膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)及應(yīng)用

膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用【摘要】的建立?！娟P(guān)鍵詞】膠質(zhì)瘤；細(xì)胞培養(yǎng)；應(yīng)用9%的人類腫瘤是腦腫瘤，而腦腫瘤中90%是膠質(zhì)瘤。腦膠質(zhì)瘤是來源9~12個(gè)月［2］，而且這些患者是經(jīng)過積極治療的，包括外科切除、放療、化療等。這些治療的失敗部分歸咎于膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長以及與周圍正常腦組織交錯(cuò)同時(shí)由于其異常的生物學(xué)特性，對(duì)放、化療的抗拒，導(dǎo)致術(shù)后放、化療失敗；而且經(jīng)常以同級(jí)別或高級(jí)別復(fù)發(fā)。因此需要開辟新的治療方法如生物治療研究的條膠質(zhì)瘤的歷史1925年，F(xiàn)ish培養(yǎng)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞獲得成功，開創(chuàng)了體外研究膠質(zhì)瘤的先河。Manuelidis于1959年建立的世界上第1個(gè)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株TC178，使體外長期連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞成為可能。20世紀(jì)70年代以來，隨著基礎(chǔ)培養(yǎng)技術(shù)的迅猛發(fā)展，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)和克隆技術(shù)日趨成熟近年來更是探索出許多新的培養(yǎng)方法并應(yīng)用于各項(xiàng)研究。 目前膠質(zhì)瘤的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)比較成熟已經(jīng)建立了許多膠質(zhì)瘤品系如國內(nèi)的人腦惡性膠質(zhì)瘤體細(xì)胞系SHG-4是1980年取材于額星形細(xì)胞的組織塊經(jīng)胰酶消化單層靜止培養(yǎng)而成的細(xì)胞形態(tài)有星形梭形流式細(xì)胞光度儀測定此細(xì)胞以四倍體為主G1期占54.57%S期占15.17%G2/M期占免疫組化提示本細(xì)胞中存在S-100和存于蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)明確的膠質(zhì)瘤細(xì)胞（株）有許多，有人型、鼠型等，如U251U87U118、T98TJ899TJ905D54NT325、CHG5BT325、9LC6等，而且今后還會(huì)不斷建立新的品系。目前常用培養(yǎng)方法及應(yīng)用現(xiàn)有的膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)形式主要有：單層細(xì)胞培養(yǎng)、三維/立體培養(yǎng)及聯(lián)合培養(yǎng)等。單層及應(yīng)用傳統(tǒng)意義上的單層細(xì)胞培養(yǎng)可以分為原代培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)兩類。前者是從供體獲得組織后的初次培養(yǎng)，后者一般為利用現(xiàn)有的細(xì)胞系（株）。兩種多采用細(xì)胞由于連續(xù)傳代，細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生了一定的變化，傳代代數(shù)越多，發(fā)生的變化越大因而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響原代培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)相對(duì)要復(fù)雜得多而且培養(yǎng)成功率較低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此不為許多研究者選用；但原代細(xì)胞剛離體，在形狀、結(jié)構(gòu)、功能等面與體內(nèi)細(xì)胞更接近相對(duì)能更好地代表其來源組織的細(xì)胞類型及組織特異性更好地保留膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性更接近也更能反映體內(nèi)生長特性所以原代培養(yǎng)出的細(xì)胞更適合做藥物敏感實(shí)驗(yàn)放射敏感實(shí)驗(yàn)等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。 原代單層細(xì)胞培養(yǎng)常用的方法有組織塊原代培養(yǎng)以及單細(xì)胞懸液法培養(yǎng)。前者是將膠質(zhì)瘤組織塊貼附在培養(yǎng)瓶（板）上，一1~2天就會(huì)有細(xì)胞從組織塊邊緣游出利用游出的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后者是將組織塊通過機(jī)械分離或酶消化法或者二者結(jié)合的方法分離成單細(xì)胞懸液再接種于培養(yǎng)（板進(jìn)行培養(yǎng)的方法［6,7］。 傳代單細(xì)胞培的方法相對(duì)簡單一些，只需將需要傳代的細(xì)胞用胰蛋白酶消化吹打后，按需要接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，補(bǔ)足培養(yǎng)液即可。 以上為傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法在此基礎(chǔ)上又發(fā)展出一些培養(yǎng)方法如單細(xì)胞分離培養(yǎng)法加支持物培養(yǎng)法、球體細(xì)胞培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)法等。