多糖類藥物的分析

多糖類藥物的分析1第一頁，共五十三頁，2022年，8月28日第一節(jié)概述1．從動物來源的多糖。2．從微生物來源的多糖。3．從植物來源的多糖。4.從海洋生物來源的多糖。

2第二頁，共五十三頁，2022年，8月28日組成分類：均一多糖不均一多糖:不同類型的單糖縮合而成粘多糖：含氮的不均一多糖結合糖：肽聚糖、糖蛋白(glycoproteins)和蛋白聚糖糖蛋白通過糖肽鍵(carbohydrate-peptidelinkage)將糖鏈和肽鏈兩部分連接起來,連接方式主要分為β-構型的N-糖苷鍵和α-構型的O-糖苷鍵.3第三頁，共五十三頁，2022年，8月28日糖蛋白有三種主要類型糖蛋白分為三種主要類型：O-糖苷鍵型糖蛋白、N-糖苷鍵型糖蛋白和連有磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白。在大多數(shù)的O-糖苷鍵型糖蛋白中，GalNAc殘基通過O-糖苷鍵與一個絲氨酸或蘇氨酸殘基連接形成，縮寫為GalNAc-Ser/Thr。在N-糖苷鍵型糖蛋白中，GlcNAc殘基通過N-糖苷鍵與一個天冬酰胺殘基相連，縮寫為GlcNAc-Asn。4第四頁，共五十三頁，2022年，8月28日O-糖苷鍵N-糖苷鍵O-（N-）糖苷鍵型糖蛋白5第五頁，共五十三頁，2022年，8月28日磷酸乙醇胺殘基磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白6第六頁，共五十三頁，2022年，8月28日蛋白聚糖

軟骨蛋白聚糖:聚集體的分子量非常大（大約為2×108），其中含有透明質酸、硫酸角質素、硫酸軟骨素、連接蛋白、核心蛋白和大量的寡糖鏈。7第七頁，共五十三頁，2022年，8月28日六員環(huán)糖類似于吡喃，所以又稱之為吡喃糖，而五員環(huán)糖類似于呋喃，稱之為呋喃糖。環(huán)化單糖中氧化數(shù)最高的碳稱為異頭碳。在環(huán)式結構中，異頭碳是手性碳，所以環(huán)化的醛糖或酮糖可以呈現(xiàn)兩種異頭構型中的一種，即-或-構型。

吡喃呋喃多糖組成-單糖8第八頁，共五十三頁，2022年，8月28日葡萄糖環(huán)狀結構9第九頁，共五十三頁，2022年，8月28日椅式構象β-D-葡萄糖α-D-葡萄糖

10第十頁，共五十三頁，2022年，8月28日直鏈淀粉是葡萄糖以α-1，4糖苷鍵結合成的鏈狀化合物

直鏈淀粉11第十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日纖維素12第十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日多糖的理化性質旋光性硫酸蒽酮反應（620nm）硫酸苯酚反應(490nm)氨基己糖——乙酰丙酮(525nm)糖醛酸——硫酸咔唑(520nm)13第十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日第二節(jié)多糖的純度測定

（一）超離心法（二）電泳法（三）凝膠色譜法（四）旋光法14第十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日第三節(jié)多糖的分子量測定

凝膠色譜法粘度法超離心法高效液相色譜15第十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日凝膠層析法凝膠層析法：將分子量不同的蛋白質通過一定孔徑的凝膠固定相，由于各組分流經(jīng)體積的差異，使不同分子量的組分得以分離。最先淋出的是最大的分子。Kd=0，Ve=

V0；Kd=1，Ve=V0+Vi；0＜Kd＜1，Ve=V0+KdVi。16第十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日凝膠色譜法方法：SephadexG-200，多糖標準品分部收集，硫酸-苯酚檢測，分別求得洗脫體積Ve，Ve與1gM之間存在著線性關系，繪制標準曲線。

Ve=-KlogM+C將待測樣品上柱，待測多糖Ve。通過標準曲線求出待測多糖分子量。17第十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日粘度法、超離心法粘度法：用已知結構相似的多糖決定K值（η＝KM2），然后測出待測多糖的特性粘數(shù)η，計算待測多糖的分子量。超離心法：根據(jù)測得的沉降系數(shù)計算多糖的平均分子量。18第十八頁，共五十三頁，2022年，8月28日高效液相色譜法測定分子量及分布色譜條件：凝膠柱（分子量大?。静钫酃鈾z測器。標準曲線：標準曲線：LogMW=a+btRMW為重均分子量，tR為保留時間待測多糖分子量（GPC專用軟件）：重均分子量Mw=∑(RIiMi)/∑RIiMi為供試品在保留時間ti時的分子量，RIi在第i部分中被洗脫物質的量（重量）。

