基因治療生物化學(xué)

基因治療生物化學(xué)1第一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日一、基因治療的類型

1.基因調(diào)控治療從基因水平調(diào)控缺陷基因表達(dá)，改善癥狀鐮型細(xì)胞貧血癥---用5-氮胞苷抑制甲基化酶，使因甲基化而關(guān)閉的γ基因重新開放，產(chǎn)生HbF代替HbA用反義RNA抑制基因表達(dá)核酶（ribozyme）切割RNA阻斷基因表達(dá)腫瘤治療，在基因水平抑制腫瘤細(xì)胞基因惡性表達(dá)和引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)。2第二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日基因治療的類型（續(xù)）

2.基因矯正治療

基因增補(bǔ)—正常基因?qū)牖颊唧w內(nèi)補(bǔ)償缺陷基因功能基因替換—以正?；蛉〈儺惢蚧蛐Ｕw外對(duì)異常基因進(jìn)行糾正。3第三頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日基因治療的類型（續(xù)）按矯正基因的類型分為兩種基因治療：

·生殖細(xì)胞基因治療

—對(duì)生殖細(xì)胞或早期胚胎細(xì)胞進(jìn)行基因矯正。

·體細(xì)胞基因治療

—以體細(xì)胞為受體細(xì)胞，不影響下一代常用細(xì)胞介導(dǎo)法：選擇靶細(xì)胞在體外進(jìn)行基因修飾，再將其輸入體內(nèi)。4第四頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日基因置換（genereplacement）

定義：將特定目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過定位重組，導(dǎo)入的正?；颍灾脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因。

目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。對(duì)缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。5第五頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日定向整合的條件:轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與基因組DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)，進(jìn)行部分基因序列的交換?；蛲粗亟M技術(shù)又稱為基因打靶(genetargeting）細(xì)胞內(nèi)基因同源重組的發(fā)生率很低。基因同源重組技術(shù)6第六頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日基因增補(bǔ)（geneaugmentation）

定義:通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。類型:有缺陷基因細(xì)胞中導(dǎo)入正?；?，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。7第七頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日基因干預(yù)（geneinterference）基因失活

定義：采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。8第八頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日（一）反義RNA（antisenseRNA）

1.反義RNA與基因表達(dá)調(diào)控利用反義RNA對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控，通常采用的方法有兩種：

（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。（2）構(gòu)建一些能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用。9第九頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù)①受體介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；②被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護(hù)層,可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。借助前述的受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法，可以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義RNA轉(zhuǎn)移。10第十頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日反義RNA的優(yōu)點(diǎn)

受體介導(dǎo)的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點(diǎn)，而在一定程度上補(bǔ)充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。

（l）安全性高（2）反義RNA設(shè)計(jì)和制備方便

（3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)

（4）能直接作用于一些RNA病毒11第十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日核酶(ribozyme)

天然核酶多為單一的RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由兩個(gè)RNA分子組成。在基因治療時(shí)，利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)?shù)牟课?，形成錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNA分子切斷，通過破壞靶RNA分子而達(dá)到治療疾病的目的。

12第十二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日核酶錘頭狀的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)只要兩個(gè)RNA分子通過互補(bǔ)序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)（3個(gè)螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個(gè)或11個(gè)保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)。目錄13第十三頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日1.核酶的設(shè)計(jì)核酶是通過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個(gè)方面來設(shè)計(jì)核酶。

（1）選擇合適的靶部位，該部位具有核酶切割位點(diǎn)，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。（2）核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個(gè)部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。14第十四頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日干擾RNA

1.RNA干擾現(xiàn)象RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。有義RNA（senseRNA）或反義RNA（antisenseRNA）均能抑制線蟲基因的表達(dá)，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。這與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。而且其抑制基因表達(dá)的效率比反義RNA至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。

15第十五頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日2.RNA干擾的機(jī)制

RNA干擾過程主要有2個(gè)步驟：

（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。16第十六頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日研究基因功能的新工具

由于RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。

RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達(dá)，建立多種表型；抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段。

