第八章基因重組與基因分析ppt-PowerPoint

南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院生物化學技術(shù)原理及應用第八章基因重組與基因分析2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院22023/1/312南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院核酸的分離純化檢測1

DNA的體外合成2

核酸序列測定3

分子雜交4

基因重組與表達5第一節(jié)核酸的分離純化檢測核酸是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質(zhì)基礎。無論是進行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化，核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在，要純化核酸就必須去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，同時要保持所要提取核酸分子的結(jié)構(gòu)和活性不被破壞。核酸的性質(zhì)：DNA為白色類似石棉樣的纖維狀物，RNA的純品呈白色粉末或結(jié)晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。2023/1/313南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第一節(jié)核酸的分離純化檢測1.核酸分離、純化原則保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性意義：遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的一級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。分離核酸原則：溫度不要過高；控制一定的pH值范圍（pH值5-9）；保持一定的離子強度；減少物理因素對核酸降解的機械剪切力。2023/1/314南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第一節(jié)核酸的分離純化檢測1.核酸分離、純化原則保持防止核酸的生物降解細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。DNA酶抑制劑金屬離子螯合劑：DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA、8-羥基喹啉；陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負電荷的復合物，該復合物在高鹽溶液中沉淀。2023/1/315南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院保持防止核酸的生物降解RNA酶抑制劑。RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。皂土。皂土帶負電荷，能吸附RNase，使其失活。DEPC（二乙基焦碳酸鹽）。粘性液體，強核酸酶抑制劑作用機制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。使用注意：DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大100～1000倍。容易降解，保存在4℃或液氮中；提RNA時，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。劇毒。其它：肝素、復合硅酸鹽、RNase阻抑蛋白、氧釩核糖核苷復合物。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院6第一節(jié)核酸的分離純化檢測2.核酸提取的過程與原理核酸提取的主要步驟為：裂解細胞。去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子時，應去除RNA，反之亦然。濃縮沉淀核酸。純化核酸，去除鹽類，有機劑等雜質(zhì)。檢測純度與質(zhì)量。核酸的保存保存。2023/1/317南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2.核酸提取的過程與原理細胞的破碎細胞破碎的方法有：高速組織搗碎機搗碎；玻璃勻漿器勻漿；超聲波處理法；液氮研磨法；化學處理法（SDS、LDS，吐溫80等）；生化法（溶菌酶、纖維素酶等）。該過程要在低溫下進行，并避免核酸酶對核酸的水解。核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負靜電吸力（核酸與堿性蛋白的結(jié)合）、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。核蛋白有核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白兩種，針對所提核酸的種類，要選擇合適的方法。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院8核蛋白的解聚、變性蛋白的去除常用方法：加入濃鹽溶液（如NaCl）。核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；常選用0.14mol/L的氯化鈉溶液提取RNP，而選用1mol/L的氯化鈉溶液提取DNP。加入SDS。SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；酚/氯仿抽提。酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。可加上一定量的異戊醇可防止起泡和促使水相與有機相的分離（酚:氯:異戊醉=25:24:1）。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院9核蛋白0.14mol/LNaCl1.0mol/LNaClRNP溶解度大溶解度小DNP溶解度?。▋H為水中1%）溶解度大(比在水中大2倍)核酸的沉淀濃縮核酸和蛋白質(zhì)分離后，經(jīng)離心后溶液分為三層：上中下分別是核酸溶液、變性蛋白質(zhì)凝膠和氯仿。接下來要濃縮核酸，沉淀是濃縮核酸最常用的方法。沉淀的具體方法見第二章。優(yōu)點：改變核酸的溶解緩沖液；重新調(diào)整核酸的濃度；去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。一般強調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進行。低溫長時間沉淀，易導致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達到實驗要求。核酸的純化得到核酸沉淀后，還要要去除鹽類，有機劑等雜質(zhì)。通常是用乙醇洗滌，由于乙醇易揮發(fā)，最后只剩下比較純的核酸。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院10核酸的濃度與純度的測定紫外分光光度法測定DNA和RNA的含量前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應大于0.25μg/ml。結(jié)論：在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40μg/ml。測DNA：純的DNA樣品OD260/OD280應為1.8，OD260m／OD230應大于2.0。OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等?？赡艹霈F(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院11核酸的濃度與純度的測定紫外分光光度法測定DNA和RNA的含量測RNA純RNA樣品其OD260/OD280應介于1.7-2.0之間，OD260/OD230比值應大于2.0。若RNA樣品OD260/OD280比值太小，有蛋白質(zhì)或酚污染；比值大于2.0時，可能被異硫氰酸胍等污染；OD260/OD230比值小于2.0時表明有小分子及鹽存在。溴乙錠熒光法測定核酸的含量如果DNA和RNA的量很少或有較多雜質(zhì)的情況下，其含量可用溴乙錠熒光法測定。此法的比較主要基于目測，是估計水平。電泳檢測核酸的含量和質(zhì)量通過電泳，可以觀察所得核酸樣品降解情況，也可以通過與標準Marker亮度比較來估計所得核酸含量。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院12核酸的保存DNADNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；長期保存樣品中可加入一滴氯仿。RNARNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存；長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中；在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧釩核糖核苷復合物)凍貯于-70℃,可保存數(shù)年。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院13第一節(jié)核酸的分離純化檢測3.植物總DNA的提取（CTAB法）操作步驟：取2g清洗涼干的新鮮葉片于研缽中，加1/3藥匙石英砂和4mL2倍的CTAB提取液，迅速研磨。將1mL研磨液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，置于65℃水浴中保溫20min，其間顛倒混勻2－3次。破碎細胞12000r/min離心5min，取上清液700μL轉(zhuǎn)到另一離心管中。加入等體積氯仿：異戊醇（24:1）混合液，充分顛倒混勻。12000r/min，離心5min。抽提去蛋白將上清液移入新的1.5mL離心管內(nèi)，加600μL異丙醇。顛倒混勻，可見DNA絮狀沉淀。沉淀核酸12000r/min，離心1min，倒掉上清液，將離心管倒置干燥。將沉淀回溶于20μLTE緩沖液待測。2023/1/3114南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院3.植物總DNA的提取注意事項：選取新鮮材料，研磨迅速徹底，研磨好的材料應與CTAB抽提液充分混勻；若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添加巰基乙醇，盡可能選取幼嫩的材料；收集CTAB與核酸形成的復合物時不要離心過度，否則沉淀再溶解難；2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院15為了獲得具有生物活性的天然核酸，在分離制備過程中必須采用溫和的條件，避免過酸過堿、劇烈地攪拌，防止熱變性，同時還要避免核酸降解酶類的降解。可加少量Rnase降解RNA。第一節(jié)核酸的分離純化檢測4.細菌質(zhì)粒DNA的提取細菌質(zhì)粒染色體外小型（1-200kb）的共價、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。常編碼一些對宿主有利酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等。常用作基因重組的載體。質(zhì)粒提取要去除的物質(zhì)：蛋白、基因組DNA、脂類及小分子雜質(zhì)、RNA。常用的方法有堿裂解法、煮沸裂解等。所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細菌使質(zhì)粒擴增；收集和裂解細菌；分離質(zhì)粒DNA。2023/1/3116南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第一節(jié)核酸的分離純化檢測4.細菌質(zhì)粒DNA的提?。▔A裂解法）堿裂解法的原理：堿裂解法主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓撲學上的差異來分離它們，在堿性PH，DNA變性，恢復中性時，線性染色體DNA不能準確復性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒DNA卻可以準確復性，留在上清中。堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎所有純化質(zhì)粒的方法都用到質(zhì)粒DNA分子相對較小和共價閉合環(huán)狀這兩個特性。由于操作原因提取的質(zhì)粒可有三種結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。2023/1/3117南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院4.細菌質(zhì)粒DNA的提取所用試劑：溶液I。作用：分散細胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活溶液II。作用：細胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液III。作用：酸性下質(zhì)粒DNA復性，變性蛋白——SDS與線性DNA沉淀，K＋可中和DNA酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）。作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機相的分離。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有機相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫）無水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀TE緩沖液：溶解DNA2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院184.細菌質(zhì)粒DNA的提取所用試劑：溶液I。作用：分散細胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活溶液II。作用：細胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液III。作用：酸性下質(zhì)粒DNA復性，變性蛋白——SDS與線性DNA沉淀，K＋可中和DNA酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）。作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機相的分離。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有機相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫）無水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀TE緩沖液：溶解DNA2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院194.細菌質(zhì)粒DNA的提取提取步驟：取1.5ml培養(yǎng)物倒入eppendorf管中，12000r/min，4℃離心30秒。棄上清，將管倒置于吸水紙上使液體流盡。將細菌沉淀懸浮于100μl溶液I中，室溫下放置5-10分鐘。加200μL溶液II（新鮮配制），蓋緊eppendorf管，快速溫和顛倒5次，混勻內(nèi)容物，將Eppendorf管放在冰上5分鐘。加入150μL溶液III（冰上預冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻，冰上放5min。12000r/min，離心5min，將上清夜轉(zhuǎn)至另一eppendorf管中。在上清液中加入0.6倍體積的異丙醇，振蕩混勻后置于-20℃冰箱中放置20分鐘，然后4℃下離心10分鐘.用1ml70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清夜，真空抽干或室溫干燥.2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院204.細菌質(zhì)粒DNA的提取注意事項制備質(zhì)粒過程中，所有操作必須緩和，以避免機械剪切力對DNA的斷裂作用。同時也應防止DNase引起DNA的降解。用酚-氯仿混合液除蛋白的效果比單獨使用酚或氯仿更好。為充分除去殘余蛋白質(zhì)，可進行多次抽提，直至兩相間無絮狀蛋白沉淀。提取的各步操作盡量在低溫條件下進行（冰浴上）。提取用的菌體不宜太多，因菌體多雜酶也相應增加，給提取、純化帶來困難。電泳后得到的DNA條帶不整齊。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院21電泳檢測時，可以分離相對分子質(zhì)量相同但構(gòu)型不同的質(zhì)粒分子。共價閉環(huán)超螺旋DNA（cccDNA）＞直線DNA（LDNA，2條鏈發(fā)生斷裂）＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA（ocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂）。第一節(jié)核酸的分離純化檢測5.核酸提取的其他方法胍鹽提取結(jié)合二氧化硅吸附法：二氧化硅具有特異吸附核酸的特性，異硫氰酸胍可使細胞裂解，因此在高濃度異硫氰酸胍存在下，從細胞（包括細菌）或病毒顆粒中釋放出來的核酸成分可以結(jié)合在二氧化硅上，利用此特性可提取血液和尿液中DNA和RNA。TRIzol試劑提取RNA方法：TRIzol試劑盒是由GIBCOBRI公司推出的產(chǎn)品，其操作方法簡單方便，一小時內(nèi)即可完成。