DNA的粗提取與鑒定使用

會(huì)計(jì)學(xué)1DNA的粗提取與鑒定使用課題目標(biāo)

目標(biāo):1本課題通過(guò)嘗試對(duì)植物或動(dòng)物組織中的DNA進(jìn)行粗提取，了解DNA的物理化學(xué)性質(zhì)，2理解DNA粗提取以及DNA鑒定的原理。課題重點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定方法。知識(shí)要點(diǎn)：

1.

DNA的物理化學(xué)性質(zhì)，尤其是DNA的溶解性2.

二苯胺法鑒定DNA的方法和原理。第1頁(yè)/共53頁(yè)基礎(chǔ)知識(shí)1、提取大分子的基本思路是什么？

選用一定的物理、化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的大分子。2、提取DNA分子的基本思路又是什么？

利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)上的差異，提取DNA，去除其他成分。第2頁(yè)/共53頁(yè)3、提取和鑒定DNA的具體的依據(jù)有哪些方面？(原理)1）、DNA的溶解性

①DNA和蛋白質(zhì)等其它成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同。

1、在什么濃度下，DNA的溶解度最??？DNA在Nacl溶液中的溶解度是如何變化的？在NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14mol/L時(shí)，DNA溶解度最??；當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí)，DNA的溶解度又逐漸增大。第3頁(yè)/共53頁(yè)2、如何通過(guò)控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？

當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol／L時(shí)，DNA的溶解度最大，濃度為0．14mol／L時(shí)，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出第4頁(yè)/共53頁(yè)3、提取和鑒定DNA的具體的依據(jù)有哪些方面？1）DNA的溶解性

①DNA和蛋白質(zhì)等其它成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同。

②DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精第5頁(yè)/共53頁(yè)2）、DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性①蛋白酶只能使蛋白質(zhì)水解②大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60—80℃的高溫而變性，但DNA在80℃以上才變性。③洗滌劑能瓦解細(xì)胞膜，但對(duì)DNA沒(méi)有影響。第6頁(yè)/共53頁(yè)3、DNA的鑒定①沸水浴下，DNA遇二苯胺被染成藍(lán)色；二苯胺鑒定DNA的化學(xué)原理：

DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成ω-羥基-γ酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈現(xiàn)藍(lán)色(溶液呈淺藍(lán)色)。鑒定時(shí)溶液藍(lán)色的深淺，與溶液中DNA含量的多少有關(guān)。②紫外燈照射法：

紫外燈照射法用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的溴化乙錠(EB)溶液，將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹到蠟紙上，再滴1滴EB溶液染色。將蠟紙放在紫外燈(260nm)下照射(暗室中)，可呈現(xiàn)橙紅色的螢光(DNA的紫外吸收高峰在260nm處)。③甲基綠（藍(lán)綠色）第7頁(yè)/共53頁(yè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液（三）去除濾液中的雜質(zhì)（四）DNA的析出與鑒定第8頁(yè)/共53頁(yè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取含有DNA的組織且DNA含量較多的組織。比較下列材料哪些DNA含量高、適于提取DNA？為什么？第9頁(yè)/共53頁(yè)哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞：大腸桿菌：

雞血細(xì)胞：沒(méi)有細(xì)胞核，沒(méi)有DNA。原核生物，DNA含量少。DNA含量豐富，材料易得，易吸水脹破。DNA含量相對(duì)較高的生物組織。第10頁(yè)/共53頁(yè)。較好的實(shí)驗(yàn)材料應(yīng)該滿足以下幾個(gè)條件

：1．組織中DNA的含量比較豐富,能夠適合大量提取。2．該組織中所含化合物種類應(yīng)比較單純,避免由于其他

物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)與DNA相近，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象產(chǎn)生某

些干擾。3．實(shí)驗(yàn)材料的價(jià)格適宜，從而能相對(duì)的降低實(shí)驗(yàn)成本。4．實(shí)驗(yàn)材料在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的可操作性較強(qiáng)，在相對(duì)簡(jiǎn)單

的條件下能大量提取出DNA，便于學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作第11頁(yè)/共53頁(yè)（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液1、動(dòng)物細(xì)胞：蒸餾水?dāng)嚢?、為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？

蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。

旁欄問(wèn)題第12頁(yè)/共53頁(yè)（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液1、動(dòng)物細(xì)胞：蒸餾水?dāng)嚢?、植物細(xì)胞：洗滌劑和食鹽攪拌和研磨若探究提取效果，可設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)。2、加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？

洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放；食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

旁欄問(wèn)題第13頁(yè)/共53頁(yè)3．如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？

研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。旁欄問(wèn)題4．此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？

可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。第14頁(yè)/共53頁(yè)（三）去除濾液中的雜質(zhì)方案一：

DNA在不同濃度NaCl中溶解度不同；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)旁欄問(wèn)題5．為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？

用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。第15頁(yè)/共53頁(yè)（三）去除濾液中的雜質(zhì)方案一：

DNA在不同濃度NaCl中溶解度不同；方案二：

加入嫩肉粉（含木瓜蛋白酶）方案三：

60—75℃恒溫水浴保溫10—15min實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)第16頁(yè)/共53頁(yè)旁欄問(wèn)題6．方案二與方案三的原理有什么不同？方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。第17頁(yè)/共53頁(yè)（四）DNA的析出與鑒定：95%的冷酒精靜置2—3min，出現(xiàn)白色絲狀物玻璃棒卷起加入2mol/L氯化鈉溶解，加入4mL二苯胺試劑，搖勻，沸水浴5min，觀察顏色變化。

（注意設(shè)置空白對(duì)照）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)第18頁(yè)/共53頁(yè)使用冷的乙醇溶液具哪些優(yōu)點(diǎn)？一、抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二、降低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出；三、低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。第19頁(yè)/共53頁(yè)P(yáng)56操作提示1、血液應(yīng)加入檸檬酸鈉（抗凝劑）防止血液凝固；2、加洗滌劑，動(dòng)作要輕緩，防止產(chǎn)生大量氣泡；加酒精、玻棒攪拌，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂。3、二苯胺試劑現(xiàn)配現(xiàn)用。第20頁(yè)/共53頁(yè)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)（一）是否提取出了DNA

觀察你提取的DNA顏色，如果不是白色絲狀物，說(shuō)明DNA中的雜質(zhì)較多；二苯胺鑒定出現(xiàn)藍(lán)色說(shuō)明實(shí)驗(yàn)基本成功，如果不呈現(xiàn)藍(lán)色，可能所提取的DNA含量低，或是實(shí)驗(yàn)操作中出現(xiàn)錯(cuò)誤，需要重新制備。第21頁(yè)/共53頁(yè)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)（二）分析DNA中的雜質(zhì)

本實(shí)驗(yàn)提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)。（三）不同實(shí)驗(yàn)方法的比較

對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)方法，本課題可以采用分組的方法進(jìn)行研究。首先選取不同的實(shí)驗(yàn)材料，其次同種材料還可以采用不同方法，從多方面比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如DNA的純度、DNA的顏色、二苯胺顯色的深淺等，看看哪種實(shí)驗(yàn)材料、哪種提取方法的效果更好。第22頁(yè)/共53頁(yè)練習(xí)

提取DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中或多或少的損失而造成檢測(cè)的困難；第二步是DNA的釋放和溶解，這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解；第三步是DNA的純化，即根據(jù)DNA的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開(kāi)；最后一步是對(duì)DNA進(jìn)行鑒定，這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。1、請(qǐng)解釋提取DNA的實(shí)驗(yàn)操作中主要步驟的目的。第23頁(yè)/共53頁(yè)練習(xí)

提取蛋白質(zhì)比提取DNA的難度大。這是因?yàn)椋cDNA相比，蛋白質(zhì)對(duì)溫度、鹽濃度、pH等條件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多種多樣，理化性質(zhì)各不相同，使得蛋白質(zhì)的提取沒(méi)有一種統(tǒng)一的方法，只能根據(jù)特定蛋白質(zhì)的特性摸索提取的條件，設(shè)計(jì)特定的方法。

