堿性磷酸酶的分離提取

實(shí)驗(yàn)堿性磷酸酶的分離提取目的要求：1.學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)分離純化的一般原理和步驟2.掌握堿性磷酸酶制備的操作技術(shù)堿性磷酸酶(AlkalinephosphataseEC3.1.3.1簡(jiǎn)稱為ALPase)廣泛存在于微生物界和動(dòng)物界。ALPase能催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，磷酸基團(tuán)從磷酸酯轉(zhuǎn)移到醇、酚或糖等磷酸受體上。1.原理在蛋白質(zhì)或酶的分離提取過程中由于酶蛋白容易變性而失活，為了獲得較好的分離提取效果，在工作中特別注意以下幾點(diǎn)：取用新鮮的材料，提取工作應(yīng)在獲得材料后立刻開始，否則應(yīng)在低溫下保存。選擇來(lái)源豐富，酶含量高的材料。在酶的制備過程中，每經(jīng)一步處理，都需測(cè)定酶的活力和比活力。酶的比活力定義為每mg蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。唯有比活力提高較大，提純步驟才有效。（3）鹽分級(jí)沉淀是一種應(yīng)用非常廣泛的方法

高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來(lái)。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來(lái)沉淀不同的蛋白質(zhì)。這種方法稱之為鹽析。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用最廣。硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)。

2.操作方法2.1牡蠣堿性磷酸酶的分離提取每組稱取25g牡蠣（蒸餾水洗凈），加入50mL預(yù)先冷卻的0.01mol/LTris-HCl緩沖液（pH7.5，含0.1mol/LNaCl），（兩組一起）于高速組織搗碎機(jī)勻漿1min，于冰箱4℃放置1h左右進(jìn)行抽提。室溫離心，4000r/m20min，收集離心上清液并量體積（兩組分開）。（留3mL上清液，待測(cè)酶的比活力。）在上清液中加入研磨成細(xì)粉的固體硫酸銨至0.35飽和度（100mL加入20.9g）。緩慢加入，不斷攪拌溶解，置冰箱靜置1h左右。室溫離心，4000r/m10min，收集離心上清液，并量體積。（留3mL上清液，對(duì)0.01mol/LTris-HCl緩沖液pH7.5含0.1mol/LNaCl透析平衡，待測(cè)酶的比活力。）(5)0.35飽和硫酸銨上清液，加入固體研磨成細(xì)粉的硫酸銨至0.70飽和度（100mL加入23.8g）。緩慢加入，不斷攪拌溶解，置冰箱靜置1-2h。(6)室溫離心，4000r/m10min，收集沉淀物。(7)得到沉淀物，溶于5mL含0.1mol/LNaCl的0.01mol/LTris-HCl緩沖液（pH7.5）。裝入透析袋，對(duì)0.01mol/LTris-HClpH7.5緩沖液透析平衡，至無(wú)SO42-被檢測(cè)出為止（可用一定濃度BaCl2溶液檢驗(yàn)）。(8)取出酶溶液，冷凍高速離心（0℃25000r/m30min）。(9)離心上清液即為粗酶制劑，檢測(cè)酶的比活力。裝入棕色瓶于4℃冰箱保存。25g牡蠣加入50mL預(yù)先冷卻的0.01mol/LTris-HCl緩沖液（pH7.5，含0.1mol/LNaCl），于高速組織搗粹機(jī)勻漿1min，于冰箱4℃放置1h左右進(jìn)行抽提。室溫離心，4000r/m20min，收集離心上清液，并量體積。（留3mL上清液，待測(cè)酶的比活力。）

勻漿液上清液緩慢加入研磨細(xì)粉的固體硫酸銨至0.35飽和度（100mL加入20.9g），不斷攪拌溶解，置冰箱靜置1h左右。室溫離心，4000r/m10min，收集離心上清液，并量體積。（留3mL上清液，待測(cè)酶的比活力。）

加入固體研磨成細(xì)粉的硫酸銨至0.70飽和度（100mL加入23.8g）。緩慢加入，不斷攪拌溶解，置冰箱靜置1-2h。室溫離心，4000r/m10min，收集沉淀物。0.35飽和硫酸銨上清液沉淀溶于5mL含0.1mol/LNaCl的0.01mol/LTris-HClpH7.5。裝入透析袋，對(duì)0.01mol/LTris-HClpH7.5緩沖液透析平衡，至無(wú)SO42-被檢測(cè)出為止粗酶液離心機(jī)的使用(1)離心機(jī)要置水平位置，以保證旋轉(zhuǎn)軸垂直地球水平面。(2)樣品傾入離心杯后應(yīng)與離心管套一起兩兩平衡，平衡后把它們放置于轉(zhuǎn)子的對(duì)稱位置。(3)蓋好蓋子，打開電源開關(guān)，調(diào)整離心時(shí)間和離心速度。(4)啟動(dòng)離心后等轉(zhuǎn)速達(dá)到所要求的轉(zhuǎn)速后才能離開(一般要2~3min)。(6)離心結(jié)束后要等到轉(zhuǎn)速為零時(shí)才能打開離心機(jī)蓋，取出樣品。硫酸銨終濃度,%飽和度

10202530333540455055606570758090100每1升溶液加固體硫酸銨的克數(shù)①硫酸銨初濃度，%飽和度05611414417619620924327731335139043047251656166276710

578611813715018321625128832636540644949459269420

2959789112315519022526230034038242452061925

3049619312515819323026730734839048558330

1930629412716219823527331435644954633

12437410714217721425229233342652235

31639412916420023817831941150640

31639713216820524528537546945

32659913417121025033943150

336610113717621430239255

336710314117926435360

346910514322731465

347010719027570

357215323775

3611519880

7715790

79硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表（25℃）

①在25℃下，硫酸銨溶液由初濃度調(diào)到終濃度時(shí)，每升溶液所加固體硫酸銨的克數(shù)。①在0℃下，硫酸銨溶液由初濃度調(diào)到終濃度時(shí)，每100毫升溶液所加固體硫酸銨的克數(shù)。硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表（0℃）

將測(cè)定的數(shù)據(jù)或計(jì)算結(jié)果用下表記錄。（此為例子）

步驟總體積

mL蛋白mg/mL總蛋白mg酶活力U/mL總活力U比活力U/mg純化倍數(shù)得率%勻漿過濾液4007.24

20.3

正丁醇處理上清液470

33.8

0.35飽和(NH4)2SO4上清液440

35.3

0.7飽和(NH4)2SO4沉淀溶解透析上清液40.3

314.7

DEAE-32酶液