用TRIzol試劑裂解細胞，再加入氯仿，離心后可見三層，上層為透明的水相含有RNA，中間層含DNA，下層為紅色的有機相，含蛋白質(zhì)。2023/1/3122南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第一節(jié)核酸的分離純化檢測5.核酸提取的其他方法旋轉(zhuǎn)離心柱提?。盒D(zhuǎn)離心柱技術(shù)是用于微量核酸分離純化的較為簡單的方法，屬于硅吸附方法的一種。利用裂解液促使細胞破碎，使細胞中的核酸釋放出來。把釋放出的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，這種載體只對核酸有較強的親和力和吸附力，對其他生化成分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則基本不吸附，因而在離心時被甩出柱子。把吸附在特異載體上的核酸用洗脫液洗脫下來，分離得到純化的核酸。此法也可用于DNA測序前核酸的純化，又叫過柱純化。旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)具有廣泛的發(fā)展前景，該產(chǎn)品可應用于生物學、遺傳學、免疫學、考古學、法醫(yī)學等各方面的基因分析。2023/1/3123南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第二節(jié)DNA的體外合成DNA的化學合成DNA的化學合成廣泛用于合成寡核苷酸探針和引物，有時也用于人工合成基因和反義寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成儀合成的，大多數(shù)DNA合成儀是以固相磷酰亞胺法為基礎設計制造的。1.合成的原理核酸固相合成的基本原理是將所要合成的核酸鏈的末端核苷酸先固定在一種不溶性高分子固相載體上，然后再從此末端開始將其他核苷酸按順序逐一接長。每接長一個核苷酸殘基則經(jīng)歷一輪相同的操作，由于接長的核酸鏈始終被固定在固相載體上，所以過量的未反應物或反應副產(chǎn)物可通過過濾或洗滌的方法除去。合成至所需長度后的核酸鏈可從固相載體上切割下來并脫去各種保護基，再經(jīng)純化即可得到最終產(chǎn)物。2023/1/3124南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院DNA的化學合成1.合成的原理核酸固相磷酰亞胺法合成時，末端核苷酸的3′-OH與固相載體成共價鍵，5′-OH被4，4′-二甲氧基三苯甲基(DMTr)保護，下一個核苷酸的5′-OH亦被DMTr保護，3′-OH上的磷酸基上有-N(C3H7)2和-OCH3兩個基團。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院252023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院26每延伸一個核苷酸需四步化學反應：(1)脫三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脫去，游離出5′-OH。(2)縮合：新生成的5′-OH在四唑催化下與下一個核苷3′-磷酰亞胺單體縮合使鏈增長。(3)蓋帽：有少量(小于0.5%)未縮合的5′-OH要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙?；忾]，以防進一步縮合造成錯誤延伸。(4)氧化：新增核苷酸鏈中的磷為三價亞磷，需用碘氧化成五價磷。上述步驟循環(huán)一次，核苷酸鏈向5′方向延伸一個核苷酸。DNA的化學合成2.合成后處理合成后的寡核苷酸鏈仍結(jié)合在固相載體上，且各種活潑基團也被保護基封閉著，要經(jīng)過以下合成后處理才能最后應用。切割：合成的寡核苷酸鏈仍共價結(jié)合于固相載體上，用濃氨水可將其切割下來。切割后的寡核苷酸具有游離的3′-OH。脫保護：切割后的寡核苷酸磷酸基及堿基上仍有一些保護基，這些保護基也必須完全脫去。磷酸基的保護基β-氰乙基在切割的同時即可脫掉，而堿基上的保護基苯甲?；彤惗□；鶆t要在濃氨水中55℃放置15h左右方能脫掉。純化：純化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段，鹽及各種保護基等雜質(zhì)。通常采用的純化方法有電泳法、高效液相色譜法和高效薄層色譜法等。純化這一步操作是可以選擇的，對要求不高的應用如PCR等可不純化。近年來發(fā)展了一些修飾試劑，可在合成寡核苷酸時，對某些核苷酸進行一定的修飾，為寡核苷酸探針的非放射性標記提供了新途徑。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院27第二節(jié)DNA的體外合成聚合酶鏈式反應（PCR）聚合酶鏈式反應是上世紀80年代發(fā)展起來的一種體外快速擴增特異DNA序列的技術(shù)。此技術(shù)于1985年由Mullis發(fā)明，1988年耐熱TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)令該技術(shù)使用更加方便、有效。PCR可以說是20世紀核酸分子生物學研究領域的最重大發(fā)明之一，這不僅表現(xiàn)在該方法本身的簡單和巧妙，而且還表現(xiàn)在它的出現(xiàn)高速發(fā)展了大量在以前看來似乎不可能的生物學技術(shù)。Mullis因其卓越的貢獻而獲1993年的諾貝爾化學獎。2023/1/3128南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院聚合酶鏈式反應（PCR）PCR的原理：原理類似于DNA的天然復制過程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四種脫氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的條件下，由耐熱的TaqDNA聚合酶催化DNA的復制，合成靶DNA。PCR包括三個基本過程：變性。加熱模板使其解離成單鏈。退火。降低溫度使人工合成的寡核苷酸引物與模板DNA中所要擴增的靶序列的兩側(cè)按堿基配對原則相結(jié)合。延伸。在適宜條件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3′端向前延伸，合成與模板堿基完全互補的DNA鏈。這樣變性、退火和延伸構(gòu)成一個循環(huán)，每一次循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)的模板，經(jīng)過30～35個循環(huán)后，界于兩個引物之間的靶序列得到大量復制，拷貝數(shù)約增加106～107倍。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院29聚合酶鏈式反應（PCR）PCR的原理：原理類似于DNA的天然復制過程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四種脫氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的條件下，由耐熱的TaqDNA聚合酶催化DNA的復制，合成靶DNA。PCR包括三個基本過程：變性。加熱模板使其解離成單鏈。退火。降低溫度使人工合成的寡核苷酸引物與模板DNA中所要擴增的靶序列的兩側(cè)按堿基配對原則相結(jié)合。延伸。在適宜條件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3′端向前延伸，合成與模板堿基完全互補的DNA鏈。這樣變性、退火和延伸構(gòu)成一個循環(huán)，每一次循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)的模板，經(jīng)過30～35個循環(huán)后，界于兩個引物之間的靶序列得到大量復制，拷貝數(shù)約增加106～107倍。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院302023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院31聚合酶鏈式反應（PCR）PCR的原理：這樣變性、退火和延伸構(gòu)成一個循環(huán)，每一次循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一次循環(huán)的模板，經(jīng)過30～35個循環(huán)后，界于兩個引物之間的靶序列得到大量復制，拷貝數(shù)約增加106～107倍。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院32典型PCR的反應體系：耐熱DNA聚合酶：耐熱DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶，TthDNA聚合酶，VENTDNA聚合酶，SacDNA聚合酶。其中Taq聚合酶應用最廣泛。Taq酶在92.5℃、95℃和97.5℃時半衰期分別為40min、30min和5-6min，故PCR中變性溫度不宜高于95℃。