單細(xì)胞分離培養(yǎng)也就是克隆培養(yǎng)，國內(nèi)孫立軍、黃強(qiáng)等已經(jīng)通過對(duì)SHG-44細(xì)胞單克隆化，建立了具有低、中、高3種不同分化程度的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株。加支持物培養(yǎng)法是為實(shí)研究或便于觀察而預(yù)先向培養(yǎng)/板內(nèi)加入支持物；如為了做細(xì)胞免疫組化預(yù)先在培養(yǎng)板內(nèi)放入小玻片再培養(yǎng)細(xì)胞待細(xì)胞長在玻片上取出固定染色也稱為爬片球體細(xì)胞培養(yǎng)是將長成片的細(xì)胞移入不易貼附的底物上則細(xì)胞片能卷聚生長成球形懸浮培養(yǎng)法顧名思義就是讓原本貼壁生長的細(xì)胞懸浮生長李茗初運(yùn)用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系從中分離出該細(xì)胞系干細(xì)。 單層細(xì)胞培養(yǎng)是目前最常用的一種培養(yǎng)方式，已廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)基礎(chǔ)研究。在點(diǎn)，如MO54對(duì)輻射敏感，而T98則對(duì)輻射抵抗U251U118MGT-98G表達(dá)突變型p53，而U87D54A172CCF-STTG1細(xì)胞表達(dá)野生型p53。針對(duì)不同細(xì)胞系Ostruszka等在研究細(xì)胞周期進(jìn)程2,2-(2′,2′-difluoro-2′-deoxycytidine;敏感性2種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251U251dFdCyd的細(xì)胞毒性也是U251U251表達(dá)突變型D54細(xì)胞表達(dá)野生型p53，在D54細(xì)胞聯(lián)合dFdCyd和電離輻射后，突出表現(xiàn)在G1期阻滯。Chen等在研究DB-67作為一種新型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶具有靶向輻射增敏劑的研究中也運(yùn)用了表達(dá)野生型p53和突變型p53的D54-MG和T-98GShono-p53(Ad-p53)導(dǎo)入表達(dá)突變型p53的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251U373和表達(dá)野生型p53的U87D54能通過增加表達(dá)野生型p53膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡趨Ad-p53轉(zhuǎn)染的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞所誘導(dǎo)的凋亡和磷酸化區(qū)域特異性的位點(diǎn)相關(guān)。在化療藥物研究中的應(yīng)用膠質(zhì)瘤化療效果差，這主要與缺乏有效的化療藥、全身化療時(shí)化療藥難以通過血腦屏障以及腫瘤耐藥有關(guān)因此膠質(zhì)細(xì)胞培廣泛應(yīng)用于新開發(fā)。 Das等［14］用U87-MG研究地塞米松能夠通過維持Bax:Bcl比率來保護(hù)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG免于遭受替莫唑胺誘導(dǎo)的凋亡，提示膠質(zhì)瘤患者接受替莫唑胺化療之前Landen等那可丁通過血腦屏障及抑制膠質(zhì)瘤生長時(shí)利用鼠C6，證明那可丁可以抑制C6細(xì)胞劑相比較，來作為體外測定那可丁通過血腦屏障的方法。在生物和基因治療研究中的應(yīng)用生物治療主要是通過調(diào)動(dòng)宿主天然防衛(wèi)機(jī)制或給予機(jī)體某些物質(zhì)來取得抗腫瘤效應(yīng)對(duì)抗腫瘤防御機(jī)制的基礎(chǔ)理論的深入了解以及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的不斷發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用使得生物治療前景廣闊BRMs大致有以下幾類：天然或基因重組細(xì)胞因子抗腫瘤的各類體細(xì)胞和輔助性的造血干細(xì)胞抗體、基因治療、腫瘤疫苗、血生成藥細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑、某些菌類及其有效成分、植物藥包括中藥的有成分有機(jī)酸及小分子合成劑其他類型。 隨著生物治療研究的不斷升溫，膠質(zhì)瘤細(xì)胞培已廣泛應(yīng)用于膠質(zhì)瘤生物治療的許多方面，如等［16］利用人膠質(zhì)細(xì)胞系和鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL261和SMA-560研究NKG2D，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的配體激活免疫受體NKG2D刺激由NK、γδT和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫。人膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)NKG2D的配體MICA、MICB和一些UL16-結(jié)合蛋白家族，然而膠質(zhì)瘤細(xì)胞因?yàn)楦弑硇蚆HC抗原而抵抗NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用體實(shí)中質(zhì)粒介導(dǎo)或腺病毒介導(dǎo)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞過表達(dá)的MICA可提高它們對(duì)NK和T細(xì)胞的應(yīng)答。 