115.0886115.02694GluEGlutamicAcid129.1155129.04259PheFPhenylalanine147.1766147.06841GlyGGlycine57.052057.02146HisHHistidine137.1412137.05891IleIIsoleucine113.1595113.08406LysKLysine128.1742128.09496LeuLLeucine113.1595113.08406MetMMethionine131.1986131.04049AsnNAsparagine114.1039114.04293ProPProline97.116797.05276GlnQGlutamine128.1308128.05858ArgRArginine156.1876156.10111SerSSerine87.078287.03203ThrTThreonine101.1051101.04768ValVValine99.132699.06841TrpWTryptophan186.2133186.07931TyrYTyrosine163.1760163.06333

第三十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日組合數(shù)(估計值）峰間質(zhì)量距離(Da)最低組合數(shù)最高組合數(shù)平均值50-100010.089100-2000141.556200-300113624.871300-400371687386.23400-500586234815958.36500-6001409334038092016.7600-70024852148732601418510第三十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日DatabaseSearching對于一張不完美的質(zhì)譜圖，有這么多的組合可以生成之。但是，幸運的是，我們還有這個蛋白序列數(shù)據(jù)庫。雖然組合有那么多，但是在這個數(shù)據(jù)庫的限制之下，組合數(shù)就大大的減少了。所以我們可以從數(shù)據(jù)庫里搜索最好的匹配質(zhì)譜圖的多肽，這樣就有了二級質(zhì)譜的數(shù)據(jù)庫搜索算法。第三十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日數(shù)據(jù)庫搜索的基礎數(shù)據(jù)庫搜索的基礎很簡單，就是理論質(zhì)譜圖和試驗質(zhì)譜圖之間的一個比對。我們剛才討論了CID的過程，所以我們知道了殘基產(chǎn)生的規(guī)律，那么，利用這些規(guī)律，我們可以對每個多肽產(chǎn)生一張理論的質(zhì)譜圖，用來和試驗質(zhì)譜圖進行比對，對它們“相似”的程度做一個評分，分數(shù)最高的多肽，我們就認為它是試驗質(zhì)譜圖代表的多肽。第三十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日理論質(zhì)譜圖和試驗質(zhì)譜圖第三十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日數(shù)據(jù)庫搜索的流程在一個蛋白序列數(shù)據(jù)庫中，可以找出來的，落在質(zhì)譜儀質(zhì)量范圍以內(nèi)的多肽多達數(shù)百至數(shù)千萬，如果每個多肽都拿來和試驗質(zhì)譜圖做比對的話，需要花費的時間是難以接受的。提高搜索速度的關鍵就是減少搜索的對象數(shù)。第三十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日數(shù)據(jù)庫搜索的流程所以，基本上，所有的數(shù)據(jù)庫搜索算法都包括兩個步驟。第一個步驟是篩選數(shù)據(jù)庫里的多肽，找出所有有可能與質(zhì)譜圖匹配的多肽。第二個步驟就是拿這些選出來的多肽去和質(zhì)譜圖進行比對，并輸出最高分值的多肽作為一個PSM（Peptide-SpectrumMatch）。第三十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日常用的搜索算法常用的二級質(zhì)譜的數(shù)據(jù)庫搜索算法包括：

SequestMascot:Sonar,GutenTag,OLAV,ProbID,…………第四十頁，共六十四頁，2022年，8月28日Sequest我們用Sequest作為一個例子來講解數(shù)據(jù)庫搜索算法的一般流程。Sequest是由Eng,Yates等人在1994年提出的經(jīng)典算法。雖然目前已經(jīng)顯得有些過時，但是在很多實驗室中仍然是最為常用的算法。第四十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日第一步：數(shù)據(jù)庫初篩首先的工作是要從數(shù)據(jù)庫中找出分子量和質(zhì)譜圖母離子分子量相當?shù)亩嚯?。算法首先把?shù)據(jù)庫里的多肽做一次虛擬的酶切。對酶切得到的每一個多肽，計算其分子量。找到所有分子量與質(zhì)譜圖母離子接近的多肽后，準備進行匹配。