mutmap項(xiàng)目結(jié)題報(bào)告模板小基因組

客戶單位 :傳真報(bào)告日期項(xiàng) 審核人 項(xiàng)目概 合同關(guān)鍵指 項(xiàng)目基本信 項(xiàng)目執(zhí)行情 分析結(jié)果概 項(xiàng)目流 實(shí)驗(yàn)流 信息分析流 生物信息學(xué)分析方法和結(jié) 3.1數(shù)據(jù)質(zhì) 原始數(shù)據(jù)介 堿基質(zhì)量分 堿基類型分 低質(zhì)量數(shù)據(jù)過 數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng) 與參考組比對(duì)統(tǒng) 比對(duì)結(jié)果統(tǒng) 插入片段分布統(tǒng) 深度分布統(tǒng) SNP檢測(cè)與注 樣品與參考組間SNP的檢 樣品之間SNP的檢 SNP結(jié)果注 SmallInDel檢測(cè)與注 樣品與參考組間SmallInDel的檢 樣品之間SmallInDel檢 SmallInDel的注 關(guān)聯(lián)分 高質(zhì)量SNP篩 關(guān)聯(lián)分 候選區(qū)域SNP注 候選區(qū)域注 結(jié)果可視 數(shù)據(jù)..................................................................................................................結(jié)果文件查看說 參考文 合同關(guān)鍵指完成2個(gè)樣品的重，共產(chǎn)生43.3GbpCleanData，保證Q30達(dá)到80%數(shù)據(jù)評(píng)估：數(shù)據(jù)量，數(shù)據(jù)質(zhì)量和GC含量的統(tǒng)計(jì)與組比對(duì)：比對(duì)效率，組覆蓋度，組覆蓋深度統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)分析：通過計(jì)算突變體混池的型頻率確定與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的區(qū)候選注釋：對(duì)關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)的進(jìn)行GO、KEGG、COG、NR項(xiàng)目基本信樣品信息樣品編 BMK編 參考組信息根據(jù)水稻的組大小以及GC含量等信息，最終選取晴水稻組作為參考組。sativa，45.67%；參考物種信息：晴水稻（Oryzasativaindica）[1]組，組裝出的組裝到水平，有注釋信息，版本號(hào)為v7.0，地址：。項(xiàng)目執(zhí)行情88。。樣品檢測(cè)合格時(shí)間為項(xiàng)目啟動(dòng)時(shí)間為2018項(xiàng)目分析完成時(shí)間為2018 分析結(jié)果概共獲得49.59Gbp數(shù)據(jù)量，過濾后得到的CleanReads為43.3Gbp，Q30達(dá)到92.45%，平均每個(gè)樣品深度32.85。樣品與參考組平均比對(duì)效率為97.18%，InDel檢測(cè)：樣品W、Mut之間共獲得378,138個(gè)SmallInDel。通過SNP-index0.62MSNP703個(gè)，非同義突變98個(gè)。關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)注釋到106個(gè)實(shí)驗(yàn)流建、文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)和上機(jī)，具體流程如下:經(jīng)質(zhì)檢合格后通過IlluminaHiSeqTM進(jìn)序。信息分析流信息分析的內(nèi)容包括：數(shù)據(jù)質(zhì)控（去除接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)）、與參考組比對(duì)、變異檢測(cè)與注釋（SNP、InDel）、關(guān)聯(lián)分析、候選SNP及候選的注釋。數(shù)據(jù)質(zhì)原始數(shù)據(jù)介。堿基識(shí)別（BaseCalling）分析轉(zhuǎn)化為原始序列（SequencedReads），我們稱之序列（Reads）的序列信息以及其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量信息樣品中真實(shí)數(shù)據(jù)隨機(jī)。 :110:C3B41ACXX:4:1101:1401:21631:N:0:TAAGGCFASTQ格式文件中每個(gè)Read由四行描述，其中第一行以“@”開頭，隨后為對(duì)應(yīng)序列的質(zhì)量。