19第十九頁，共五十三頁，2022年，8月28日第四節(jié)、多糖的含量測定比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法）生物測定法（肝素鈉）生色底物法（低分子量肝素鈉）20第二十頁，共五十三頁，2022年，8月28日乙酰丙酮法（elson-morgan）

——氨基己糖原理：氨基己糖在堿性條件下加熱，可與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物，該衍生物與對－二甲氨基苯甲醛反應，反應物呈紅色，于525nm測定吸收度。21第二十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日硫酸咔唑法測糖含量硫酸咔唑法—己糖醛酸測定在濃硫酸中，己糖醛酸與咔唑溶液反應生成的反應物呈紅色。

520nm比色22第二十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日硫酸苯酚法測定糖含量（總糖）原理：多糖在濃硫酸作用下水解成單糖，該單糖在強酸性條件下，與苯酚反應生成橙色衍生物。它在490nm處有最大吸收，其吸光度與濃度呈線性關系。23第二十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日蒽酮法測定糖含量（總糖）原理：多糖在濃硫酸中水解后，進一步脫水生產(chǎn)糠醛類衍生物，與蒽酮作用形成藍色化合物，620nm進行比色測定。特點：10-100μg范圍內其顏色的深淺與糖含量成正比。靈敏度高。24第二十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日生物測定法－肝素測定美國藥典采用羊血漿法。即比較肝素標準品和供試品延長血漿凝結時間的作用來測定肝素的效價。25第二十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日生物測定法——肝素測定方法標準品稀釋液的配制:精密量取標準品溶液，按高、中、低劑量組（

ds1、ds2、ds3）用0.9%氯化鈉溶液配成三種濃度的稀釋液，相鄰兩濃度的比值為1:0.7。供試品稀釋液的配制：按供試品的標示量或估計效價（AT），照標準品溶液與稀釋液的配制法配成高、中、低（

dT1、dT2、dT3）三種濃度的稀釋液。各管凝結時間換算成對數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計法中的量反應平行線測定法計算效價及實驗誤差?？尚畔蘼剩‵L%）不得大于5%。26第二十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日生色底物法原理－肝素、低分子肝素

當?shù)鞍酌福‵Ⅹa）從生色底物分裂出pNA時，發(fā)色物的產(chǎn)生量與剩余的酶量成正比，與肝素效價成反比。405nm測定。27第二十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日生色底物Bz：苯甲酰，Pip：哌啶酰，

Tos：甲苯磺酰；對-硝基苯胺（pNA）。酰胺分解法（amidolyticmethod）。當?shù)鞍酌笍纳孜锓至殉鰌NA時，發(fā)色物的產(chǎn)生量與剩余的酶量成正比，與肝素效價成反比。。405nm測定。28第二十八頁，共五十三頁，2022年，8月28日生色底物法

抗Xa因子活性測定

以溶液吸收度和濃度的對數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計法中量反應平行線測定法計算出供試品的抗Xa因子活性

可信限率(FL%)不得大于10%。

29第二十九頁，共五十三頁，2022年，8月28日第五節(jié)、多糖類藥物的結構分析單糖組成糖苷鍵連接方式糖苷鍵連接位置30第三十頁，共五十三頁，2022年，8月28日（一）多糖組成單糖的分析1、水解方法（1）、完全酸水解法（2）、部分酸水解、堿水解（3）、乙酰解（4）、甲醇解（5）、酶降解2、鑒定31第三十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日（1）、完全酸水解法

水解難易取決單糖性質及構型。呋喃型戊聚糖較吡喃型己聚糖易水解，α型較β型易水解。已聚糖一般用1mol/L硫酸，70℃，8小時。氨基葡聚糖為4mol/L鹽酸，100℃9小時。32第三十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日

（2）、部分酸水解、堿水解選擇溫和的條件水解多糖，使糖鏈中某種類型的鍵特異性地打斷。（3）、乙酰解多糖經(jīng)過乙酰解反應（醋酐、冰醋酸）可生成乙酰化單糖和寡糖33第三十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日（4）、甲醇解多糖鏈在80－100℃條件下與無水甲醇反應能將糖鏈變成組成單糖的甲基糖苷。甲基糖苷能轉化為三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物，進行氣相色譜分析。34第三十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日（5）、酶降解分為外切糖苷酶和內切糖苷酶。外切糖苷酶：切下多糖非還原末端的一個單糖，并對單糖組成和糖苷鍵有專一性要求。內切糖苷酶可水解糖鏈內部的糖苷鍵，釋放多糖鏈片斷以利于結構分析。35第三十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日2、單糖的分離鑒定氣相色譜法高效液相色譜法氣相色譜法與質譜分析連用36第三十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日氣相色譜法常用的衍生物有：