第四十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日第四十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日第二步：質(zhì)譜圖預處理對質(zhì)譜圖做一些預處理，可以提高算法的速度，有時還可以增加鑒定的正確率。Sequest的預處理包括：把質(zhì)譜圖的橫坐標進行取整。質(zhì)譜圖的縱坐標做歸一化。去除母離子正負10區(qū)域的離子。去除低豐度離子，只保留200個豐度最高的離子。第四十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日第三步：PreliminaryScoring由于精細的比較理論質(zhì)譜圖和試驗質(zhì)譜圖很耗時間。Sequest使用了一種兩步打分的方法。第一步的分數(shù)給的較粗，計算起來也比較快，可以用來先去掉那些不太可能得到PSM的多肽。第二步的分數(shù)則比較精細，用來最后確認哪個多肽成為最后的PSM。第四十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日第三步：PreliminaryScoringSequest中，第一步的分數(shù)叫做Sp，它的公式如下：這里的β是一個連續(xù)性的補償因子，ρ是immoniumions的補償因子。Sp排名前500位的多肽進入最后一步的互相關分析。第四十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日第四步：互相關分析Sequest最主要的分數(shù)XCorr，就是從這一步得到的。首先要產(chǎn)生一張理論質(zhì)譜圖。Sequest的理論質(zhì)譜圖是在b系列和y系列的位置有豐度為50的峰，在b系列和y系列正負1的位置有豐度為25的峰。而在b-H2O,y-H2O,b-NH3,y-NH3的位置有豐度為10的峰。第四十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日第四步：互相關分析相關分析是統(tǒng)計中分析兩個信號相似性的重要手段。一般的連續(xù)信號的互相關函數(shù)公式如下：在Sequest中，我們要處理的是離散的問題，所以，把積分號變成求和號。第四十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日第四步：互相關分析但是，單單把試驗質(zhì)譜圖和理論質(zhì)譜圖做互相關是不夠的?？紤]下面的這種情況：第四十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日歸一化處理因此，在做相關分析之前，Sequest把試驗質(zhì)譜圖劃分為10個區(qū)間，把每個區(qū)間上的最高峰的豐度歸一化為50。這種歸一化處理雖然是必要的，但是客觀上，它造成了很多錯誤的PSM，因為很低的峰和很高的峰可以在相關分析中占據(jù)同等的地位。第五十頁，共六十四頁，2022年，8月28日第五十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日Sequest：小結(jié)Sequest分四個步驟：1。數(shù)據(jù)庫初篩2。質(zhì)譜圖預處理3。PreliminaryScoring4?；ハ嚓P分析從Sequest中，我們可以學習到數(shù)據(jù)庫搜索算法的一般流程，其中的關鍵就是打分算法和計算速度。第五十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日一些其它的技術去同位：一個離子的同位素會在質(zhì)譜圖上顯示出不同的峰，峰間的距離為1，去同位就是把這些峰合并為一個峰。第五十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日去同位的效果第五十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日后篩選在以前的蛋白質(zhì)組學的書籍中，大都沒有提及過后篩選，似乎打出了一個分數(shù)，產(chǎn)生了一大堆的PSM，就萬事大吉了?？墒牵谡鎸嵉脑囼炛?，一次試驗往往會產(chǎn)生成千上萬張質(zhì)譜圖，其中，大部分都屬于無法鑒定的。而所有的打分算法，目標都只是“最好”的匹配質(zhì)譜圖的多肽，并不關心這個最好究竟好到什么程度。第五十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日質(zhì)量很差的質(zhì)譜圖第五十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日再來一張第五十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日再來一張第五十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日后篩選在某些質(zhì)譜儀中，產(chǎn)生的質(zhì)譜圖能有十分之一可以鑒定，就已經(jīng)很不容易了。這樣的話，我們就看到光是得到PSM是不夠的，還要對這些PSM進行一次篩選，看看究竟哪些是”真”的PSM，哪些只是矬子里拔將軍。