腫瘤疫苗也是當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一制備以及測試抗膠質(zhì)瘤疫苗都需要膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)如利用膠質(zhì)瘤細(xì)胞致敏樹突狀細(xì)胞cells，DCs）制備膠質(zhì)瘤疫苗Driessens等發(fā)現(xiàn)被γ射線或化療藥（順鉑和絲裂霉素）作用后凋亡的膠質(zhì)瘤9L細(xì)胞聯(lián)合鼠來源的成熟DCs分泌GM-CSF顯示較好的治療腫瘤潛能Giezeman-Smits等發(fā)現(xiàn)用白介-4(IL-4)轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤9L細(xì)胞制備的腫瘤疫苗能夠誘導(dǎo)親代腫瘤發(fā)生特異的有保護(hù)性的免疫應(yīng)答。 針對(duì)膠質(zhì)瘤基因治療的研究也越來越多，如單純皰疹病毒胸腺激(HSV-TK)基因丙氧鳥(GCV)系統(tǒng)、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(Ec-CD)基/5氟胞嘧啶(5-FC)系統(tǒng)早期生長反應(yīng)基-1啟動(dòng)啟動(dòng)子等［19~22］。在研究中的應(yīng)用培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞還可以用于建立動(dòng)物模型，為研究Prins等通過向C57BL/6雌鼠的腹側(cè)皮下注射GL26膠質(zhì)瘤細(xì)胞以及將GL26膠質(zhì)瘤細(xì)胞立體定向注射于大鼠顱內(nèi)建立鼠膠質(zhì)瘤模型的靶向免疫治療。在其他方面研究中的應(yīng)用膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)除用于上述研究外，還廣泛應(yīng)用于其Zhang等在研究惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞和星型細(xì)胞之間的直接縫隙連接的Joy等［3］利用SF767和T98G研究發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞激活P13-KYamamotoSNB-19D-54MGU87U-373U-118MGSW1088研究N-glycan在調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤遷移和侵襲中的作用。三維（立體）培養(yǎng)及應(yīng)用單層細(xì)胞培養(yǎng)雖然已經(jīng)得以廣泛應(yīng)用，但也有其不足之處：第一，具有遺傳不穩(wěn)定性；第二，是一個(gè)平面結(jié)構(gòu)，而人體是三維立體結(jié)構(gòu)，與人體境相差很遠(yuǎn)針對(duì)這些不足許多科研工作者也嘗試用立體培養(yǎng)因?yàn)榄h(huán)境對(duì)細(xì)胞的生長分化有著至關(guān)重要的作用已有科研證明異位植入的胚胎細(xì)胞能轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞并引發(fā)癌癥，而相同的細(xì)胞在子宮內(nèi)則可形成正常的胚胎相反畸胎瘤細(xì)胞植入胚胎內(nèi)可能經(jīng)歷正常的發(fā)育過程。 與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式相比三維立體培養(yǎng)的細(xì)胞在細(xì)胞形狀和細(xì)胞環(huán)境更接近于活體內(nèi)狀態(tài)而形狀和環(huán)境能決定細(xì)胞的基因表達(dá)和生物學(xué)行為三細(xì)胞培優(yōu)點(diǎn)還在于具有清晰的幾何學(xué)形狀，這使其結(jié)構(gòu)與功能直接相關(guān)，從而可以進(jìn)行理論分析Joki在研究氧化-2的實(shí)中運(yùn)用了三維培養(yǎng)系統(tǒng)證明環(huán)氧化-2抑制劑NS-398對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和遷移有抑制作用。 但是三維立體培養(yǎng)也不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境而且立體培養(yǎng)的模型在目前條件下難以無限生長下去主要是因?yàn)槟Ｐ烷L到一定大小時(shí)由于模型中心缺乏營養(yǎng)或缺氧而壞死。因此如何解決這些問題，還需要進(jìn)一步努力。其他培養(yǎng)方法及應(yīng)用目前培養(yǎng)和應(yīng)用膠質(zhì)瘤細(xì)胞除了單獨(dú)應(yīng)用上述培養(yǎng)方法以外，還有共培養(yǎng)（coculture）方,即將2種或2種以上的細(xì)胞一起培養(yǎng)的方法，其實(shí)質(zhì)也是單細(xì)胞培；也有嘗試2種或幾種方法聯(lián)合應(yīng)用，如同時(shí)選用單層細(xì)胞培養(yǎng)及三維立體培養(yǎng)。 Zhang等將原代培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞和原代培養(yǎng)的鼠星型細(xì)胞共培養(yǎng)并認(rèn)為2種細(xì)胞之間的縫隙連接的形成不是自然的，因?yàn)閷⒛z質(zhì)瘤細(xì)胞注射入活鼠腦內(nèi)很快就能和宿主細(xì)胞功能性耦聯(lián)在一起而且和膠質(zhì)瘤細(xì)胞耦聯(lián)在一起的縫隙連接似乎可以調(diào)節(jié)星型細(xì)胞的表型和膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的星型細(xì)胞表達(dá)Cx43顯著降低并可以低水平表達(dá)GFAP。 