三甲硅烷（TMS）衍生物三氟乙酰（TEA）衍生物乙酰（AC）衍生物甲基（Me）衍生物37第三十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日二、糖苷鍵連接方式的測定紅外光譜——糖苷鍵類型確定吡喃糖糖苷鍵時，用紅外光譜，在890cm-1處有特征吸收者，示有β-型糖苷鍵，在840cm-1處有特征吸收者，示有α-型糖苷鍵。核磁共振譜——糖苷鍵（α型或β型）。H-NMR譜中的化學位移δ5.4和δ5.1，有兩個信號說明分子結構中的糖苷鍵為α型，如有δ4.53說明有β型。38第三十八頁，共五十三頁，2022年，8月28日三、糖苷鍵連接位置的測定（一）、高碘酸氧化、Smith降解（二）、甲基化反應產(chǎn)物分析（三）、乙酰解后質譜分析39第三十九頁，共五十三頁，2022年，8月28日（一）高碘酸氧化、Smith降解原理：選擇性的氧化降解反應，能夠作用于多糖分子中1，2—二羥基和1，2，3—三羥基，生成過碘酸氧化產(chǎn)物；此產(chǎn)物用硼氫化鈉還原后，再用酸水解，生成相應的醛、甲酸。室溫下用稀無機酸水解還原產(chǎn)物。40第四十頁，共五十三頁，2022年，8月28日1，2連接的糖苷鍵1，2連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原得到穩(wěn)定的多羥基化合物，再用稀鹽酸水解，得到甘油及甘油醛。方程式：41第四十一頁，共五十三頁，2022年，8月28日1，3連接的糖苷鍵1，3連接的糖苷鍵與高碘酸不起反應，經(jīng)還原與水解后得到原來的單糖。方程式：42第四十二頁，共五十三頁，2022年，8月28日1，4連接的糖苷鍵1，4連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原，用稀鹽酸水解得到最終產(chǎn)物為赤蘚醇和乙醇醛。43第四十三頁，共五十三頁，2022年，8月28日1，6連接的糖苷鍵1，6連接的糖苷鍵經(jīng)高碘酸氧化后的產(chǎn)物用硼氫化鈉還原得到穩(wěn)定的多羥基化合物，再用稀鹽酸水解，得到甘油及乙醇醛。44第四十四頁，共五十三頁，2022年，8月28日（二）甲基化反應產(chǎn)物分析原理：多糖經(jīng)甲基化試劑作用使分子中的羥基甲基化，然后用甲酸和三氟醋酸水解，以氣相色譜鑒定甲基化水解產(chǎn)物。如多糖分子中帶有支鏈，甲基化水解后可生成二甲基單糖。45第四十五頁，共五十三頁，2022年，8月28日（三）乙?；筚|譜分析原理：多糖經(jīng)過乙酰化反應（醋酐、冰醋酸）生成乙?；瘑翁呛凸烟?。用氯仿抽提，蒸去氯仿，進行質譜分析。分子離子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰單糖碎片峰，表明有支鏈結構。46第四十六頁，共五十三頁，2022年，8月28日實例：右旋糖酐（dextran）右旋糖酐，又稱葡聚糖，是若干個葡萄糖脫水形成的聚合物。微生物多糖，也是第一個工業(yè)化的微生物多糖，是由腸膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides）發(fā)酵產(chǎn)生的。產(chǎn)物的分子量很大，經(jīng)水解后，用不同濃度乙醇多定分級沉淀，得到中、低、小分子量的右旋糖酐成品。臨床上使用的是平均分子量為16000~24000，32000~42000和64000~76000的右旋糖酐20、右旋糖酐40和右旋糖酐70，它們均是用做代血漿。47第四十七頁，共五十三頁，2022年，8月28日一、結構與理化性質右旋糖酐的結構：它主要由葡萄糖（1→6）α-糖苷鍵連接而成，同時含有(1→3)α-和(1→4)α-糖苷鍵連接形成的分支結構。右旋糖酐為白色無定形粉末，無臭、無味，易溶于熱水。右旋糖酐溶于水后形成有一定粘度的膠體溶液，在乙醇等有機溶劑中不溶。48第四十八頁，共五十三頁，2022年，8月28日二、鑒別右旋糖酐經(jīng)堿性水解后產(chǎn)生葡萄糖，葡萄糖可使Cu2+還原為紅色氧化亞銅沉淀。操作方法：取本品0.2g，加水5ml溶解后，加氫氧化鈉試液2ml與硫酸銅試液數(shù)滴，加熱后變成紅棕色沉淀

。49第四十九頁，共五十三頁，2022年，8月28日三、檢查右旋糖酐的檢查項目較多，其中氯化物、重金屬、干燥失重、熾灼殘渣的檢查參見中