Taq酶的最適溫度是72℃，較高溫度下的DNA合成錯誤率較低。因此一次加酶可滿足PCR反應全過程的需要，使PCR走向自動化。純化的TaqDNA聚合酶有5′→3′外切酶活性，而無3′→5′外切酶活性，無校對活性。因此在PCR中每2×104個核苷酸中有可能摻入一個錯誤核苷酸，這對一般的PCR產(chǎn)物分析不會有多少影響，但將PCR擴增產(chǎn)物用于分子克隆時，需使用更準確的DNA聚合酶。在100μL反應體系中，一般需TaqDNA聚合酶0.5-5單位，酶濃度過高，可引起非特異產(chǎn)物的擴增，濃度過低則擴增產(chǎn)物量減少。TaqDNA酶可在-20℃貯存至少6個月。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院33典型PCR的反應體系：PCR反應的緩沖液：PCR的緩沖液一般制成10×，含有：500mmol/LKCl；100mmol/LTris-HCl(pH8.3)；15mmol/LMgCl2；0.1%明膠。使用時要稀釋10倍。各組分的作用：Tris-HCl可維持反應體系的pH；KCl有利于引物退火，但濃度過高會抑制TaqDNA聚合酶活性；明膠可保護酶不變性失活；Mg2+能影響Taq酶的活性，影響反應的特異性和擴增DNA的產(chǎn)率，因此要將Mg2+濃度調(diào)至最佳。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院34典型PCR的反應體系：PCR引物：PCR反應成功擴增的一個關(guān)鍵條件在于寡核苷酸引物的正確設計。引物設計一般遵循以下原則：引物長度。一般為15-30bp，引物太短，就可能同非靶序列雜交得到不需要的擴增產(chǎn)物。G+C含量。G+C含量一般為40%-60%。引物的G+C含量和引物Tm值應該協(xié)調(diào)，按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計引物的Tm值。堿基的隨機分布。引物中4種堿基應隨機分布，不要多個嘌呤或多個嘧啶連續(xù)出現(xiàn)。引物自身不應存在互補序列，以免自身折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)影響與模板的退火結(jié)合。兩引物之間也不應有互補性，尤其是避免3′端的互補而形成引物二聚體，使靶序列的擴增量下降。引物濃度。引物的濃度一般為0.1-0.5μmol/L，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院35典型PCR的反應體系：dNTP：dNTP常用的濃度為20-200μmol/L，而且4種dNTP的終濃度相等。dNTP濃度過高雖可加快反應速度，但會增加堿基的錯誤參入率，適當?shù)牡蜐舛葧岣叻磻木_度。另外，dNTP是磷酸根的來源，會與Mg2+結(jié)合，應注意協(xié)調(diào)Mg2+濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系。模板DNA：模板可以是基因組DNA、質(zhì)粒DNA、擴增后的DNA、cDNA等，RNA的擴增需要首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進行正常PCR循環(huán)。含有靶序列的DNA可以單鏈或雙鏈形式加入PCR混合液。通常小片段模板DNA的PCR效率要高于大分子DNA。

PCR反應中模板加入量一般為102-105拷貝的靶序列。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院36典型PCR的反應體系：溫度循環(huán)參數(shù)變性溫度一般為在90-95℃。變性所需的時間取決于DNA的復雜性，一般用94℃、30s對模板DNA進行變性，過高的溫度及過長的時間會降低Taq酶的活性。引物退火溫度通過Tm=4(G+C)+2(A+T)計算得到，一般55-80℃30s。延伸溫度選在70-75℃之間，此時Taq酶活性最高。延伸反應的時間根據(jù)擴增片段的長度而定，一般1kb以內(nèi)延伸1min，更長的片段需相應延長時間。PCR的循環(huán)次數(shù)取決于模板DNA的濃度，一般20-30次。循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物也越多。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院37第二節(jié)DNA的體外合成聚合酶鏈式反應（PCR）PCR技術(shù)的擴展典型的PCR經(jīng)過一定的調(diào)整可用于特殊的研究工作，使PCR技術(shù)擴展到分子生物學的各個方面，較常用的技術(shù)擴展有：1.“巢式”PCR先用一對引物對模板進行擴增，然后再用另一對引物擴增第一對引物擴增的產(chǎn)物，這一PCR技術(shù)即巢式PCR。第一次擴增所用引物稱外引物，第二次擴增作用的引物稱內(nèi)引物。進行“巢式”PCR可將外引物設計得比內(nèi)引物長一些，且用量較少，用外引物進行時，采用較高退火溫度使內(nèi)引物不能與模板結(jié)合，故只有外引物擴增。經(jīng)過若干循環(huán)，待外引物基本消耗完畢后，只需降低退火溫度即可直接進行內(nèi)引物的PCR擴增。這種PCR技術(shù)被稱為“中途進退式”PCR?！俺彩健奔啊爸型具M退式”PCR主要用于極少量模板的擴增。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院38PCR技術(shù)的擴展2.反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）PCR由于Taq酶只能以DNA為模板，當待擴增模板為RNA時，需2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院39先將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進行PCR擴增，這種PCR技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR。RT-PCR常用于基因cDNA文庫的構(gòu)建和基因表達水平的分析。該技術(shù)需要用到反轉(zhuǎn)錄酶。PCR技術(shù)的擴展3.熒光定量PCR（RT-PCR）通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程，結(jié)合相應的軟件可以對結(jié)果進行分析，計算待測樣品的初始模板量。螢光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應的分析軟件。熒光定量實時PCR的特點：2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院40實時在線監(jiān)控。對樣品擴增的整個過程進行實時監(jiān)控，能夠?qū)崟r地觀察到產(chǎn)物的增加，直觀地看到反應的對數(shù)期。降低反應的非特異性。使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合，提高PCR特異性。增加定量的精確性。全程監(jiān)控，準確定量。結(jié)果分析更加快捷方便，無需跑膠。3.熒光定量PCR（RT-PCR）基本原理：通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性分析。在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院41強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。3.熒光定量PCR（RT-PCR）基本原理：一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進行定量分析。實時熒光定量pcr技術(shù)中的一些重要因素：Ct值。每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Ct值與起始模板的關(guān)系。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小?？衫脕碛嬎愠鲈摌悠返钠鹗伎截悢?shù)。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院423.熒光定量PCR（RT-PCR）基本原理：實時熒光定量PCR中熒光化學，熒光定量pcr所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院432023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院44TaqMan熒光探針SYBR熒光染料PCR技術(shù)的擴展4.復合PCR在同一反應中用多組引物同時擴增幾種基因片段的方法稱復合PCR。復合PCR主要用于同一病原體分型及同時檢測多種病原體。此外也常用于多點突變性分子病的診斷。5.不對稱PCR兩種引物比例相差較大的PCR稱不對稱PCR。