核酸代謝之DNA代謝

第十二章核酸的生物合成

之DNA的生物合成一、DNA指導(dǎo)下的DNA合成DNA復(fù)制受控于一套基本規(guī)則:1.復(fù)制是半保留復(fù)制2.復(fù)制從一個(gè)起點(diǎn)開始,通常向兩個(gè)方向進(jìn)行3.DNA合成的5′→3′方向性及半不連續(xù)性DNA復(fù)制DNA的半保留復(fù)制—Meselon-Stahl實(shí)驗(yàn):(a)細(xì)胞在只含有[15N]的培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)代,這樣其DNA中含的N全部為[15N],在氯化銫密度梯度離心后得到一條帶(藍(lán)色)(b)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到只含有[14N]的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代后,分離出DNA進(jìn)行氯化銫密度梯度離心,得到一條密度在[15N]DNA和[14N]DNA之間的帶(紫色)(c)復(fù)制的第二代產(chǎn)生2個(gè)雜化DNA,2個(gè)”輕”DNA(紅色)DNA雙向復(fù)制可視圖(JohnCairns放射自顯影實(shí)驗(yàn))(a)用3H(氚)標(biāo)記DNA鏈,表明兩條鏈?zhǔn)峭瑫r(shí)復(fù)制的(紅色表示新合成的鏈),大腸桿菌在電子顯微鏡下觀察到的復(fù)制過程正好與放射自顯影上所顯示的相符DNA雙向復(fù)制可視圖(JohnCairns放射自顯影實(shí)驗(yàn))(b)在復(fù)制過程結(jié)束前加入3H,通過放射自顯影觀察標(biāo)記(紅色),在復(fù)制叉的兩側(cè)還是一側(cè),從而斷定復(fù)制是雙向還是單向.利用這項(xiàng)技術(shù)已證實(shí)大腸桿菌枯草桿菌及其他細(xì)菌都是雙向復(fù)制的.DNA復(fù)制的5′→3′方向性及半不連續(xù)性新的DNA鏈(紅色)總是沿著5′→3′方向合成.摸板則是沿著相反的3′→5′方向配對(duì).前導(dǎo)鏈沿著復(fù)制叉的方向連續(xù)進(jìn)行合成.而后一條鏈,后隨鏈的合成則是不連續(xù)的,復(fù)制方向與復(fù)制叉移動(dòng)方向相反,且形成許多不連續(xù)的片段(岡崎片段),最后這些岡崎片段通過DNA連接酶形成一條完整的DNA鏈.DNA復(fù)制過程中需要許多酶和蛋白質(zhì)因子(DNA復(fù)制酶系統(tǒng))的參與DNA復(fù)制酶系統(tǒng)(DNAreplicasesystem)或復(fù)制體(replisome)：解旋酶(helicase)拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)或DNA旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)DNA結(jié)合蛋白(DNAbindingprotein)引物酶(primase)DNA聚合酶(DNApolymerase)DNA連接酶(DNAligase)DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)拓?fù)鋺?yīng)力現(xiàn)象DNA聚合酶DNA聚合酶的作用特點(diǎn)：1.基本反應(yīng):通過增長(zhǎng)的DNA鏈的3′末端核苷酸的3′-OH對(duì)即將引入的5′-脫氧核苷三磷酸的5′-α-磷酸進(jìn)行親核進(jìn)攻實(shí)現(xiàn)。2.DNA聚合反應(yīng)需要有引物(Primer)。

