層析技術(shù) 修改

實驗：氨基酸分配紙層析層析缸層析液層析紙賴蘇脯X苯分配層析原理：不同氨基酸分配系數(shù)不同，隨流動相遷移速度不同，層析后留在不同位置。通過已知氨基酸可鑒定出待測氨基酸。分配系數(shù)（α）=溶質(zhì)在固定相中的濃度溶質(zhì)在流動相中的濃度溶劑系統(tǒng)：正丁醇：冰醋酸：水=4：1：5固定相：結(jié)合到濾紙上的水。流動相：推動被分離組分向前移動的溶液正丁醇。流動相依靠毛細作用向上移動。第一章層析技術(shù)1.定義2.分類第一節(jié)技術(shù)簡介根據(jù)交換劑的屬性、層析的分離的原理可將層析分類如下：層析技術(shù)分配層析離子交換層析凝膠過濾層析親和層析吸附層析層析技術(shù)紙層析柱層析薄層層析離心薄層層析高效液相層析高效氣相層析層析技術(shù)是利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差別（分子親和力、吸附力、分子的形狀和大小、分配系數(shù)等），使各組分以不同程度分布在兩個相，其中一個是固定相，另一個是流動相，從而使各組分以不同速度移動而使其分離的方法。3常用術(shù)語：（1）固定相（2）流動相（3）洗脫體積（Ve）指某一成分從柱頂部洗脫開始到在底部洗脫液中出現(xiàn)濃度最大值時所用的洗脫液的體積。指在層析過程中推動被分離物質(zhì)向一定方向移動的液體或氣體。在柱層析時，流動相又稱為洗脫劑，即推動有效成分或雜質(zhì)向一定方向移動的溶液。在薄層層析時，流動相又稱為展開劑。是由層析基質(zhì)組成的，它包括固體物質(zhì)（如吸附劑、離子交換劑）和液體物質(zhì)（如固定在纖維素或硅膠上的溶液）。這些物質(zhì)能與有關(guān)化合物進行可逆的吸附、溶解和交換作用。第二節(jié)離子交換層析一、技術(shù)方法過程②洗脫：pH梯度洗脫；或離子強度梯度洗脫③檢測、記錄分部收集。離子交換劑檢測器記錄儀泵入茚三酮分部收集層析柱①上樣；不同氨基酸（蛋白質(zhì)、酶、蛋白激素等）等電點不同，在同pH條件下帶電性能不同，與交換劑結(jié)合力大小不同，結(jié)合較松的先被洗脫出來，結(jié)合較緊的后被洗脫出來，從而被分開。二、離子交換分離基本原理1.分離原理陽離子交換劑交換原理：RC-C1++C2+RC-C2++C1+RC-是帶負電荷的交換劑，-C1+相當于可被交換的陽離子，在層析柱子上樣前-C1+假設(shè)是Na+離子，而上樣后帶正電荷的各種蛋白質(zhì)可替代Na+而結(jié)合在交換劑上，但不同蛋白質(zhì)與交換劑結(jié)合的緊密程度不同，而當用洗脫劑洗脫時，洗脫劑中的陽離子又替代交換劑上的蛋白質(zhì)。不同蛋白質(zhì)向下移動快慢不同，從而按照先后順序從柱子下端隨洗脫劑流出，不同蛋白質(zhì)進而被分開。2.交換劑類別陽離子交換劑陰離子交換劑(1)磺酸型;(2)含苯酚的磺酸型(3)羧酸型二乙氨基乙基纖維素(DEAE-纖維素)

裝柱：裝填均勻，松緊一致，沒有氣泡，沒有裂縫第三節(jié)離子交換層析過程中的關(guān)鍵技術(shù)一、交換劑處理二、柱子選擇與裝柱三、上樣要求四、洗脫劑五、洗脫速度離子交換劑陽離子離子陽離子離子強酸型乙基磺酸纖維素SE磷酸纖維素P甲基磺酸纖維素SM-O-CH2-S-O－==OO-O-CH2-CH2-S-O－==OOO-O-CH2-O-P-O－==O弱酸型羧甲基纖維素CM-O-CH2-C-O－=O強堿型弱堿型三乙基氨TEAE基纖維素二乙基氨基DEAE乙基纖維素-O-CH2-CH2-N+-C2H5C2H5C2H5-O-CH2-CH2-N+-HC2H5C2H5類型交換劑的名稱縮寫活性基團層析柱洗脫液記錄儀分部收集器核酸蛋白檢測儀檢測記錄上樣洗脫1原理：在凝膠顆粒所構(gòu)成的立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，蛋白質(zhì)的分子顆粒越大，受到凝膠顆粒的排阻越大，下行越快，優(yōu)先洗脫出來；分子顆粒越小受到的排阻越小，阻力越大，洗脫出來的速度越慢。二凝膠過濾色譜(又稱分子篩法)凝膠2常用凝膠：(1)天然凝膠：瓊脂糖凝膠(2)人工合成凝膠：聚丙烯酰胺凝膠葡聚糖凝膠其商品名稱Sephadex，根據(jù)需要可選用G-75（Mr分級范圍1000-50000），G-100（5000-100000）等型號的凝膠。其中G后面的數(shù)據(jù)為得水值，即每g干膠吸水毫升再乘以10.

葡萄糖凝膠的規(guī)格與性質(zhì)型號干顆粒直徑(目)分子量分級范圍得水值（ml/g）床體積（ml/g干膠）溶脹時間（h）操作壓（2.5cm直徑柱）/kPa20~25（℃）90~100（℃）肽及球形蛋白多糖SephadexG-25粗50~100中100~200細200~400超細﹥4001000~5000100~50002.5±0.24~631SephadexG-75中100~200超細﹥4003000~700001000~500007.5±0.512~152433.92~15.86SephadexG-100中120~200超細﹥4004000~1500001000~10000010.0±0.115~204852.35~9.41SephadexG-200中120~200超細﹥4005000~8000001000~20000020.0±0.230~407250.39~1.573應(yīng)用：(1)分離、純化與鑒定；(2)測定相對分子質(zhì)量；(3)脫鹽。三親和層析1原理：利用生物大分子間專一親和力的層析技術(shù)。2應(yīng)用：酶與底物、酶與競爭性抑制劑、酶與輔因子、抗原與抗體、激素與其受體。層析柱親和劑四吸附層析1原理：利用各種成分被表面具有吸附分子特性的固體的吸附程度及其在分離溶劑中的溶解度差異進行分離，取決于物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。2分類：(1)物理吸附，如：活性炭；(2)化學(xué)吸附，如：氧化鋁；(3)交換吸附，如：硅膠。思考題：1.什么叫層析技術(shù)？常用的層析技術(shù)有哪些？2.指出常用層析技術(shù)的應(yīng)用范圍。3．SephadexG-100凝膠柱層析分離蛋白質(zhì)原理是什么？4.用SephadexG25脫鹽時蛋白質(zhì)和鹽哪個先出峰？5.相對分子量為8萬和10萬的蛋白質(zhì)能否在SephadexG-75柱中分開？為什么？6.將分子量分別為a（90000）、b（45000）、c（110