不對稱PCR可制備用于核酸序列分析的單鏈DNA片段或核酸雜交探針等。6.涂片PCR直接對載玻片上細胞涂片或組織切片進行PCR擴增的方法稱涂片PCR。涂片PCR結(jié)合原位雜交技術(shù)特別適用于病理切片中含量較少的靶序列的PCR檢測。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院45PCR技術(shù)的擴展7.反向PCR擴增引物相反方向DNA序列的PCR技術(shù)稱反向PCR。在反向PCR中，要先將含有一段已知序列的感興趣的未知DNA片段進行酶切和環(huán)化，然后直接進行PCR，也可將已知序列酶切后再進行PCR。反向PCR主要用于已知序列兩翼未知DNA序列的擴增。8.錨定PCR用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄的cDNA3′端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點對該cDNA進行PCR擴增稱為錨定PCR，可用于未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫的構(gòu)建。9.修飾引物PCR為達到某些特殊應用目的如定向克隆、定點突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等，可在引物的5′-末端加上酶切位點、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動子及序列分析物結(jié)合位點等，這種PCR技術(shù)稱為修飾引物PCR。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院46第三節(jié)核酸序列測定DNA測序是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是核苷酸排列方式。RNA測序則通常將RNA提取后，反轉(zhuǎn)錄為DNA后使用DNA測序的方法進行測序。在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前應用最廣泛的是：Sanger雙脫氧鏈終止法。Maxam-GilbertDNA化學降解法。新技術(shù)：雜交測序法，質(zhì)譜法，單分子測序法，原子探針顯微鏡測序法，DNA芯片法。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院47第三節(jié)核酸序列測定Sanger雙脫氧鏈終止法基本原理：在模板指導下，DNA聚合酶不斷將dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延長，合成出新的互補的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于雙脫氧核糖的3’位置上缺少一個羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5’-引物端和以ddNMP殘基為3’端結(jié)尾的一系列長短不一片段的混合物。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長度差一個核苷酸單鏈DNA，從而讀取DNA核苷酸序列。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院48Sanger雙脫氧鏈終止法基本原理：測序所用的ddNTPddNTPs是反應終止劑，可以當作正常堿基參與復制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應體系中dNTPs的濃度遠高于ddNTPs（一般1：3~4）。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院49在自動測序中將熒光素連在4種ddNTP上Sanger雙脫氧鏈終止法基本步驟：測序模板的純化與定量測序反應—PCR儀測序反應產(chǎn)物純化與變性上樣電泳—測序儀分析結(jié)果2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院502023/1/3151南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2023/1/3152南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院毛細管電泳熒光檢測Sanger雙脫氧鏈終止法測序結(jié)果：2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院53DNA測序儀的多種應用：2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院54第三節(jié)核酸序列測定Maxam-GilbertDNA化學降解法基本原理：在一個末端標記的DNA片段在幾組互相獨立的的化學反應分別得到部分降解，其中每一組反應特異地針對某一種或某一類堿基。因此生成一系列放射性標記的分子，從共同起點（放射性標記末端）延續(xù)到發(fā)生化學降解的位點。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應所針對的堿基在原DNA全片段上的位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標記的分子。鮮明特點是可以探測DNA構(gòu)象中的蛋白質(zhì)－DNA相互作用。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院55Maxam-GilbertDNA化學降解法基本原理：2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院56化學降解法與雙脫氧法的比較Maxam-Gilber化學降解法所能測定DNA序列的長度要比Sanger法短一些，通常說來，化學降解法對放射性標記末端250個核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果最佳。如今雙脫氧核苷酸末端終止法遠比Maxam-Gilbert化學降解法應用得更為廣泛。但是，化學降解法具有一個Sanger法所不具備的明顯優(yōu)點：即所測核酸序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應所產(chǎn)生的拷貝，因此，利用Maxam-Gilbert法可以對合成的寡核苷酸進行測序，分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，也可以通過化學保護及修飾干擾實驗來研究DNA二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。然而，由于Sanger法的簡便快速，仍不失為現(xiàn)今DNA測序的最佳選擇方案。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院57第三節(jié)核酸序列測定基因組測序在大規(guī)模DNA測序中，目標DNA分子的長度可達上百萬個bp?，F(xiàn)在還不能直接測定整個分子的序列，然而，可以得到待測序列的一系列序列片段。序列片段是DNA雙螺旋中的一條鏈的子序列（或子串）。這些序列片段覆蓋待測序列，并且序列片段之間也存在著相互覆蓋或者重疊。在一般情況下，對于一個特定的片段，我們不知道它是屬于正向鏈還是屬于反向鏈，也不知道該片段相對于起點的位置。另外，這樣的序列片段中還可能隱含錯誤的信息。序列片段的長度范圍300－1000bp，而目標序列的長度范圍是3100萬bp，總的片段數(shù)目可達上千個。DNA序列片段組裝（又稱序列拼接）的任務就是根據(jù)這些序列片段，重建目標DNA序列。如果能夠得到DNA一條鏈的序列，那么根據(jù)互補原則，另一條鏈的序列也就得到了。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院58基因組測序基因組的測序過程一般包括三個步驟：建立克隆的物理圖譜：如酵母人工染色體YAC克隆、細菌人工染色體BAC克隆等；利用鳥槍法測定每個克隆的序列；序列拼裝和注釋：當?shù)玫揭欢蜠NA序列之后，可以利用序列分析工具，進行序列的拼接；繼而通過與數(shù)據(jù)庫序列的比較，得到與該序列相關(guān)的信息，進而對序列的生物學特性進行注釋。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院59鳥槍測序法：大分子DNA被隨機地“敲碎”成許多小片段，收集這些隨機小片段并將它們?nèi)窟B接到合適的測序載體；小片段測序完成后，根據(jù)重疊區(qū)計算機將小片段整合出大分子DNA序列。這就是所謂的鳥槍測序法?；蚪M測序鳥槍法測序的缺點隨著所測基因組總量增大，所需測序的片段大量增加，造成重復測定，也易丟失某些序列，且數(shù)據(jù)處理分析工作量大。高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復序列，導致判斷失誤。