2、你認(rèn)為從細(xì)胞中提取某種特定的蛋白質(zhì)與提取DNA一樣容易嗎？為什么？第24頁(yè)/共53頁(yè)案例一：以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取實(shí)驗(yàn)案例②雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對(duì)設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時(shí)較長(zhǎng)1、雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料的原因①雞血細(xì)胞核的DNA含量豐富，材料易得第25頁(yè)/共53頁(yè)2、實(shí)驗(yàn)原理①DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaCl的濃度的變化而改變的。當(dāng)NaCl的物質(zhì)的量濃度為0.14mol／L時(shí),DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。②DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。③DNA遇二苯胺（沸水浴）會(huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。第26頁(yè)/共53頁(yè)4、課前準(zhǔn)備雞血細(xì)胞液取質(zhì)量濃度為0．1g/ml的檸檬酸納溶液（抗凝劑）100ml，置于500ml燒杯中。注入新鮮的雞血（約180ml），同時(shí)用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸納溶液充分混合，以免凝血。將燒杯中的血液置于冰箱內(nèi)，精置一天，使血細(xì)胞自行沉淀。（也可以將血液倒入離心管內(nèi)，用1000r/min（轉(zhuǎn)每分）的離心機(jī)離心2min，血細(xì)胞沉淀于離心管底部。實(shí)驗(yàn)時(shí)。用吸管除去離心管上部的澄清液，就可以得到雞血細(xì)胞液。）①過(guò)程第27頁(yè)/共53頁(yè)②檸檬酸鈉作用防止血液凝固③作用機(jī)理檸檬酸鈉能與血漿中的Ca2+發(fā)生反應(yīng)，生成檸檬酸鈣絡(luò)合物，血漿中游離的Ca2+大大減少，血液就不會(huì)凝固雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過(guò)程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液④注意事項(xiàng)第28頁(yè)/共53頁(yè)討論：提取雞血中的DNA時(shí)，為什么除去血液中的上清液？答：血液分為兩部分，一部分是血漿，一部分是血細(xì)胞，離心后除去的上清液是血漿5、方法步驟將制備好的雞血細(xì)胞液5mL～10mL，注入到50mL燒杯中。向燒杯中加入蒸餾水20mL，同時(shí)用玻璃棒充分?jǐn)嚢?min，使血細(xì)胞加速破裂。然后，用放有紗布的漏斗將血細(xì)胞液過(guò)濾至500mL。取其濾液。①提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)第29頁(yè)/共53頁(yè)第30頁(yè)/共53頁(yè)討論：答：讓細(xì)胞內(nèi)濃度大于周圍溶液的濃度，細(xì)胞會(huì)吸水以至脹破（1）為什么要加入蒸餾水？加入蒸餾水后細(xì)胞會(huì)有什么變化？（2）用玻璃棒攪拌有什么意義？答：用玻璃棒攪拌可以加速血細(xì)胞和細(xì)胞核的破裂。注意應(yīng)沿一個(gè)方向快速攪拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA（3）濾去的是什么物質(zhì)？得到的是什么？答：過(guò)濾將濾去的是細(xì)胞膜和核膜等物質(zhì)；得到的是與蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合在一起的DNA第31頁(yè)/共53頁(yè)②溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA將氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol的溶40mL加入到濾液中，并用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌1min，使其混合均勻，這時(shí)DNA在溶液中呈溶解狀態(tài)沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時(shí)燒杯中有絲狀物出現(xiàn)，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續(xù)加入蒸餾水，溶液中出現(xiàn)的粘稠物會(huì)越來(lái)越多。當(dāng)粘稠物不再增加時(shí)停止加入蒸餾水（這時(shí)溶液中氯化鈉的物質(zhì)的量濃度相當(dāng)于0.14mol／L）③析出含DNA的粘稠物第32頁(yè)/共53頁(yè)第33頁(yè)/共53頁(yè)討論：加入蒸餾水的目的？降低NaCl溶液濃度到使DNA溶解度最低點(diǎn)，使DNA從NaCl溶液中析出將溶液中的DNA與其他雜質(zhì)分離，這一步驟是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個(gè)方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞注意事項(xiàng)：第34頁(yè)/共53頁(yè)④濾取含DNA的粘稠物用放有多層紗布的漏斗，過(guò)濾步驟3中的溶液至500mL的燒杯中，含DNA的粘稠物被留在紗布上⑤將DNA的粘稠物再溶解取1個(gè)50mL燒杯，向燒杯內(nèi)注入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol／L的溶液20mL。用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃擇不停地?cái)嚢瑁拐吵砦锉M可能多地溶解于溶液中第35頁(yè)/共53頁(yè)第36頁(yè)/共53頁(yè)⑥過(guò)濾含有DNA的氯化鈉溶液取1個(gè)100mL燒杯，用放有兩層紗布的漏斗過(guò)濾步驟5中的溶液。取其濾液，DNA溶于濾液中⑦提取含雜質(zhì)較少的DNA在上述濾過(guò)的溶液中，加入冷卻的、酒精的體積分?jǐn)?shù)為95％的溶液50mL（使用冷卻的酒精，對(duì)DNA的凝集效果較佳），并用玻璃棒攪拌，溶液中會(huì)出現(xiàn)含雜質(zhì)較少的絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA第37頁(yè)/共53頁(yè)第38頁(yè)/共53頁(yè)答：因?yàn)镈NA不溶于冷酒精，而其他物質(zhì)可以溶解在酒精中，使含雜質(zhì)較少的DNA絲狀物可以析出,懸浮于溶液中討論：（2）觀察絲狀物呈什么顏色？答：白色（1）為什么要加50mL的冷酒精？第39頁(yè)/共53頁(yè)取兩支20mL的試管，各加入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為0．015mol／L的溶液5mL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4mlL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后，觀察并且比較兩支試管中溶液顏色的變化⑧DNA的鑒定第40頁(yè)/共53頁(yè)第41頁(yè)/共53頁(yè)討論：答：有絲狀物的試管變成藍(lán)色，另一試管還是原來(lái)顏色（2）這一鑒定結(jié)果說(shuō)明什么問(wèn)題？（1）比較兩個(gè)試管中溶液的顏色有什么不同？答：提取出的絲狀物是DNA（3）DNA的直徑約為20×10-10m，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的絲狀物的粗細(xì)是否表示1個(gè)DNA分子直徑的大?。看穑篋NA分子直徑只有2nm。絲狀物是多個(gè)DNA子聚在一起形成的

