D01-動態(tài)光散射與相分析光散射技術(shù)-2014

Introductionto

DynamicLightScatteringand

PhaseAnalysisLightScatteringLightScatteringUniversityWyattTechnologyCorporationCHINA靜態(tài)光散射(SLS):MolarMass,MRmsradius,RgSecondvirialcoefficient,A2動態(tài)光散射(DLS)Translationaldiffusioncoefficient,DtHydrodynamicRadius,Rh相分析光散射(PALS)ElectrophoreticMobilityZetaPotential,EffectiveMolecularCharge,QeffIsoelectricPoint,IE光散射可以測定哪些物理量?分子尺寸:光散射靜態(tài)光散射

(SLS):

RMSRadi均方根半徑

Rg

分子中每一質(zhì)點到質(zhì)心的平均距離檢測下限10nm動態(tài)光散射(DLS)

流體力學(xué)半徑Rh

與樣品分子具有相同擴散系數(shù)的等效球體半徑.檢測下限~0.5nmRh范例:溶菌酶（Lysozyme）LysozymeMw=14,300DaDLS測定：Rh19?構(gòu)象信息:Rhvs.Rg實心球3-臂星形高分子

動態(tài)光散射儀工作原理示意圖DynaproPlateReaderDynamicLS:

研究散射光強度波動StaticLS:

研究分子量與平均

散射光光強度之間關(guān)系DynaproNanoStar,TREOSLasersampleAvalanchePhotodiodeCorrelatorBoardOpticalFiber動態(tài)光散射測定原理:光的干涉分子布朗運動導(dǎo)致光強度波動干涉加強干涉減弱光強度波動粒子擴散速率與其粒子尺寸密切相關(guān)光強度波動分析自相關(guān)函數(shù)

（AutocorrelationFunction）光強度波動光強度波動分析自相關(guān)函數(shù)

（AutocorrelationFunction）光強度波動自相關(guān)函數(shù)Rh=9nmlatexspheresqLaserSample自相關(guān)函數(shù):I0IS散射矢量:Dt:擴散系數(shù)DtT高溫加速粒子運動Dt1/R粒子小運動快Dt1/fs非球面性降低移動性影響平易擴散因素Dt1/fh溶劑與粒子相互作用以及粒子間相互作用增加粘滯力Dt1/粘度效應(yīng)：高粘度溶劑或高濃度樣品內(nèi)在因素分子運動的時間尺度如何由擴散系數(shù)計算Rh?kB–Boltzmann’sconstantT–temperature(Kelvin)

η–viscosityofsolventRh–hydrodynamicradiusStokes-EinsteinRelation粒子尺寸分布擴散時間的分布性導(dǎo)致指數(shù)時間常數(shù)具有分布性單指數(shù)擬合結(jié)果：Rh=20nm!9nm+50nmradiusparticles粒子尺寸分布分析Cumulants:假設(shè)擴散系數(shù)符合高斯分布。采用該擬合法計算其平均值和擴散系數(shù)分布(Rh)Regularization:以指數(shù)的分布擬合數(shù)據(jù)，更真實的表征Rh（單模態(tài)）MonomodalPolydisperseMonodisperse多模態(tài)（Multimodal）PolydisperseMonodisperse范例：Regularization擬合結(jié)果:Peak1:Rh=7nm,width=1nmPeak2:Rh=43nm,width=10nmRh=9nm+50nm

PS乳液粒子受峰寬度影響，regularization擬合法能識別半徑差別~5倍以上不同尺寸粒子。范例:Lysozyme熱穩(wěn)定性-DLS轉(zhuǎn)變溫度75.2°C與Calorimetry(75°C)及CircularDichroism(76°C)一致；整個溫度條件下，恒定的摩爾質(zhì)量表明(SLS測定)Lysozyme發(fā)生去折疊（unfolding）變化而非寡聚。DLS預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)晶單分散性、高純度兩因素與樣品結(jié)晶能力密切相關(guān)。通過改變buffer條件和去除蛋白中大的聚集體，增加結(jié)晶試驗成功可能性。單機

DLS–“現(xiàn)實考驗”Rh檢測下限~0.5nm；上限

~500nm.單機DLS無法區(qū)分單體與較小的聚集體，如二聚體、三聚體等。DLS對含量少，但較大聚集體靈敏度極高，這些大顆粒包括灰塵等。首先確認自相關(guān)函數(shù)擬合效果及形狀的合理性，然后再作進一步尺寸分布數(shù)據(jù)分析。OnlineMALS+DLS(QELS)AvalanchePhotodiodeDigitalCorrelatorSEC-DLS模式測定

Rh

SEC-DLS模式測定:BSA4.3nm3.5nmmonomerdimerBatchDLSOnlineDLStrimer為什么Proteincomplex出峰時間更晚?Complex(Trap-IL4)275kDIL4trap240kD因為具有更緊湊的結(jié)構(gòu)Trap:Rh=7.2nmComplex(Trap-IL4):Rh=6.5nmEmptyliposome,Rg/Rh~1.0Filledliposome,Rg/Rh~0.77FFF技術(shù)表征

Rg/Rh

：了解Liposome結(jié)構(gòu)RgfromMALS

On-LineDLS應(yīng)用范圍最低檢測線：1~10nm能識別單體、二聚體、三聚體等。結(jié)合

Mw，Rg，洗脫體積Ve，判斷構(gòu)象與SEC分離情況。

On-LineDLS：局限性最大測量尺寸取決于流速、光束大小以及檢測角度。

色譜系統(tǒng)中檢測范圍:

1nm<Rh<30nm與靜態(tài)光散射相比，需要更高的濃度。溶劑不能具有較高的光散射能力。4.4nm3.5nmmonomertrimerdimer如何選擇?

SampleThroughputDynaProPlateReaderDynaProNanoStarDLS+MALS

withSeparation

Technique(SEC/FFF)

InformationDetail我們?nèi)绾晤A(yù)測配方溶液和

膠體溶液的穩(wěn)定性？通過DLS測定粒子尺寸與時間的相關(guān)性；測定電泳遷移率（electrophoreticmobility）預(yù)測溶液穩(wěn)定性；

電泳遷移率與以下因素相關(guān)：分子有效電荷；Zeta電位

；等電點（Isoelectricpoint）；溶液中的帶電粒子為什么關(guān)注溶液中粒子帶電性?因電荷而穩(wěn)定存在；預(yù)防配方溶液的聚集；帶電粒子穩(wěn)定性取決于:溶液的pH；溶液的離子強度；非離子添加劑；電泳遷移率帶點分子和粒子在外加電場E作用下運動；電泳遷移率E是單位電場強度下粒子遷移的速率；由E計算可計算粒子有效電荷Qeff與zeta電位

；++++++++++++++--------------+QvE我們?nèi)绾螠y定電泳遷移率?+V-VReferencebeam+-Q+QPhasemodulationScatteredLightDetectorDetectorArray動態(tài)光散射技術(shù)(DLS)布朗運動對電泳遷移率不敏感激光多普勒測速法（LaserDopplerVelocimetry，LDV）電泳遷移率無法區(qū)分正負電荷相分析光散射技術(shù)(PALS)電泳遷移率+

電荷高電場強度+長時間測量可能破壞樣品大規(guī)模并行相分析光散射技術(shù)(MP-PALS)電泳遷移率+

電荷+并行檢測高靈敏度+低電場使測定敏感高分子成為可能：

Lysozyme：1mg/mL!M?biu等電點測定pI