引物步移策略將待測DNA片斷克隆在質(zhì)粒載體上，利用引物步移延伸，從DNA片斷的一端開始逐步進行序列測定，直至另一端為止。克服了鳥槍法的盲目性，并省去亞克隆制備步驟，也減輕了數(shù)據(jù)分析工作量。但由于測定下一段序列前要預先知道上游序列的堿基順序，才能合成適當?shù)囊镞M行測序。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院60第四節(jié)分子雜交核酸分子雜交技術(shù)是分子生物中最常用的基本技術(shù)之一。其基本原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下按堿基互補原則退火形成雙鏈。此雜交過程是高度特異性的，但雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補。雜交的雙方是待測核酸序列及探針。將核酸從細胞分離純化后可在體外與探針雜交，也可直接在細胞或組織內(nèi)進行原位雜交。用于檢測的已知核酸片段稱之為探針(probe)。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以利于隨后的檢測。常用的標記物是放射性核素，近年來也發(fā)展了一些非放射性標記物。檢測這些標記物的方法都是極其靈敏的。核酸分子雜交技術(shù)被廣泛應用于基因克隆的篩選和酶切圖譜制作、基因組中特定基因序列的定量和定性檢測、基因突變分析以及疾病的診斷等方面。它的應用也大大推進了分子生物學的迅猛發(fā)展，如基因芯片就是分子雜交技術(shù)進一步擴展的產(chǎn)物。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院61第四節(jié)分子雜交核酸分子雜交的發(fā)展分類：液相雜交：Hall等1961年將探針與靶序列在溶液中雜交，通過平衡密度梯度離心分離雜交體。該法很慢、費力且不精確，但它開拓了核酸雜交技術(shù)的研究。固相雜交：Bolton等1962年設計了第一種簡單的固相雜交方法，稱為DNA-瓊脂技術(shù)。膜雜交：60年代中期Nygaard等的研究為應用標記DNA或RNA探針檢測固定在硝酸纖維素（NC）膜上的DNA序列奠定了基礎。Brown等應用這一技術(shù)評估了爪蟾rRNA基因的拷貝數(shù)。原位雜交：Orth（1970）應用3H標記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進行雜交，首次用原位雜交檢測了病毒DNA在細胞中的定位。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院62第四節(jié)分子雜交1.探針探針：帶有供反應后檢測的合適標記，并僅與特異靶分子結(jié)合。探針的種類與選擇根據(jù)標記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類；根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類；DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。探針選擇正確與否，將會直接影響到雜交結(jié)果的分析。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院631.探針DNA探針DNA探針指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。現(xiàn)已獲得DNA探針數(shù)量很多，有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列。這些DNA片段須是特異的。DNA探針的優(yōu)點：這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。DNA探針不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。DNA探針的標記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機引物法，PCR標記法等，能用于同位素和非同位素標記2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院641.探針cDNA探針cDNA中由于不存在內(nèi)含子及其它高度重復序列，因此是一種較為理想的核酸探針。但cDNA探針不易獲得，從而限制了它的廣泛應用。另外，還須注意其中的poly（dT）產(chǎn)生的非特異性雜交問題。制備方法：RT-PCR。RNA探針mRNA作為探針的優(yōu)點是：RNA/RNA和RNA/DNA雜交體的穩(wěn)定性較DNA/DNA雜交體的穩(wěn)定性高，因此雜交溫度可提高10℃左右，雜交的特異性更高；RNA中不存在高度重復序列，非特異性雜交較少；雜交后可用RNase將未雜交的探針消化掉，從而使本底降低。但是，RNA極易被環(huán)境中大量存在的核酸酶所降解，mRNA作為探針，其來源極不方便。因此，一般通過cDNA克隆、甚至基因克隆經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄而得到mRNA樣或anti-mRNA樣探針。。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院651.探針反義RNA探針通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以得到同義RNA探針和反義RNA探針。反義RNA又稱cRNA，可用于反義核酸研究，還可用于檢測mRNA的表達水平。因為探針和靶序列均為單鏈，所以雜交的效率要比DNA-DNA雜交高幾個數(shù)量級。RNA探針除可用于檢測DNA和mRNA外，還可以在研究基因表達時，常常需要觀察該基因的轉(zhuǎn)錄狀況。前述幾種探針均是可克隆的。優(yōu)點：在DNA序列未知而必須首先進行克隆以便繪制酶譜和測序時，因為克隆探針較寡核苷酸探針特異性強，較長的序列隨機碰撞互補序列的機會較短序列少；可獲得較強的雜交信號缺點：較長的探針對于靶序列變異的識別能力又有所降低。這既是其優(yōu)點，又是其缺點：優(yōu)點是當用于檢測病原微生物時，不會因病毒或細菌DNA少許變異而漏診，缺點則是不能用于點突變的檢測。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院661.探針寡核苷酸探針寡聚核苷酸探針可根據(jù)需要隨心所欲地用DNA合成儀合成，避免了天然核酸探針中高度重復序列所帶的不利影響。寡核苷酸探針長度只有15-30bp，其中即使有一個堿基不配對也會顯著影響其Tm，因此它特別適合于基因點突變分析；另外，由于序列的復雜性降低，因此雜交所需時間也較短。優(yōu)點：由于鏈短，其序列復雜度低，所以和等量靶位點完全雜交的時間比克隆探針短。寡核苷酸探針可識別靶序列內(nèi)1個堿基的變化，因為短探針中堿基的錯配能大幅度地降低雜交體的Tm值。一次可大量合成寡核苷酸探針（1～10mg），使得這種探針價格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學或化學方法修飾以進行非放射性標記物的標記。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院671.探針寡核苷酸探針應用寡核苷酸針的原則長18～50nt，較長探針雜交時間較長，合成量低；較短探針特異性會差些。堿基成分：G+C含量為40%～60%，超出此范圍則會增加非特異雜交。探針分子內(nèi)不應存在互補區(qū)，否則會出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。避免單一堿基的重復出現(xiàn)（不能多于4個），如-CCCCC-。一旦選定某一序更符合上述標準，最好將序列與核酸庫中核酸序列比較，探針序列應與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院68第四節(jié)分子雜交2.標記物放射性核素標記物常用于標記核酸探針的放射性核素有32P、3H和35S，有時也用14C、125I以及131I等。各種放射性核素的適用范圍是由其物理特性所決定的。32P釋放的β-粒子能量高，穿透力較強，放射自顯影所需時間短，靈敏度高，被廣泛應用于各種濾膜雜交以及液相雜交中，特別適合于基因組中單拷貝基因的檢測。其缺點是半衰期短，射線散射嚴重，導致X-片上帶型輪廓不清，有時會影響到結(jié)果的分析。35SS原子可以取代磷酸分子上的一個氧原子，從而形成35S標記的核苷酸分子。其檢測靈敏度較32P稍低。由于其射線的散射作用較弱，在X-光膠片上成影分辨率較高。另外，35S的半衰期較32P長，是其受歡迎的原因之一。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院692.標記物非放射性核素標記物根據(jù)其檢測方法，非同位素標記物可分為以下幾類：半抗原：目前使用較多的非放射性標記物是生物素和地高辛，它們都是半抗原，可以利用這些半抗原的抗體進行免疫檢測。配體：生物素還是一種抗生物素蛋白(卵白素，avidin)和鏈霉菌類抗生物素蛋白(streptavidine)的配體，可以利用親和法進行檢測。熒光素：如FITC、羅丹明類等，可以被紫外線激發(fā)出熒光進行觀察，主要適用于細胞原位雜交?；瘜W發(fā)光：一些標記物可與另一物質(zhì)反應而產(chǎn)生化學發(fā)光現(xiàn)象，可以象放射性核素一樣直接對X-光膠片進行曝光，這類標記物可能是今后研究的主流。光密度或電子密度標記物：如金、銀等，適用于細胞原位雜交，可在光鏡下或電鏡下進行觀察。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院702023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院71酶促生物素標記技術(shù)第四節(jié)分子雜交3.探針標記法探針的放射性核素標記切口平移法線狀、超螺旋及帶缺口的環(huán)狀

