生化課件華科-上蛋白質(zhì)

HCO+ O 蛋白質(zhì)(Protein)復習:肽肽一肽（peptide）多肽肽的理化性蛋白質(zhì)一級結肽的固相合1.11.1連接方式：肽鍵(peptidebond個氨基酸的羧基與另OOHHNHCCOH HNHCCOH O H HNCCNHCCNCCNHCC氨基酸順N-末端ASHC-FVC氨基酸殘基(aminoresidue)肽肽鏈方向性（從N末端指向C末端肽鍵具有部分雙鍵的肽鍵不可自由旋轉 NHCO及Ca、Cb共平面（肽平面）肽鍵比一般碳-氮單鍵短（肽鍵中的C-N鍵長為0.132nm，介于0.148nm（C-N）和0.127nm（C=N）之間肽肽肽肽一肽（peptide）多 兩個氨基酸縮合形成二肽，三個氨基酸縮合形成三肽由幾個至十幾個基酸相連而的肽稱為寡ip),由 的氨基酸連形成的肽為多ppd)1.2肽的理化性質(zhì)①肽鍵中的游離末端α-H、α-CH及側鏈R基上的可解離基團pKaα-羧基的pKa值比游離氨基酸的大，末端⑤雙縮尿反應：兩個或兩個以上肽鍵化合物與CuSO堿性溶液1.21.2肽的理化性質(zhì)⑥肽的水解非特異水解H+、OH-（高溫）如6NHCl11012-24h完全水解，即所有的H如：rpin、Ppin等 非特異：如肼肽二硫生物活性肽肽類激素：催產(chǎn)素、加壓素抗生素：短桿菌肽S神經(jīng)肽：腦啡Phe短桿菌肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Leu-腦啡GlnS+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Met-腦啡Gly加壓美籍化學家VincentduVgneaud已美籍化學家VincentduVgneaud已ILe正是由于這項成果，Vincent GlnSGly1.3蛋白質(zhì)一級結構（primarystructure)：指蛋白質(zhì)的多肽鏈中氨基酸的排列順序；主要靠肽鍵維系，有些包含二硫鍵。1.31.3測定蛋白質(zhì)的一級結構的要樣品必需純（>97%以上知道蛋白質(zhì)的分子量（誤差蛋白質(zhì)一級結構(Primarystructure)測定包括：多肽鏈的氨基酸順多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目能的基礎。1.3氨基酸序列測定的第一人:FSng 1.31.3獎人工合成胰島素就成了一項世界性的熱門課題據(jù)，1955- ，在世界范圍內(nèi)共有10研究1958年開始研究，1965年，中國世界上首次成功人工合成胰島素， 了中國科學工作者歷經(jīng)八年的科研關，奪得了這項科學競賽的“世界冠軍”。1.3蛋白質(zhì)順序測定基1.3鑒定多肽鏈的N-末端和C1.3鑒定多肽鏈的N-末端和C利 肽重建完整多肽鏈的一級結1.3多聚蛋白質(zhì)（雜多聚蛋白質(zhì)）:：8mol/L，6mol/L1.31.31.3.3.二硫鍵的過甲酸氧化法：將二硫鍵氧化成磺酸基1.31.31.3.4.完全水解：酸水解是主要方法，多用HCl，同時輔以堿水解；所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破壞，Ser，Thr，Tyr部分破壞，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu。---計算各種氨基酸殘基的數(shù)目或比例R+HNCHRSOHNCH RSOHNCHC1.31.3.5.鑒定多肽鏈的N-末端和C-末二硝基氟苯（DNFB）法：肽游離末端NH與DNFB反應生DNP-肽，最后水解生成黃色DNP-氨基N-末端測丹磺酰氯（DNS）法：用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基丹磺酰氯（DNS）法(強熒光，檢測靈敏度可以達到1X10-CH CHCH CHBrS+C甲基硫酸HCSC....NCCHNHHHCO...NCCN+H 溴化亞氨內(nèi)酯....NCCNH CHC...NCCHH++HNO肽酰高絲氨酸內(nèi)酯(C-末端肽段)(N-末端肽段)1.31.3.5N-末端和C肼解法：最重要，肽與肼反應，除C-末端氨基酸，其他氨基酸轉變?yōu)榘被狨ｋ禄?。肼化物能夠與苯縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。羧肽酶AProArg羧肽酶法：最有效、羧肽酶B:Arg羧肽酶HO HOOHNCCNCNHCCNCCNHCCHRRR100HNCCNHNH +HNCCNHNH+NHCCHHH n-1個氨基酸酰 氨基1.31.3.6. 糜蛋白酶(chymotrypsin)：斷裂Tyr，Leu酶裂解：胃蛋白酶(pepsin)：在酸性條件穩(wěn)定，肽鍵兩側均為疏水氨基酸。在確定二硫鍵位置時，常用到此酶。葡萄球菌蛋白酶(thermolysin)：專一斷裂Glu（化學裂解：溴化（CNBr）：只斷裂Met1.3.61.3.6.多肽鏈的裂解溴化水解法：選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的1.31.3.7.測定各肽段的氨基酸(1)Edan化學降解法：用Edman試劑PC與游離氨基作用生成PTH-氨基酸，并可用各種層析技術分離；用此法降解，一次可連續(xù)測出60-0個氨基酸基的序列；作量大，作麻煩；現(xiàn)改用蛋白質(zhì) 儀。