第42頁(yè)/共53頁(yè)第43頁(yè)/共53頁(yè)答：整個(gè)實(shí)驗(yàn)共“兩次蒸餾水，三次過(guò)濾，兩次析出，六次攪拌”6、討論：①兩次蒸餾水第一次：細(xì)胞吸水脹破第一步第二次：使DNA黏稠物析出第三步（1）此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有幾次使用蒸餾水？幾次過(guò)濾，幾次析出，幾次攪拌？分別在哪一步？第44頁(yè)/共53頁(yè)

過(guò)濾時(shí)使用的紗布層數(shù)與需用濾液或黏稠物有關(guān)，第二次要用其濾出的黏稠物有關(guān)，所以要使用多層紗布，第一次和第三次均要用其濾液，使用的紗布為1－2層②三次過(guò)濾第一次：DNA存在于濾液里第一步第二次：DNA被留在紗布上第四步第三次：DNA存在于濾液里第六步第45頁(yè)/共53頁(yè)③兩次析出第一次：用0.14mol／L的NaCI溶液含雜質(zhì)多第三步第二次：用冷卻的95％的酒精第七步④六次攪拌：第一、二、三、五、七步

其中除第八步外，其余均要朝一個(gè)方向攪拌，在第三、五步攪動(dòng)還要輕緩，玻璃棒不要直插燒杯底部，這樣才能保證得到完整的DNA第46頁(yè)/共53頁(yè)（2）為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)第47頁(yè)/共53頁(yè)方法步驟

加入物質(zhì)

目的

1.制備雞血細(xì)胞液

檸檬酸鈉溶液

①

2.提取雞血細(xì)胞細(xì)胞核物質(zhì)

20m1蒸餾水

②

3.溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA

2m1／L的NaCI溶液40mL

③

4.析出含DNA的黏稠物

蒸餾水

④

5.濾取含DNA的黏稠物

⑤

6.將DNA的黏稠物再溶解

2mol／L的NaCl溶液20mL

⑥

7.過(guò)濾含DNA的NaCl溶液

⑦

8.提取含有雜質(zhì)較少的DNA

冷卻的95％的酒精50mL

⑧

A:(1)向試管中加入0.015mol／L的NaCl溶液5mL

(2)加入DNA

(3)4mL二苯胺試劑

9.DNA的鑒定

B:(1)向試管中加入0.015mol／L

的NaCl溶液5mL

(2)4mL二苯胺試劑

⑨

以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取第48頁(yè)/共53頁(yè)案例二

以菜花為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提取課前準(zhǔn)備

將新鮮菜花和體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇溶液放入冰箱冷凍室24h。提取DNA的具體步驟1.取材

稱取30