玉鈴花種子生物學(xué)特性研究材料與方法,園藝學(xué)論文

玉鈴花種子生物學(xué)特性研究材料與方法,園藝學(xué)論文【題目】【1.1】【1.2】【第二章】玉鈴花種子生物學(xué)特性研究材料與方式方法【第三章】【第四章】【結(jié)論/以下為參考文獻(xiàn)】2.材料與方式方法2.1實驗材料實驗用玉鈴花種子采自河南，在成年玉鈴花樹上采集果實，經(jīng)晾曬揉搓得到種子，去雜備用。測種子生活力種子為大白菜種子。2.2實驗設(shè)計與研究方式方法2.2.1種子生物學(xué)特性研究2.2.1.1種子的形態(tài)特征隨機(jī)抽取50粒玉鈴花種子，觀察其形狀、顏色、質(zhì)感、光滑度等方面，總結(jié)種子的形態(tài)特征。用游標(biāo)卡尺測定種子的橫軸直徑〔W〕、縱軸直徑〔L〕、種子厚度，計算其平均值。采用千粒法測定玉鈴花種子的千粒重，采用四分法隨機(jī)抽取1000粒種子為一組，共取3組，分別用1/1000天平稱重,讀數(shù)精到準(zhǔn)確到小數(shù)點后兩位，計算三個數(shù)的平均值即為種子的千粒重。2.2.1.2種子的含水量采用105℃烘箱法測定玉鈴花種子中自由水的含量。測定時，取適量玉鈴花種子，精到準(zhǔn)確稱重〔W1〕后，于80℃恒溫枯燥箱內(nèi)預(yù)烘2-3h,然后于105士2℃烘至重量不再變化，冷卻后稱重〔W2〕，則種子相對含水量的計算公式為：相對含水量〔RWC〕=〔W1-W2〕/W12.2.1.3種子生活力測定采用TTC染色法快速測定種子生活力。隨機(jī)選取種子，設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)取50粒種子。將待測種子用水浸泡24h,待種子充分吸脹后，用單面刀片沿胚乳〔胚〕的中線縱切成均等的兩半，將華而不實一半放在培養(yǎng)皿中，參加適量的0.5%TTC溶液，以淹沒種子為標(biāo)準(zhǔn)，將另一半在沸水中煮5min殺死胚，然后置于40℃染色6h,用自來水反復(fù)沖洗種子，直至所染顏色不再洗出為止，觀察種子胚部的染色情況，算出具有生活力的種子百分率。對玉鈴花種子生活力測定的判讀根據(jù)下面標(biāo)準(zhǔn)：○1有生活力種子：胚和胚乳全部正常染色；胚全部被染色，胚乳少量未染色?！?無生活力種子：胚和胚乳全部未染色；胚全部染色，胚乳未染色；胚未染色，胚乳大部分染色。2.2.2種子休眠原因2.2.2.1種子透水性測定通過繪制種子吸水曲線圖測定種子透水性。分別隨機(jī)抽取完好種子、破皮種子〔將種皮敲出一條裂縫〕各50粒，稱重后放在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中，用去離子水浸泡種子。每隔兩小時取出種子〔12h后，每12h取一次〕，用吸水紙吸干種子外表的水分，在1/1000電子天平上稱重，直至種子重量不再變化為止。每處理設(shè)置3個重復(fù)，計算其吸水率。吸水率〔%〕=〔吸水后質(zhì)量〔g〕-吸水前質(zhì)量〔g〕〕/吸水前質(zhì)量〔g〕100%2.2.2.2種子各部分萌發(fā)抑制物的生物測定取飽滿玉鈴花種子，將種皮和胚乳〔含胚〕分開后，分別稱取2.5g,用液氮迅速冷凍，用5ml80%的甲醇研磨，將研磨液分別倒入100ml錐形瓶中，再各用80%甲醇屢次清洗16研缽，將研磨液與清洗液合并，倒入同一錐形瓶中，最后以80%甲醇分別定容至50ml,搖勻后,用封口膜封口，放入4℃震蕩培養(yǎng)箱中浸提，,浸提48小時后取出，在4℃6000rpm條件下離心1min,離心后將上清液倒入150ml錐形瓶中，沉淀再以80%甲醇定容至50ml浸提，用震蕩儀振蕩攪拌，至充分混合，4℃條件下再次離心，操作同上，分別合并兩次離心的上清液于，錐形瓶中，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，設(shè)置轉(zhuǎn)速80r/min,水域溫度為40℃，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉甲醇，直至剩余全部為水相，用蒸餾水定容至40ml,即得玉鈴花種皮與胚乳中內(nèi)源抑制物質(zhì)的浸提液原液。