雙鏈DNA均可作為切口平移法

的模板。首先，極微量的DNaseI在Mg2+的存在下，在DNA鏈上隨機形成單鏈切口。利用大腸桿菌DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5′末端逐步切除。同時，在DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性的催化下，在切口的3′末端-OH上合成新的DNA單鏈。如果在反應液中含有一種或多種標記的核苷酸（如32P-dCTP），則這些標記的核苷酸將替代原來的核苷酸殘基，從而形成高放射活性的DNA探針。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院723.探針標記法探針的放射性核素標記隨機引物法隨機引物是含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物，可以與任意序列的核酸雜交，形成DNA聚合酶的引物，目前市售的隨機引物為6個核苷酸殘基的各種可能排列順序共46=4090種。將變性后的模板DNA與隨機引物混合復性，在大腸桿菌DNA聚合酶I大片段催化下合成新鏈，反應液中有[α-32P]-dNTP時，即可形成放射性核素標記的DNA探針。加入的隨機引物越多，探針合成的起點越多，得到的探針會越短。末端標記法利用T4DNA聚合酶，T4多核苷酸激酶、DNA聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶等可以標記探針的一端，標記活性較切口平移法和隨機引物法低得多，一般很少用作分子雜交的探針，主要用于DNA序列測定，故不作詳細介紹。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院73第四節(jié)分子雜交3.探針標記法探針的非放射性核素標記按照標記方法的不同，現(xiàn)有的非放射性標記物主要有兩種類型：酶促標記法。預先已連接在NTP或dNTP上，因此可象放射性核素標記的核苷酸一樣用酶促聚合方法摻入到核酸探針上，如生物素、地高辛等。但由于生物素等標記物是連接在堿基上，而不是磷酸基團，因此不能用多核苷酸激酶法進行末端標記?；瘜W標記法。是是將標記物與化學性質(zhì)較活潑的基團相連，在一定條件下使活潑基團活化而與核苷酸的特定部位共價結(jié)合，常用的有：光敏生物素標記法，胞嘧啶生物素標記法，生物素肼標記法。酶的直接交聯(lián)：將辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶通過化學方法直接交聯(lián)到核酸探針上，通過酶促反應顯示探針的位置。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院74第四節(jié)分子雜交4.雜交信號檢測4.1.照放射自顯影利用放射線在X光片上的成影作用來檢測雜交信號，稱為放射自顯影。其基本步驟是：用放射性墨水在濾膜上一定部位進行標記，以利于以后的定位。因為濾膜的放射性本底一般可使X光片上將濾膜清晰地顯示出來，此步驟一般可以省略。將濾膜用保鮮膜包好，置暗盒中。在暗室中，將磷鎢酸鈣增感屏前屏置濾膜上，光面向上。再壓一至兩張X光片，再壓上增感屏后屏，光面向X光片。蓋上暗盒，置-70℃曝光適當?shù)臅r間。根據(jù)放射性的強度曝光一定的時間后，在暗室中取出X光片，顯影，定影。如曝光不足，可再壓片重新曝光。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院754.雜交信號檢測4.2.非放射性核素探針的檢測除酶直接標記的探針外，其它非放射性標記物并不能被直接檢測，而需經(jīng)兩步反應將非放射性標記物與檢測系統(tǒng)偶聯(lián)。第一步稱為偶聯(lián)反應，第二步稱為顯色反應。偶聯(lián)反應。大多數(shù)非放射性標記物是半抗原，可以通過抗原-抗體免疫反應系統(tǒng)與顯色體系偶聯(lián)。顯色反應。通過連接在抗體或抗生物素蛋白上的顯色物質(zhì)（如酶、熒光素等）進行雜交信號的檢常用的檢測物質(zhì)與方法有以下幾類：酶法檢測：這是最常用的檢測方法。通過酶促反應使其底物形成有色反應產(chǎn)物。最常用的酶是堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶。熒光檢測法：熒光檢測法主要用于非放射性探針的原位雜交檢測。化學發(fā)光法：化學發(fā)光是指在化學反應過程中伴隨的發(fā)光反應。電子密度標記：利用重金屬的高電子密度，在電子顯微鏡下進行檢測。主要適合于細胞原位雜交檢測。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院76第四節(jié)分子雜交5.核酸分子雜交的類型核酸分子雜交按作用環(huán)境分為固相雜交和液相雜交。固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，另一條游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。固相雜交時，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我復性等優(yōu)點，故該法最為常用。常用類型：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。液相雜交所參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中。缺點：雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。近幾年由于雜交檢測技術(shù)的不斷改進，商業(yè)性基因探針診斷盒的實際應用，推動了液相雜交技術(shù)的迅速發(fā)展。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院772023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院78濾膜（固相）雜交液相雜交第四節(jié)分子雜交6.固相雜交（膜上印跡雜交）6.1.基本原理：膜上印跡雜交操作的基本流程是：首先用凝膠電泳方法將待測核酸片段分離；然后用印跡技術(shù)將分離核酸片段轉(zhuǎn)移到特異的固相支持物上，轉(zhuǎn)移后的核酸片段將保持其原來的相對位置不變；再用標記核酸探針與固相支持物上的核酸片段進行雜交；最后洗去未雜交的游離的探針分子，通過放射自顯影等檢測方法顯示標記探針的位置。由于探針已與待測核酸片段中的同源序列形成雜交分子，探針分子顯示的位置及其量的多少，反映出待測核酸分子中是否存在相應的基因順序及其含量與大小。核酸分子雜交實質(zhì)上是雙鏈核酸分子變性和具同源序列的兩條單鏈復性的過程。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院796.1.基本原理：變性凡能破壞氫鏈和堿基堆積力，增大雙鏈兩側(cè)磷酸基負電荷斥力的物理和化學手段均可引起核酸變性。DNA熱變性的Tm值多在85-90℃，影響Tm的主要因素有：DNA的堿基組成：DNA中(G+C)%愈高，Tm值也愈高。溶液的離子強度：在無鹽的水中，DNA在室溫下就會變性，加入鹽后，正離子可以封閉磷酸基團的負電荷，消除靜電斥力，使DNA雙鏈的穩(wěn)定性增加，Tm值亦升高。pH值:pH值在5-9范圍內(nèi)，Tm值變化不明顯。在高pH值下，可使堿基失去形成氫鏈的能力。當pH大于11.3時所有氫鍵均被破壞，DNA完全變性。Southern雜交時，0.5mol/L的NaOH可使DNA在室溫下變性。變性劑:變性劑可以干擾堿基堆積力和氫鏈的形成，因此可以降低Tm值。常用的變性劑是甲酰胺和脲，通常用50%的甲酰胺可以使Tm值降低30℃。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院806.1.基本原理：復性復性的速度受到諸多因素的影響：DNA的濃度：DNA濃度高則單鏈間碰撞機率高，復性速度快。DNA的大?。捍蠓肿覦NA擴散速度較慢，難于形成正確配對，復性速度較慢。溫度：溫度升高，有利于DNA變性而不利于復性；而溫度過低，則少數(shù)堿基配對形成的局部雙鏈不易解離，難以繼續(xù)尋找正確配對。適宜的復性溫度是Tm-25℃。離子強度：離子強度過低，不利于復性，復性時常采用0.15-1.0mol/L溶液。