引物:一條與模板鏈互補(bǔ)的線性片段,其上帶有能與核苷酸相結(jié)合的游離3′-OH,這個(gè)羥基位于引物的3′末端,因此稱為“引物末端”(primerterminus)。3.能保證DNA復(fù)制的精確進(jìn)行。DNA鏈的延伸:引物鏈必須提供3′端的游離羥基,在此處一個(gè)新的核苷酸單元被加入.每個(gè)增加的核苷酸部分通過堿基配對(duì)被模板上合適的核苷酸選擇.反應(yīng)產(chǎn)物具有新的游離3′OH,允許另一個(gè)核苷酸的加入.DNA復(fù)制的忠實(shí)性依賴于堿基對(duì)的幾何性質(zhì)(a)標(biāo)準(zhǔn)A=T和C=G堿基對(duì)具有相似的幾何性質(zhì),結(jié)合一個(gè)堿基的活性部位(藍(lán)色)一般接納另一個(gè)對(duì)應(yīng)堿基(b)不正確配對(duì)堿基的幾何形狀可從活性部位剔除DNA復(fù)制的精確性DNA聚合酶I的3′→5′外切酶活性校正錯(cuò)誤保證了DNA復(fù)制的精確性:當(dāng)DNA聚合酶沿著DNA移動(dòng)時(shí),其外切酶活性先起聚合酶活性作用,一旦有錯(cuò)配序列的堿基對(duì)阻止了DNA聚合酶I向下一個(gè)位置移動(dòng)時(shí),它就向后滑動(dòng),以其3′→5′外切酶活性校正錯(cuò)誤,然后按5′→3′方向恢復(fù)酶的聚合活性.大腸桿菌DNA聚合酶I、II、III的比較大腸桿菌DNA聚合酶III的各個(gè)亞基組成DNA聚合酶III的兩個(gè)β亞基形成一種環(huán)形夾子，把DNA分子包圍起來，夾子沿著DNA滑動(dòng)，防止其從DNA上滑落，使其酶連續(xù)合成能力提高500000以上。DNA復(fù)制過程中的切口平移：與模板配對(duì)的一段DNA或RNA可同時(shí)被DNA聚合酶I上的5′→3′外切酶降解和替換。酶的這些活性對(duì)復(fù)制過程中的DNA修復(fù)和RNA引物的去除均有作用。去除的核酸鏈(DNA或RNA)用綠色表示，替換的用紅色表示。切口處斷裂的磷酸二酯鍵留下游離的3′OH及游離的5′磷酸基，出現(xiàn)在DNA合成起始位置，DNA聚合酶I延伸非模板DNA鏈，沿DNA平移切口，該過程叫切口平移。切口留在DNA聚合酶I解離處，直到被另一種酶封閉。DNA聚合酶I的大片段(Klenow片段)三維結(jié)構(gòu)圖Klenow片段由聚合酶I經(jīng)蛋白酶酶解去除5′→3′外切酶活性后產(chǎn)生,保持酶的聚合及校正活性.該片段來自耐熱菌株.添加核苷酸的活性部位很深位于結(jié)合DNA的遠(yuǎn)端裂縫.深藍(lán)色鏈?zhǔn)悄０?大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)oriC的序列分布：盡管重復(fù)的序列(有顏色的)不完全一樣，但在每個(gè)位置上，一些核苷酸是共有的，形成了保守序列。