將浸提液原液分別稀釋，稀釋濃度分別為原液濃度的20%、40%、60%、80%、100%〔20%浸提液既將浸提液原液稀釋為原濃度的20%的溶液，40%、60%、80%、100%浸提液稀釋原理同上〕。在上述提取液中各放白菜籽50粒，浸泡兩小時。在培養(yǎng)皿中放兩層濾紙，分別取各濃度的提取液2ml浸濕濾紙，將各濃度浸泡的白菜籽放入培養(yǎng)皿中，后分別取各對應(yīng)濃度的浸提液5ml,對白菜籽進(jìn)行抑制物活性測定，以同體積的蒸餾水作為對照，每個處理三個重復(fù)。在培養(yǎng)箱中，進(jìn)行白菜籽發(fā)芽試驗，48h統(tǒng)計白菜籽發(fā)芽率〔以露出子葉為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)〕，72h測其苗高和根長。本實驗所用的白菜籽為北京益豐惠農(nóng)農(nóng)業(yè)科技研究所的四季小白菜，純度95.0%,凈度98.0%,發(fā)芽率85%,含水量約為8.0%.2.2.3層積經(jīng)過中種子生理生化變化的研究本實驗采用低溫層積，層積前經(jīng)0.3%高錳酸鉀消毒30min后，用30-40℃溫水浸泡24h,將沙子與種子以3:1的比例混勻〔層積所用沙含水量保持在60%左右〕，后裝入容器中，埋藏深度約50cm,寬70cm,后培土，頂部構(gòu)成丘狀即可，從沙藏開場每隔30天取種一次，分別測定種子的含水量，可溶性糖、淀粉、蛋白質(zhì)含量以及淀粉酶活性變化。層積歷時5個月，總共150天。2.2.3.1含水量測定取層積中的種子，用水沖洗干凈外表的沙粒，然后用濾紙吸干外表的水滴，稱取每20粒種子為一組，重復(fù)三次，記錄重量〔精到準(zhǔn)確到小數(shù)點后第三位〕。將稱量瓶預(yù)先烘至恒重并編號，把三份測定樣品分別裝入對應(yīng)的稱量瓶中，并記下稱量瓶重和瓶號。然后稱量，記下讀數(shù)。將稱量瓶放入烘箱中，敞開蓋子，從溫度回升到105℃時開場計時，連烘8h.取出后蓋上蓋子，放入枯燥器中冷卻15-20min.取出稱重，記錄讀數(shù)。再敞開蓋用105℃烘2h,再按上法稱重，記下讀數(shù)。直到前后兩次的重量之差小于0.01g時，即以為已到達(dá)恒重，種子干重即為恒重時的重量。種子含水率的計算：根據(jù)測定結(jié)果，按下式分別計算3份測定樣品的相對含水量百分率，精度到小數(shù)點后一位。種子含水率〔%〕=〔測定樣品烘干前重-測定樣品烘干干重〕/測定樣品烘干前重2.2.3.2可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法測定可溶性糖和淀粉含量。詳細(xì)操作如下：稱取1.0g種子，放入25ml試管中，加沸水25mL,放在水浴鍋中加蓋煮沸10min,放置冷卻后過濾在50mL的容量瓶中，加水定容，便為可溶性糖的提取液。用移液槍汲取提取液0.5mL于大試管中，參加蒸餾水1.5mL,2%蒽酮試劑0.5mL,再參加濃硫酸5mL,搖勻，靜置10min,在620nm波長下比色，記錄吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的葡萄糖的含量。再按以下公式進(jìn)行計算，得出樣品中可溶性糖的含量。設(shè)定3個重復(fù)。種子樣品含糖量〔mg/g〕=[查表所得的糖量〔mg〕樣品稀釋倍數(shù)]/樣品重〔g〕2.2.3.3可溶性淀粉含量測定在提取可溶性糖后剩余的枯燥殘渣中加20mL蒸餾水，放入沸水浴中煮沸15min,再參加2mL9.2mol/L高氯酸溶液，提取15min,冷卻后過濾，定容，搖勻。