肽段的基 (2)由核苷酸序列推定(3)質(zhì)譜法1.31.31.3.7.(1)Edman化學降解法：偶聯(lián)反 轉化反 1.3例如：知道一部分氨基酸序列就容易找到并分離相應 建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 蛋白質(zhì)信息庫序列數(shù)歐洲歐洲分子生物學數(shù)據(jù)1.31.3.7.質(zhì)譜儀能夠準確地測量肽段和蛋白質(zhì)的相對分子量、氨基酸序列及翻譯后修飾等結構信息，甚至可以對蛋白質(zhì)進行相對或者絕對定量。質(zhì)譜技術很靈活，能與多種蛋白分離、捕獲技1.31.3.7.質(zhì)譜儀能夠準確地測量肽段和蛋白質(zhì)的相對分子量、氨基酸序列及翻譯后修飾等結構信息，甚至可以對蛋白質(zhì)進行相對或者絕對定量。質(zhì)譜技術很靈活，能與多種蛋白分離、捕獲技質(zhì)譜技術能快速的鑒定大量的蛋白質(zhì)，并且質(zhì)譜技術的靈敏度也非常高。質(zhì)譜技術的這些優(yōu)點使其成為蛋白質(zhì)組學領域的主流技術。1.31.3.7.通通過測定電離后的肽段或者其碎片離子的質(zhì)荷（m/z）來對蛋白質(zhì)的組成成分和結構進行分析基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行（MALDI-TOF-電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MALDI-TOF-基本原理：將分析物分散在基質(zhì)(Matrx)分子中并形成共結晶,當用激光(337nm的氮激光)照射晶體時,基質(zhì)分子吸收激光能量與樣品解吸附，基質(zhì)－樣品之間發(fā)生電荷轉移使樣品分子電離基質(zhì)的–相,。MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖中的譜峰與樣品各組分的質(zhì)量數(shù)有一一對應關離子化效率高，是現(xiàn)今靈敏度最高的質(zhì)譜儀質(zhì)量分析范圍：800Da---基本原理：利用高電場使質(zhì)譜進樣端的毛細管柱流出的液滴帶電，在2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電斷重復使最終的液滴非常細小呈噴霧狀，這時液滴表面的電場非常強大，使分析物離子化并以帶單電荷或多電荷的離子的形式進入質(zhì)量分析器。電噴霧電離產(chǎn)生多電荷峰，質(zhì)譜圖顯示離子帶不荷數(shù)的一系列質(zhì)荷比峰[n+，根據(jù)這些峰值換算出離子電荷和分子質(zhì)量。肽質(zhì)量譜（PeptideMass肽質(zhì)量譜（PeptideMassFingerprint， 譜（PeptideFragmentFingerprint，可以提確結構信息，一般是對蛋白未分離或分離效果差的樣品。串聯(lián)質(zhì)譜可以提 確結構信息，一般是對蛋白未分離或分離效果差的樣品。第一級質(zhì)量分析器起質(zhì)量過濾器的作用，從總離子譜中挑選出需進一步進行結構分析的母離子進入碰撞室，母離子在碰撞室內(nèi)經(jīng)高流速惰性氣體碰撞誘導離解產(chǎn)生碎片離子/ 搜庫是目前主要的數(shù)據(jù)處理把實驗圖譜與數(shù)據(jù)庫中的每個肽段的理論圖譜進行比較并且按照一定的打分算法進行打分，最后給出匹配最好的肽段或者是肽段列表。這種方法假設要鑒定的肽段在數(shù)據(jù)庫中是存在的。這種方法是有效的并且已經(jīng)成功應用于幾個蛋白質(zhì)組計劃。這種方法不適用于目標序列不存在于數(shù)據(jù)庫中的情況，如目標序列來源于一種新的蛋白質(zhì)，存在翻譯后修飾或者DNA錯誤。通過直接分析串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)而得到肽段序列，而不需要搜索數(shù)據(jù)庫。理論上，如果肽段的碎裂是完全的（即肽段的每個肽鍵都碎裂產(chǎn)生碎裂碎片），那么我們可以通過計算同一種離子類型中相鄰碎片的質(zhì)荷比差值而得到整個肽段的序列。1.31.3.8.肽：由于不同的斷裂方法即斷裂的專一性不同，產(chǎn)生的切口彼此錯位，使兩套肽段正好跨過切口而的肽段；獲得肽需要兩種或兩種以上的不同方法斷裂同一多肽樣品，得到兩套或多套肽段例1.31.3.9.胃蛋白酶水解含二硫鍵的蛋白質(zhì)。胃蛋白酶專一低，切點多，得到含有二硫鍵的肽段較小，易分離鑒定第一向電 甲酸氧化（S-S斷裂1.3鑒定多肽鏈的N-末端和C利 肽重建完整多肽鏈的一級結1.41.41.4化學家RobertBruceMerrifield由于肽的固相合成方法，這在方法學上是一個重大的破，所以他獲得了1984化學1.41.4總結:肽的理化蛋白質(zhì)一級結構肽的固相1酸水解和氨基酸組成為Ala21酸水解和氨基酸組成為Ala2Arg，Lys2，Phe，Ser羧肽酶A水解得一氨基酸為胰蛋白酶水解得四個肽段，其氨基酸組成如下：①Ala，Arg②Lys，Phe，Ser③Lys④A1a，Met，溴化水解得兩個肽段，其氨基酸組成如下Arg，Ala，Met，Phe，Ser②A1a，Ser①A1a，Arg，Ser②Ala，Lys，Met，Phe，Ser 第四組：肖慶宇 、吳雪靜、王洋