大腸桿菌染色體的復(fù)制步驟起始：復(fù)制起始位點(diǎn)(oriC)；高度保守序列延伸終止大腸桿菌染色體復(fù)制的終止：終止序列(Ter)位于染色體上方向相反的兩簇；方向相反的兩個(gè)復(fù)制叉分別進(jìn)行DNA復(fù)制，產(chǎn)生完整的交聯(lián)在一起的染色體(或拓?fù)浠ミB的環(huán)狀染色體)，分離交聯(lián)環(huán)時(shí)，需要拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用。真核細(xì)胞DNA的復(fù)制與原核細(xì)胞DNA復(fù)制的不同多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)復(fù)制叉移動(dòng)速度較慢DNA聚合酶至少包括α、β、γ、δ和ε五種端粒的復(fù)制：端粒酶(反轉(zhuǎn)錄酶，RNA部分和蛋白質(zhì)部分)，反轉(zhuǎn)錄過程酵母染色體中的重要結(jié)構(gòu)元件端粒位于真核生物染色體的兩端，幫助穩(wěn)定染色體。其末端為約100個(gè)堿基對(duì)的序列，大致由5′(TxGy)n和3′(AxCy)n序列重復(fù)而成，x和y通常介于1和4之間，n為端粒的重復(fù)數(shù)目，在真核單細(xì)胞染色體中為20～100，在哺乳動(dòng)物中常常超過1500。端粒的重復(fù)序列主要是通過端粒酶加到真核染色體的末端的。(c)返回到內(nèi)部模板RNA的原位，以添加更多的TG殘基端粒的復(fù)制過程(a)端粒酶內(nèi)部模板RNA與DNA的TG引物(TxGy)通過堿基配對(duì)結(jié)合(b)端粒酶添加更多的T和G殘基到TG引物上互補(bǔ)的CxAy鏈被認(rèn)為由RNA引物起始，被細(xì)胞DNA聚合酶催化合成。在很多低等真核細(xì)胞中，單鏈區(qū)由一些特殊的結(jié)合蛋白保護(hù)，特別是那些端粒少于幾百個(gè)堿基對(duì)的種類。在端粒長(zhǎng)度有幾千個(gè)堿基對(duì)的高等真核細(xì)胞(包括哺乳動(dòng)物)中，單鏈末端被一種稱作T環(huán)(Tloop)的特殊結(jié)構(gòu)所封閉，單鏈末端回折，并與端粒雙鏈中的互補(bǔ)部分配對(duì)。小鼠肝臟細(xì)胞中染色體末端的T環(huán)電鏡圖在哺乳動(dòng)物中，該DNA環(huán)與兩種稱為TRF1和TRF2的蛋白質(zhì)結(jié)合，這兩種蛋白質(zhì)與T環(huán)形成相關(guān)。T環(huán)保護(hù)了染色體的3′端，使之不受核酸酶及修復(fù)雙鏈損傷的酶的作用。端粒酶活性的缺失會(huì)導(dǎo)致每一代細(xì)胞分裂時(shí)端粒的逐漸縮短，最后導(dǎo)致細(xì)胞系死亡。在生殖細(xì)胞中，有端粒酶活性，端粒長(zhǎng)度可維持；在缺乏端粒酶的體細(xì)胞中，端粒長(zhǎng)度無法維持。人類體細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度隨個(gè)體年齡的增加而變短。如果端粒酶的反轉(zhuǎn)錄酶在體外引入人體細(xì)胞，端粒酶活性恢復(fù)，細(xì)胞壽命顯著增加。端粒的逐漸變短與衰老過程的關(guān)系、人類壽命長(zhǎng)短與端粒長(zhǎng)度的關(guān)系，將揭示一些奇妙的內(nèi)容。生物細(xì)胞DNA復(fù)制分子機(jī)制