汲取濾液0.5mL于大試管中，加蒸餾水1.5mL,2%蒽酮試劑0.5mL,再參加濃硫酸5mL,微微搖動，當(dāng)管內(nèi)出現(xiàn)蔥酮絮狀物時，再劇烈搖動促進(jìn)蔥酮溶解，然后立即放入沸水浴中加熱10min,冷卻后在620nm波長下比色，記錄吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的淀粉含量，再按以下公式進(jìn)行計算。每個樣品設(shè)定3個重復(fù)。樣品淀粉含量〔mg/g〕：[查表所得的淀粉含量〔mg〕樣品稀釋倍數(shù)]/樣品重〔g〕2.2.3.4可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白質(zhì)含量，詳細(xì)操作如下：稱取1.0g種子，加4mL蒸餾水，使用FS-2型可調(diào)高速分散器研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，再用4mL蒸餾水洗滌，一并轉(zhuǎn)入離心管中，然后在10000r/min下離心30min,過濾，取提0.1mL取液于試管中，然后參加G-250溶液5mL,充分混合，放置2min后在595nm下測定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。設(shè)定3個重復(fù)。樣品淀粉含量〔mg/g〕：[查表所得的淀粉含量〔mg〕樣品稀釋倍數(shù)]/樣品重〔g〕18洗滌，一并轉(zhuǎn)入離心管中，然后在10000r/min下離心30min,過濾，取提0.1mL取液于試管中，然后參加G-250溶液5mL,充分混合，放置2min后在595nm下測定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量。設(shè)定3個重復(fù)。樣品中蛋白質(zhì)含量=〔CVT〕/〔VSWF〕[mg/g]C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線值，mg;VT為提取液總體積，mL;Vs為測定時參加的提取液的量，mL;WF為樣品的鮮重，g2.2.3.5淀粉酶含量測定淀粉酶活性測定采用李合生的方式方法，詳細(xì)操作如下：稱取1g左右的種子，參加4mL的蒸餾水，用FS-2型可調(diào)高速分散器研磨成勻漿，再用4mL蒸餾清洗研缽，混均后將提取液在室溫下〔25℃〕放置提取15-20min,每隔幾分鐘攪動一次，使其充分提取。然后在溫度為0-4℃轉(zhuǎn)速為10000r/min條件下離心30min,過濾后即為淀粉酶原液備用。-淀粉陣活性的側(cè)定：取3支試管〔1支為對照管，2支為測定管〕，在各管中加lmL酶提取液，在70℃恒溫水浴中準(zhǔn)確加熱15min,取出后迅速在自來水中冷卻，再向?qū)φ展苤袇⒓?mL的3,5-二硝基水楊酸試劑。然后將試管都置于40℃士0.5℃恒溫水浴中預(yù)保溫10min,再向各管中分別參加40℃下預(yù)熱的1%淀粉溶液1mL,搖勻后，立即放入40℃士0.5℃水浴中準(zhǔn)確保溫5min后取出，向各測定管迅速參加2mL的3,5-二硝基水楊酸試劑，以終止酶的活性。搖勻，各試管置于沸水浴中5min,取出后冷卻，加10mL蒸餾水。搖勻，在540nm波長下比色，測定吸光度。+-淀粉酶活性的側(cè)定：取3支試管〔1支為對照管，2支為測定管〕，向每管中加lmL酶提取液，再向?qū)φ展苤袇⒓?mL的3,5-二硝基水楊酸試劑。然后將測定管和對照管置于40℃士0.5℃恒溫水浴中保溫10min,再向各管中分別參加1mL40℃下預(yù)熱的1%淀粉溶液，搖勻后，立即放入40℃士0.5℃水浴中準(zhǔn)確保溫5min