17第十七頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日1.體外化學(xué)合成;2.用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地生成。siRNA的產(chǎn)生18第十八頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日定義：將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。應(yīng)用：是惡性腫瘤基因治療的主要方法。（四）自殺基因治療(SuicideGeneTherapy)19第十九頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日

（五）基因免疫調(diào)節(jié)通過將抗癌免疫增強(qiáng)的細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)。20第二十頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日二、基因治療的條件

·對(duì)導(dǎo)入的基因及其產(chǎn)物有詳盡了解；

·外源基因有效導(dǎo)入受體細(xì)胞、穩(wěn)定整合、適量表達(dá)；

·不影響受治細(xì)胞基因組及表達(dá)調(diào)控；

導(dǎo)入基因方法安全，載體對(duì)靶細(xì)胞無害；21第二十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日三、基因治療的原則對(duì)象是病情嚴(yán)重、預(yù)后差、別無他法的患者轉(zhuǎn)移的基因被克隆無需高水平表達(dá)和精確定量控制就有治療效果靶細(xì)胞獲取或回輸安全轉(zhuǎn)移基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞微環(huán)境無嚴(yán)格特異性要求22第二十二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日四、基因療法的步驟

目的（治療）基因的選擇根據(jù)基因治療類型選擇相應(yīng)目的基因（增補(bǔ)、替換、添加）基因載體的構(gòu)建使目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)高效、可控、穩(wěn)定地表達(dá)

受體細(xì)胞選擇易分離獲取，體外增殖存活，大量擴(kuò)增。如成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞23第二十三頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日

基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)方法

1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移2.非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移24第二十四頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日

1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移效率較高據(jù)統(tǒng)計(jì)，有72%的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是反轉(zhuǎn)錄病毒載體。25第二十五頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期（1）反轉(zhuǎn)錄病毒

26第二十六頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日

（2）腺病毒(adenovirus)載體

通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。27第二十七頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日常用基因治療載體

整合致病性感染細(xì)胞克隆容量反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨機(jī)整合，效率高可能致病分裂細(xì)胞<7kb腺病毒載體不整合，可能丟失不致病分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞

腺相關(guān)病毒載體定點(diǎn)整合(19號(hào)染色體特定區(qū)域)不致病分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞<5kb<7.5kb28第二十八頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日2.非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉?；驹?利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。

29第二十九頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日（2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)

將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽(yáng)離子（如多聚賴氨酸）來實(shí)現(xiàn)。多聚陽(yáng)離子與配體共價(jià)連接后，又通過電荷相互作用與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復(fù)合物可被帶有特異性受體的靶細(xì)胞吞飲，從而將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。30第三十頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日

（3）基因直接注射技術(shù)

不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露DNA注入動(dòng)物肌肉或某些器官組織內(nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。

將促進(jìn)心臟血管生長(zhǎng)的基因直接注入實(shí)驗(yàn)鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加30%～40%；將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素；肌內(nèi)注射凝血因子Ⅸ基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子Ⅸ。31第三十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日

基因直接注射法的優(yōu)點(diǎn)制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容易；排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用；導(dǎo)入的基因不需整合即可表達(dá)，避免了反轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點(diǎn)；基因直接注射法可反復(fù)使用，而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復(fù)治療效果下降。

32第三十二頁(yè)，共三十四頁(yè)，2022年，8月28日五、基因治療的應(yīng)用治療惡性腫瘤

治療黑色素瘤--將已導(dǎo)入IL2基因的TIL細(xì)胞回輸給病人，啟動(dòng)自身免疫治療艾滋病--用射線照射已導(dǎo)入HIV基因的成纖維細(xì)胞，細(xì)胞停止分化，但能產(chǎn)生gp160，將細(xì)胞回輸給病人，能激活免疫系統(tǒng)，殺傷HIV感染細(xì)胞。治療家族性高膽固醇血癥（FH）

肝細(xì)胞低密度脂蛋白（LDL）受體基因混亂造成，將LDL基因?qū)氩∪穗x體培養(yǎng)的肝細(xì)胞，然后經(jīng)導(dǎo)管注入門脈循環(huán)，進(jìn)入肝細(xì)胞后表達(dá)相應(yīng)功能蛋白。