Joki等在研究氧化-2實(shí)中除了運(yùn)用三維培養(yǎng)系統(tǒng)外，還運(yùn)用了單層細(xì)胞培養(yǎng)檢測NS-398抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖以及運(yùn)用共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測腫瘤細(xì)胞侵襲入正常鼠腦細(xì)胞。展望的研究。目前除膠質(zhì)瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)以的培養(yǎng)外，還有人通過原代無血清培養(yǎng)、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)以及CD133免疫磁珠分離等方法成功地分離、培養(yǎng)出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)【參考文獻(xiàn)】1］BondyML,WangLE,ElZeinR,etardiationsensitivityandriskofgliomJ.JNatlCancerInst,2001,93(20):1553-1557.［2］HegdeM,RodcoeJ,CalaP,etal.Amiloridekillsmalignantgliomacellsindependentofitsinhibitionofthesodium-hydrogenexchangr.JPharmacolExp2004,310(1):67-74.［3］JoyAM,BeaudryCE,TranNL,etal.MigratinggliomacellsactivatetheP13-KpathwayanddisplaydecreasedsusceptibilitytoJCellSci,2003,(21):4409-4417.［4］HulsebosTJ,TroostD,LeenstraS.Molecular-geneticcharacterizationofgliomasthatrecurassamegradeorhighergradeJNeurolNeurosurgPsychiatry,2004,75(5):723-726.［5］鄂征.組織培養(yǎng)技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用［M］.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2004：8.［6］ZhangW,CouldwellWT,SimardME,etal.DirectgapjunctioncommunicationbetweenmalignantgliomacellsandJCancerRes,1999,59(8):1994-2003.［7］SengerDL,TudanC,GuiotMC,etal.SuppressionofracactivityinducesapoptosisofhumangliomacellsbutnotnormalhumanJCancerRes,2002,62(7):2131-2140.［8］孫立軍，張全斌，黃強(qiáng).三株分化程度不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的建立［J］.實(shí)用腫瘤雜志，2002，17（3）：173-175.［9］李茗初，陳風(fēng)華，鄧永文，等.懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和該細(xì)胞系腦腫瘤干細(xì)胞的分離［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2004，14（24）：57-60.［10］HondaN,YagiK,DingGR,etal.RadiosensitizationbyoverexpressionofnonphosphorylationfromofIκB-αinhumangliomacells［J］.JRadiatRes(Tokyo),2002,43(3):283-292.［11］OstruszkaLJ,ShewachDS.Theroleofcellcycleprogressioninradiosensitizationby2’,2’-difluoro-2’-deixycytidine［J］.CancerRes,2000,60(21):6080-6088.［12］ChenAY,ShihSJ,GarriquesLN,etal.SilatecanDB-67isanovelDNAtopoisomeraseI–targetedradiationsensitizer［J］MolCancer2005,317-324.［13］ShonoT,TofilonPJ,SchaeferTS,etal.Apoptosisinducedbyadenovirus-mediatedp53genetransferinhumangliomacorrelateswithphosphorylation［J］.CancerRes,2002,62(4):1069-1076.［14］DasA,BanikNL,PatelSJ,etal.DexamethasoneprotectedhumanglioblastomaU87MGcellsfromtemozolomideinducedapoptosisbumaintainingBax:Bcl-2ratioandpreventingproteolyticactivities［J］.MolCancer,2004,3(1):36.［15］LandenJW,HauV,WangM,etal.Noscapinecrossestheblood-brainbarrierinhibitsglioblastomaClinCancer2004,10(15):5187-5201.［16］FrieseMA,PlattenM,LutzSZ,etal.MICA/NKG2D-mediatedimmunogenetherapyofexperimentalgliomas［J］ 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