DNA分子的復雜性：DNA總量一定時，基因組越復雜，其中特定順序的拷貝數(shù)就越少，互補順序的濃度就越低，因而復性反應速度越慢。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院816.1.基本原理：雜交體系的建立分子雜交過程，實質(zhì)上是DNA的復性過程。上述復性原則也同樣適用于雜交。建立雜交體系應考慮到以下幾個因素：離子強度。DNA濃度：DNA濃度愈高，復性速度愈快。應加入足夠的DNA量外，還應盡量減少雜交體積。DNA探針的長度：探針片段越大，因此復性的速度越慢。溫度：選擇適當?shù)碾s交和洗膜溫度是核酸分子雜交成敗最關(guān)鍵的因素之一。通常雜交反應在低于Tm值15-25℃溫度下進行。以下經(jīng)驗公式對于幫助判斷Tm值很有用處：Tm=81.5℃+1.66lgM+0.41(G+C)%-500/n-0.6(甲酰胺%)M為Na+摩爾濃度；n為探針的復雜性（沒有重復序列時，復雜性即為探針的長度，單位為b）。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院826.1.基本原理：雜交膜的選用硝酸纖維素膜：方便，本底淺，核酸結(jié)合牢固。與蛋白有微弱非特異結(jié)合，尤為適用非同位素探針。缺點是結(jié)合核酸能力的大小取決于轉(zhuǎn)印條件和高濃度鹽，與小片段核酸結(jié)合不牢，質(zhì)地脆，不易操作。尼龍膜的強度大、耐用，可與小至10bp的片段共價結(jié)合，與DNA單鏈或RNA緊密結(jié)合，且多數(shù)膜不需燒烤。可反復處理與雜交而不丟失被檢標本。缺點是對蛋白有高親合力，不宜使用非同位素探針?！霸胍簟保簶擞汥NA結(jié)合到空白膜上本底。排除：一是使用高純度的核酸制品和充分嚴格的雜交條件：二是選擇合適的雜交反應液和對膜進行處理。隨著離子強度的增加，空白膜（未固定DNA對照膜）上的“噪音”水平增加，而在50%甲酚胺6×SSC的雜交反應液中可充分封閉膜上的多余非特異結(jié)合位點。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院83第四節(jié)分子雜交6.固相雜交（膜上印跡雜交）6.2.Southern印跡雜交：Southern印跡雜交：研究DNA圖譜的基本技術(shù)?；痉椒ǎ合拗菩詢?nèi)切酶消化DNA標本瓊脂糖凝膠電泳分離堿變性，Tris緩沖液中和高鹽下通過毛吸作用將DNA轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上（凝膠中DNA片段相對位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持）烘干固定，預雜交與32P標記探針雜交放射自顯影，確定探針互補DNA的位置，從而可以確定在酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院846.2.Southern印跡雜交：吸附轉(zhuǎn)移過程2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院852023/1/3186南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院876.3.Northern印跡雜交：Northern印跡雜交：分析總RNA或mRNA分子量。將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。其方法與DNA印跡技術(shù)即Southern印跡技術(shù)相似。注意點：防止RNA被降解及形成二級結(jié)構(gòu)。6.4.斑點雜交斑點雜交：是將被檢標本點到膜上，烘烤固定，再雜交。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。為使點樣準確方便，市售有多種多管吸印儀，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀，反復沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。斑點雜交可分為：DNA斑點雜交，RNA斑點雜交，完整細胞斑點雜交。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院886.5.原位雜交：原位雜交術(shù)，可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達。此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水來探討細胞的功能表達及其調(diào)節(jié)機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。原位雜交分為兩種：菌落原位雜交：菌落原位雜交是將細菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將NDA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。組織原位雜交：組織原位雜交簡稱原位雜交，原位雜交是用標記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段，分為RNA原位雜交和染色體原位雜交兩大類。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院892023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院90菌落原位雜交斑點雜交6.5.原位雜交：組織原位雜交RNA原位雜交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標記的特異性探針與被固定的組織切片反應，若細胞中存在與探針互補的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，可通過放射性標記或經(jīng)酶促免疫顯色，對該基因的表達產(chǎn)物做出定性定量分析。染色體原位雜交首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院912023/1/3192南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院mRNA的互補鏈，雜交信號集中于纖維細胞中。負對照，mRNA的同義鏈,無雜交信號正對照，UBQ10雜交信號遍布于整個胚珠RNA原位雜交2023/1/3193南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院染色體原位雜交6.6.固相夾心雜交夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個主要的優(yōu)點：樣品不需要固定，對粗制樣品能做出可靠的檢測；用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強，因為只有兩個雜交物都雜交才能產(chǎn)生可檢測的信號。固相夾心雜交需要兩個靠近而不互相重疊的探針，一個作固相吸附探針，另一個作標記檢測探針。樣品基因組內(nèi)核酸只有使這兩個探針緊密相連才能形成夾心結(jié)構(gòu)。需注意的是兩個探針必須分別亞克隆進入兩個分離的非同源載體內(nèi)，以避免產(chǎn)生高的本底信號（如一個克隆入Puc19，另一克隆入pBR322）。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院94第四節(jié)分子雜交7.液相雜交吸附雜交羥基磷灰石吸附雜交：DNA:DNA雜交雙鏈在低鹽條件可特異地吸附到HAP上，離心沉淀吸附核酸的HAP，再用緩沖液離心漂洗幾次HAP，然后將HAP置于計數(shù)器上進行放射性計數(shù)。親合吸附雜交：生物素標記DNA探針與靶RNA雜交，雜交物吸附到?；H合素包被的固相支持物（如小球）上，用特異性標單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應，加入酶顯色底物，這個系統(tǒng)可快速（2h）檢測RNA。磁珠吸附雜交：應用吖啶翁酯標記DNA探針，這種試劑可用更敏感的化學發(fā)光來檢測。探針和靶雜交后，雜交物可特異地吸附在磁化的有孔小珠（陽離子磁化微球體上）。溶液中的磁性小珠可用磁鐵吸出，經(jīng)過簡單的漂洗步驟，吸附探針的小珠可用化學發(fā)光測定。2023/1/31南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院957.液相雜交吸附發(fā)光液相雜交能量傳遞法：用兩個緊接的探針，一個用化學發(fā)光基團（供體）標記，另一個用熒光物質(zhì)標記。兩個靠得很近的探針用不同的物質(zhì)標記（標記光發(fā)射）。當雜交后，一種標記物發(fā)射的光被另一種標記物吸收，并重新發(fā)出不同波長的光。只有在兩個探針分子靠得近時，才能產(chǎn)生受激發(fā)光，因此這種方法具有較好的特異性。吖啶翁酯標記法：吖啶翁酯標記探針與靶核酸雜交后，未雜交的標記探針分子上的吖