第21章dna重組及技術(shù)

DNA重組及重組DNA技術(shù)GeneticbinationandGeneticEngineering第二十一章主講教師關(guān)亞群教學(xué)要求掌握基因工程的概念、重要的工具酶及其作用和基因載體的種類和特點。熟悉基因工程的操作過程，目的基因獲取方法。了解基因工程與醫(yī)學(xué)的關(guān)系。教學(xué)內(nèi)容1.重組DNA技術(shù)概述

DNA重組技術(shù)（基因工程）概念，重要的工具酶及其作用，目的基因獲取方法及基因載體的種類和特點?；蚬こ痰牟僮鬟^程。2.基因工程與醫(yī)學(xué)的關(guān)系

疾病基因的發(fā)現(xiàn)，發(fā)展新藥物。DNA診斷，基因治療，遺傳病的防治。第一節(jié)

DNA的重組

DNAbination

二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)?？山雍腺|(zhì)粒如F因子(Ffactor)質(zhì)粒

——細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子（二）轉(zhuǎn)化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用

(transformation)。例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。噬菌體溶源性生長第二節(jié)

重組DNA技術(shù)DNAbinationTechnique重組DNA技術(shù)的發(fā)展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗1973年美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉重組DNA技術(shù)相關(guān)概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。DNA克隆DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子——復(fù)制子(replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(binantDNA)。目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基1.限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGTCCAGGACCTG+平端切口粘端切口限制酶的識別序列特點以中軸線雙側(cè)的DNA上堿基呈反向?qū)ΨQ，重復(fù)排列

如：GAA

TTC

CCC

GGG

CTT

AAG

GGGCCC2.DNA連接酶DNA連接酶（DNAligase）：催化兩個相鄰的3′-OH和5′-磷酸基團形成3′，5′-磷酸二酯鍵，從而使DNA片段或單鏈斷裂形成的缺口連接起來。BamHI二、重組DNA技術(shù)中常用的載體定義為攜帶和運載目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA可分為克隆載體和表達(dá)載體①克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。②表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。1.質(zhì)粒

(plasmid)存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子目錄2.噬菌體(phage)常用的有λ噬菌體和M13噬菌體酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他：三、重組DNA技術(shù)的基本原理

及操作步驟基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選與鑒定克隆基因的表達(dá)。

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程（一）目的基因的獲取------分1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌*從基因組DNA文庫獲取目的基因mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1-3步25-30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍（三）目的基因與載體的連接---接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）載體的選擇和構(gòu)建---選BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接。

EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠ受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化(transformation)；轉(zhuǎn)染(transfection)---真核細(xì)胞主動攝取或被動導(dǎo)入感染(infection)---噬菌體和細(xì)胞病毒介導(dǎo)（四）重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞---轉(zhuǎn)（五）重組體的篩選---篩

1.直接選擇法

(1)抗藥性標(biāo)記選擇(2)標(biāo)志補救(markerrescue)-----表達(dá)產(chǎn)物與營養(yǎng)缺陷互補

α-互補藍(lán)白斑篩選(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡

2.免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等抗藥性標(biāo)志篩選抗性平板α互補的檢測目錄重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為分分離目的基因選（切）限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌篩篩選重組體表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達(dá)（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識疾病的分子機制。第三節(jié)重組DNA技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（二）生物制藥

基因工程的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因生物目的基因目的基因來源抗蟲植物（如：抗蟲棉）Bt毒蛋白基因蘇云金芽胞桿菌蛋白酶抑制劑基因植物淀粉酶抑制劑基因植物凝集素基因抗病植物（如：轉(zhuǎn)基因煙草）病毒外殼蛋白基因病毒的復(fù)制酶基因幾丁質(zhì)酶基因抗逆轉(zhuǎn)基因植物抗凍蛋白基因魚抗除草劑基因轉(zhuǎn)基因玉米富含賴氨酸的蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)基因延熟番茄控制番茄果實成熟的基因轉(zhuǎn)基因矮牽牛植物花青素代謝有關(guān)的基因轉(zhuǎn)基因鯉魚外源生長激素基因人轉(zhuǎn)基因牛腸乳糖酶基因人轉(zhuǎn)基因牛（羊）抗凝血酶基因、血清白蛋白基因、生長激素基因、a-抗胰蛋白酶轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)光基因螢火蟲

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進行診斷試驗、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂目錄蛋白質(zhì)工程的崛起蛋白質(zhì)工程的概念

是研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，然后人為地設(shè)計一個新蛋白質(zhì)，并按這個設(shè)計的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)去改變其基因結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)。

或者從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系出發(fā)，定向地改造天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，特別是對功能基因的修飾，也可以制造新型的蛋白質(zhì)。1.DNA重組技術(shù)（基因工程）概念，重要的工具酶及其作用；目的基因獲取方法；基因載體的種類和特點。

2.基因工程的操作過程包括：目的基因的獲取，克隆基因載體的選擇與改造，目的基因與載體的連接(重組DNA)，重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，篩選出含目的基因的重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞以及重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴增等。

小結(jié)復(fù)習(xí)思考題

選擇題1.人工DNA重組中催化外源DNA與載體DNA連接的酶是（）

A.限制性內(nèi)切酶B.限制性外切酶C.DNA連接酶D.DNA聚合酶E.Taq酶2.重組DNA技術(shù)領(lǐng)域常用的質(zhì)粒DNA是（）

A.細(xì)菌染色體DNA的一部分

B.細(xì)菌染色體外的獨立遺傳單位

C.病毒基因組DNA的一部分

D.真核細(xì)胞染色體DNA的一部分

E.真核細(xì)胞染色體外的獨立遺傳單位3.直接針對目的DNA進行篩選的方法是

A.青霉素抗藥性B.氨卞青霉素抗藥性

C.分子雜交D.分子篩選

E.電泳4.最常用的篩選轉(zhuǎn)化細(xì)菌是否含有質(zhì)粒的方法是：

A.營養(yǎng)互補篩選B.抗藥性篩選

C.免疫化學(xué)篩選D.原位雜交篩選

E.Southern印跡篩選5.基因工程的完整操作過程可簡單地概括為()

A.載體和目的基因的分離、線性化與鑒定

B.限制酶的應(yīng)用

C.將載體和目的基因連接成重組體

D.將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，篩選出含目的基因菌落

E.分、切、接、轉(zhuǎn)、篩6.關(guān)于限制性內(nèi)切酶敘述錯誤的一項是()A.可識別特異的DNA序列

B.可產(chǎn)生5＇-末端突出的粘性末端

C.可產(chǎn)生3‘-末