的基本特點(diǎn)復(fù)制是半保留的復(fù)制起始于特定的起始位置，真核生物有多個(gè)起始點(diǎn)復(fù)制可以朝一個(gè)方向也可以朝兩個(gè)方向進(jìn)行，后者更為常見復(fù)制時(shí)，DNA的兩條鏈都從5′端向3′端延伸復(fù)制是半不連續(xù)的，前導(dǎo)鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，后隨鏈?zhǔn)遣贿B續(xù)合成的，即先合成岡崎片斷，再連接起來構(gòu)成后隨鏈。二、一種特殊的DNA合成方式：RNA指導(dǎo)的DNA合成致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)反轉(zhuǎn)錄病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并整合到宿主染色體的過程單鏈RNA病毒基因組和反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)入宿主細(xì)胞，反轉(zhuǎn)錄酶首先催化合成一條與病毒RNA鏈互補(bǔ)的DNA鏈，然后降解RNA-DNA雜合分子中的RNA鏈并以DNA鏈取代它，最后形成的雙鏈DNA通常要整合到宿主細(xì)胞的基因組中。這些整合的并且休眠的病毒基因組能被活化合轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步包裝成新的病毒。反轉(zhuǎn)錄酶催化的反應(yīng)：

RNA依賴的DNA合成

RNA降解

DNA依賴的DNA合成病毒反轉(zhuǎn)錄酶引起癌癥和艾滋病大多數(shù)病毒反轉(zhuǎn)錄酶不能殺傷宿主細(xì)胞，但能整合于細(xì)胞DNA內(nèi)，刺激細(xì)胞分裂。有些反轉(zhuǎn)錄病毒屬于RNA腫瘤病毒，含有能引起細(xì)胞異常生長(zhǎng)的致癌基因。Rous肉瘤病毒(鳥肉瘤病毒)基因：在正常雞DNA及許多其他真核生物包括人類的基因組中均發(fā)現(xiàn)這種基因。當(dāng)受Rous肉瘤病毒感染時(shí)，致癌基因能高水平表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞不規(guī)則分裂并導(dǎo)致癌癥。HIV是反轉(zhuǎn)錄病毒，含有標(biāo)準(zhǔn)的反轉(zhuǎn)錄病毒基因和幾種其他非正常基因組，與許多其他反轉(zhuǎn)錄病毒不同，HIV會(huì)殺傷許多受感染細(xì)胞(主要是T淋巴細(xì)胞)而引起腫瘤。這樣逐漸導(dǎo)致宿主機(jī)體免疫系統(tǒng)的抑制。HIV的反轉(zhuǎn)錄酶的錯(cuò)誤率比其他已知的反轉(zhuǎn)錄酶高10倍或更多，致使該病毒有更高的突變率，病毒基因組復(fù)制時(shí)，每次通常有一個(gè)或幾個(gè)誤差，因此，任何兩個(gè)病毒RNA分子幾乎總是不同的。人類免疫缺陷病毒HIV基因組：除含有特殊的反轉(zhuǎn)錄病毒基因組之外，還包含具有多種功能(未鑒定的和未知的)的幾個(gè)小基因，有些基因發(fā)生重疊。選擇性剪接機(jī)制使其小的基因組可表達(dá)產(chǎn)生很多不同的蛋白質(zhì)。三、DNA的修復(fù)錯(cuò)配修復(fù)堿基切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)直接修復(fù)遺傳重組修復(fù)甲基化在錯(cuò)配修復(fù)中的識(shí)別作用甲基引導(dǎo)錯(cuò)配修復(fù)的起始過程示意圖甲基引導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)的完成DNA的堿基切除修復(fù)途徑(d)DNA聚合酶I留下的切口由DNA連接酶封閉。(a)DNA糖基化酶識(shí)別損傷的堿基，在主鏈的堿基和脫氧核糖之間斷裂。(b)AP內(nèi)切核酸酶斷裂AP位點(diǎn)附近的磷酸二酯鍵。(c)DNA聚合酶I從切口的游離3′-OH啟動(dòng)修復(fù)合成，除去部分損傷鏈(由5′→3′外切酶活性起作用)，以未損傷DNA鏈取代。大腸桿菌和人類的核苷酸切除修復(fù)(a)核苷酸切除酶在龐大的損傷部位與DNA結(jié)合；(b)核苷酸切除酶切除損傷的DNA鏈的任意一側(cè)，DNA片段在解旋酶的幫助下去除；(c)缺口由DNA聚合酶填補(bǔ)；(d)留下的切口由DNA連接酶封閉光解酶修復(fù)嘧啶二聚體DNA損傷引起突變的實(shí)例O-甲基鳥嘌呤的直接修復(fù)：甲基轉(zhuǎn)移酶DNA重組同源遺傳重組(homologousgeneticrecombi-nation;也稱普通重組)位點(diǎn)特異性重組(site-specificrecombination)DNA轉(zhuǎn)座(DNAtransposition)真核生殖系細(xì)胞的減數(shù)分