口腔微生物分子生物學(xué)

口腔微生物分子生物學(xué)第一頁，共七十七頁，2022年，8月28日第二頁，共七十七頁，2022年，8月28日生命的主要遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸（DNA）第三頁，共七十七頁，2022年，8月28日DNA結(jié)構(gòu)的推衍Chargaff:T+C=A+G A=T G=CX線衍射：

DNA在兩條鏈組成，相互平行第四頁，共七十七頁，2022年，8月28日核酸的組成DNA RNA脫氧核糖 核糖腺嘌吟胞嘧啶 腺嘌呤胞嘧啶鳥嘌呤胸腺嘧啶 鳥嘌呤尿嘧啶雙鏈 單鏈第五頁，共七十七頁，2022年，8月28日第六頁，共七十七頁，2022年，8月28日第七頁，共七十七頁，2022年，8月28日DNA復(fù)制半保留復(fù)制第八頁，共七十七頁，2022年，8月28日DNA復(fù)制半不連接復(fù)制由于DNA多聚酶只能從5’→

3’方向合成DNA，因而半保留復(fù)制不能完全解釋。第九頁，共七十七頁，2022年，8月28日第十頁，共七十七頁，2022年，8月28日DNA復(fù)制的特點(diǎn)新合成的子代DNA與親代DNA完全一樣，保證了遺傳的穩(wěn)定性。第十一頁，共七十七頁，2022年，8月28日RNA信使RNA（mRNA)核蛋白體RNA（rRNA)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA)第十二頁，共七十七頁，2022年，8月28日RNA的生物合成——轉(zhuǎn)錄以DNA為模板合與RNA由RNA多聚酶合成從DNA上特定起始序列（啟動(dòng)子）開始，至終止信號(hào)結(jié)束第十三頁，共七十七頁，2022年，8月28日第十四頁，共七十七頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯遺傳密碼

由3個(gè)連續(xù)的核苷酸組成第十五頁，共七十七頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯蛋白質(zhì)合成過程Ⅰ.氨基酸活化Ⅱ.蛋白質(zhì)合成的起始AUG→甲?；琢虬彼幔╢Met)Ⅲ.蛋白質(zhì)合成的終止終止碼UAA、UGA、UAG第十六頁，共七十七頁，2022年，8月28日第十七頁，共七十七頁，2022年，8月28日第十八頁，共七十七頁，2022年，8月28日第十九頁，共七十七頁，2022年，8月28日第二十頁，共七十七頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的生物合成——翻譯新生多肽的加工Ⅰ.fMet水解Ⅱ.磷酸化、糖基化、甲基化修飾Ⅲ.信號(hào)肽蛋白質(zhì)向細(xì)胞外分泌第二十一頁，共七十七頁，2022年，8月28日基因表達(dá)DNA→RNA→蛋白質(zhì)豐富的生命現(xiàn)象第二十二頁，共七十七頁，2022年，8月28日基因表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)體的每一個(gè)細(xì)胞都有一套完全相同的基因共同表達(dá)的基因特異性表達(dá)的基因第二十三頁，共七十七頁，2022年，8月28日第二十四頁，共七十七頁，2022年，8月28日基因表達(dá)的調(diào)節(jié)共同表達(dá)的基因維持細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)、功能第二十五頁，共七十七頁，2022年，8月28日基因表達(dá)的調(diào)節(jié)特異性表達(dá)的基因紅細(xì)胞產(chǎn)生血紅蛋白B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體成牙本質(zhì)細(xì)胞分泌牙本質(zhì)蛋白第二十六頁，共七十七頁，2022年，8月28日基因表達(dá)調(diào)控的原因動(dòng)力細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，或細(xì)胞與外界環(huán)境間關(guān)系的變化。第二十七頁，共七十七頁，2022年，8月28日基因表達(dá)調(diào)節(jié)的方式啟動(dòng)子強(qiáng)啟動(dòng)子與RNA多聚酶有較強(qiáng)的結(jié)合能力，轉(zhuǎn)錄水平較高；弱啟動(dòng)子則反之。第二十八頁，共七十七頁，2022年，8月28日基因表達(dá)調(diào)節(jié)的方式調(diào)節(jié)蛋白的作用—負(fù)向調(diào)節(jié)—正向調(diào)節(jié)第二十九頁，共七十七頁，2022年，8月28日負(fù)向調(diào)節(jié)乳糖操縱子學(xué)說第三十頁，共七十七頁，2022年，8月28日第三十一頁，共七十七頁，2022年，8月28日第三十二頁，共七十七頁，2022年，8月28日正向調(diào)節(jié)第三十三頁，共七十七頁，2022年，8月28日原核生物基因表達(dá)的調(diào)節(jié)主要在轉(zhuǎn)錄水平第三十四頁，共七十七頁，2022年，8月28日真核基因生物調(diào)節(jié)多層次復(fù)雜性第三十五頁，共七十七頁，2022年，8月28日分子克隆技術(shù)第三十六頁，共七十七頁，2022年，8月28日限制性內(nèi)切酶特定的識(shí)別序列，4~6個(gè)堿基對(duì)在識(shí)別序列內(nèi)固定位置切割，5’–端磷酸基因，

3’-端羥基基團(tuán)切割后形成粘性或平滑末端第三十七頁，共七十七頁，2022年，8月28日第三十八頁，共七十七頁，2022年，8月28日DNA連接酶催化DNA中相鄰3’羥基和5’磷酸基團(tuán)之間形成3’，5’–磷酸二酯鍵。第三十九頁，共七十七頁，2022年，8月28日質(zhì)粒細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立于染色體外的環(huán)狀DNA，能自我復(fù)制其上基因可借助宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯系統(tǒng)得以表達(dá)分子2000~50000bp第四十頁，共七十七頁，2022年，8月28日TpGEM-TVector(3003bp)AmprlacZoriXmnI1994ScaI1875NaeI2695ApaIAatIISphIBstZINcoISacIIT7SpeINotIBstZIPstISaLINdeISacIBstXINsiISP6T1start14202631374655626273758294103112126

pGEM-Tvectormap第四十一頁，共七十七頁，2022年，8月28日XhoISmaIXhoISmaIXhoISmaIpCIpCIA-PpGEM-T/A-P

A-PfragmentSub-cloningconstructionofrecombinantpCIA-PinsertionofA-PDNAfragmentintoplasmidpCIXhoISmaIT4LigaseA-Pfragment第四十二頁，共七十七頁，2022年，8月28日構(gòu)建質(zhì)粒的特點(diǎn)Ori區(qū)：復(fù)制起點(diǎn)Par區(qū)：保證質(zhì)粒均勻分布于子細(xì)胞多克隆區(qū)：人為構(gòu)建，便于克隆操作選擇因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑選第四十三頁，共七十七頁，2022年，8月28日接合在適當(dāng)?shù)臈l件下，雄性菌和雌性菌混合時(shí)形成配對(duì)的雄性-雌性菌，并有遺傳物質(zhì)的單向轉(zhuǎn)移。雄性菌：含F(xiàn)性因子，染色體外環(huán)狀DNA第四十四頁，共七十七頁，2022年，8月28日第四十五頁，共七十七頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化外源DNA能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并通過整合至宿主DNA中或獨(dú)立復(fù)制保存于宿主細(xì)胞內(nèi)。第四十六頁，共七十七頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)錄利用噬菌體為媒介，將供體DNA轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)的現(xiàn)象，能在自然狀態(tài)下發(fā)生。第四十七頁，共七十七頁，2022年，8月28日第四十八頁，共七十七頁，2022年，8月28日分子克隆常用技術(shù)DNA電泳基因轉(zhuǎn)移核酸雜交聚合酶鏈反應(yīng)PCR第四十九頁，共七十七頁，2022年，8月28日DNA電泳可分離不同分子量的DNA第五十頁，共七十七頁，2022年，8月28日第五十一頁，共七十七頁，2022年，8月28日

Ladder1234567891011121314Ladder對(duì)臨床菌株的第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析

Lane1~7:臨床菌株S.sobrinus;Lane8~14:臨床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW第五十二頁，共七十七頁，2022年，8月28日核酸雜交原理：在一定條件下（溫度、pH值等）DNA雙股螺旋可解開并分離在一定條件下，兩股游離的互補(bǔ)的核苷酸可自行配對(duì)形成雙股第五十三頁，共七十七頁，2022年，8月28日SouthernBlot電泳、轉(zhuǎn)移、雜交確定分子量第五十四頁，共七十七頁，2022年，8月28日第五十五頁，共七十七頁，2022年，8月28日第五十六頁，共七十七頁，2022年，8月28日斑點(diǎn)雜交目標(biāo)序列的存在目標(biāo)序列的量第五十七頁，共七十七頁，2022年，8月28日聚合酶鏈反應(yīng)PCR第五十八頁，共七十七頁，2022年，8月28日與齲病相關(guān)微生物的定量檢測(cè)方法細(xì)菌形態(tài)生化反應(yīng)免疫反應(yīng)分子生物學(xué)方法----分子探針雜交----RFLP----PCR唾液在與齲病相關(guān)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用第五十九頁，共七十七頁，2022年，8月28日在人類口腔中檢出率很高茸毛鏈球菌可能比變形鏈球菌與齲損活躍性之間的關(guān)系更密切變形鏈球菌和茸毛鏈球菌唾液在與齲病相關(guān)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用第六十頁，共七十七頁，2022年，8月28日套式PCR快速檢測(cè)人類唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌.譚海平，邊專，樊明文，陳智，范兵.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2003，38：223-226唾液在與齲病相關(guān)微生物檢測(cè)中的應(yīng)用第六十一頁，共七十七頁，2022年，8月28日套式PCR(NestedPCR)5′3′

TemplateOuterprimer2Outerprimer1ThefirstPCR5′

3′

Interprimer2Interprimer1NexttemplateThesecondPCR5′

3′

ThesecondPCRproduct第六十二頁，共七十七頁，2022年，8月28日本套式PCR的引物是分別根據(jù)變形鏈球菌gtfB基因和茸毛鏈球菌gtfI基因設(shè)計(jì)的內(nèi)、外兩套引物（outerprimer,interprimer）gtfBgeneofS.mutansOuterprimerthp4Outerprimerthp3ThefirstPCRInterprimerthp8Interprimerthp7Outerprimerthp6gtfIgeneofS.sobrinusOuterprimerthp5ThefirstPCRInterprimerthp10Interprimerthp9ThesecondPCRThesecondPCR

第六十三頁，共七十七頁，2022年，8月28日抽提細(xì)菌染色體DNA(Igarashietal.1996)----細(xì)菌----唾液PCR反應(yīng)過程第一次PCR反應(yīng)

預(yù)變性:94℃4min

變性:94℃1min

退火:51℃1min30cycles

延伸:72℃2min

最后延伸:72℃5min

第二次PCR反應(yīng)第六十四頁，共七十七頁，2022年，8月28日

abcdefghLadder12345678選擇外引物行第一次PCR后擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析以變鏈菌組(MutansStreptococci)染色體DNA為模板

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7;6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.

MW(Kb)2.01.00.250.10.750.5第六十五頁，共七十七頁，2022年，8月28日

abcdefghLadder12345678選擇內(nèi)引物行第二次PCR后擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析

Lane1:S.cricetusAHT;2.S.rattusBHT;3.S.mutansIngbritt;4.S.sobrinusOMZ176;5.S.mutansLM-7:6.S.mutansOMZ175;7.S.sobrinus6715;8.S.downeiMfe28.Marker:DL2,000Ladder

MW(Kb)2.00.750.51.00.250.1第六十六頁，共七十七頁，2022年，8月28日

Ladder123456第一次PCR的靈敏度

變形鏈球菌S.mutansIngbritt的數(shù)量

Lane1:108CFU;Lane2:107CFU;Lane3:106CFU;Lane4:105CFUMW(Kb)2.00.750.51.00.25第六十七頁，共七十七頁，2022年，8月28日

2.0

0.5

Ladder1234561.00.750.25MW(Kb)第二次PCR的靈敏度

變形鏈球菌S.mutansIngbritt的數(shù)量

Lane1:104CFU,Lane2:103CFU

第六十八頁，共七十七頁，2022年，8月28日

Ladder1234567891011121314Ladder對(duì)臨床菌株的第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜分析

Lane1~7:臨床菌株S.sobrinus;Lane8~14:臨床菌株S.mutans.(Kb)2.01.00.250.10.750.5MW第六十九頁，共七十七頁，2022年，8月28日

Ladder12345LadderMW1.0(Kb)0.750.50.250.1