Illumina識(shí)別符（SequenceIdentifiers）詳細(xì)信息見如下Illumina標(biāo)識(shí)詳細(xì)信 Uniqueinstrument Run Flowcell Flowcell Tilenumberwithintheflowcell 'x'-coordinateoftheclusterwithinthe 'y'-coordinateoftheclusterwithinthe Memberofapair,1or2(paired-endormate-pairreadsonly) Yifthereadfailsfilter(readisbad),Notherwise 0whennoneofthecontrolbitsareon,otherwiseitisaneven IndexQphred=-IllunimaCasava1.8版本錯(cuò)誤率與質(zhì)量值簡(jiǎn)明對(duì)應(yīng)關(guān)系如下表所示.5?I堿基識(shí)別（BaseCalling）分析軟件：IllunimaCasava1.8版本參數(shù)：雙端(Pairedend，PE)堿基質(zhì)量分scoreQphred在，，模板固定到上在固定模板的過程中每個(gè)分子會(huì)形成一個(gè)簇一個(gè)簇就是一個(gè)位點(diǎn)在進(jìn)行固定過程中極少量的簇與簇之間物理位置會(huì)發(fā)生在時(shí)軟件通過前4個(gè)堿基對(duì)這些的點(diǎn)進(jìn)行分析和識(shí)別將這些點(diǎn)位置分開，保證每個(gè)點(diǎn)測(cè)到的是一個(gè)分子，因此序列5′端前幾個(gè)堿基的錯(cuò)誤率相對(duì)較高。另外錯(cuò)誤率會(huì)隨著序列（Squndd）的長(zhǎng)度的增加而升高，這是由于過程中化學(xué)試劑的消耗而導(dǎo)致的。因此在進(jìn)行堿基質(zhì)量分布分析時(shí)，樣品的堿基質(zhì)量分布4個(gè)堿基和后十幾個(gè)堿基的質(zhì)量值會(huì)低于中間堿基但其質(zhì)量值都高于根據(jù)質(zhì)量值和錯(cuò)誤率的關(guān)系質(zhì)量值轉(zhuǎn)換成錯(cuò)誤率，繪制錯(cuò)誤率分布圖如下：，，注：橫坐標(biāo)為reads的堿基位置，縱坐標(biāo)為單堿基錯(cuò)誤率，前151bp為雙端序列的第一端reads的錯(cuò)誤率分布情況，后151bp為另一端reads的錯(cuò)誤率分布情況。堿基類型AT、GC分離現(xiàn)象，這種分離現(xiàn)象可能是建庫(kù)過程中差異擴(kuò)增引起的，直接影響到后續(xù)的分析。高通量的序列為組隨機(jī)打斷后的DNA片段，位點(diǎn)在整個(gè)組的分布是近似均勻的，同時(shí)根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，A與T和C與G的含量分別是一致的。由于儀器本身的局限性，A/T和C/G含量可能存在著一定波動(dòng)。藍(lán)色代表堿基C，紅色代表堿基A，紫色代表堿基T，灰色代表中識(shí)別不出的堿基N。前151bp為雙端序列的第一端Reads的堿基分布，后151bp為另一端reads的堿基分布。每個(gè)cycle代表的每個(gè)堿 即表示該項(xiàng)目所有在第一個(gè)堿基 該圖的結(jié)果顯示AT、CG堿本不發(fā)生分離，且曲線較平緩，說明結(jié)果低質(zhì)量數(shù)據(jù)過得到的原始序列（SequencedReads）或者RawReads，里面含有帶接頭Reads該P(yáng)air-endreads。 W注：BMKID：百邁客對(duì)項(xiàng)目樣品的統(tǒng)一編號(hào)；Raw_Reads：原始reads數(shù)；Adapter_Related：含接頭被過數(shù)據(jù)統(tǒng)各樣品產(chǎn)出數(shù)據(jù)評(píng)估結(jié)果如下表所示W(wǎng)注：BMKID：百邁客對(duì)項(xiàng)目樣品的統(tǒng)一編號(hào)；Raw_Reads：原始reads數(shù)目，以四行為一個(gè)單位，統(tǒng)計(jì)Pair-end序列的個(gè)數(shù)；Clean_Reads：過濾后的reads數(shù)，計(jì)算方法同RawReads；Clean_Bases：過濾后的堿基數(shù)，CleanReads數(shù)乘以序列長(zhǎng)度；Q30(%)：質(zhì)量值大于等于30的堿基占總堿基數(shù)的百分比；GC(%)：樣品GC與參考組比對(duì)統(tǒng)重獲得的reads需要重新定位到參考組上，才可以進(jìn)行后續(xù)變異分析。bwa[2]軟件主要用于二代高通量（如IllunimaHiSeq4000等平臺(tái)）得到的短序列與參考組的比對(duì)。通過比對(duì)定位CleanReads在參考組上的位置，統(tǒng)計(jì)各樣品的深度、組覆蓋度等信息，并進(jìn)行變異的檢測(cè)。比對(duì)結(jié)果統(tǒng)樣品的比對(duì)結(jié)果見下表BMK 注：BMKID：百邁客對(duì)項(xiàng)目樣品的統(tǒng)一編號(hào)；Total_Reads：Total_Reads數(shù)，雙端分別統(tǒng)計(jì)，即read1和read2記為2條reads；Mapped(%)：定位到參考組的CleanReads數(shù)占所有CleanReads數(shù)的百分比；Properlymapped：雙端序列均定位到參考組上且距離符合片段的長(zhǎng)度分布。此項(xiàng)目樣品的平均比對(duì)效率均在XX%以上，說明樣品正常插入片段分布的片段的實(shí)際大小，即插入片段大小(InsertSize)，是信息分析時(shí)的一個(gè)重要參每個(gè)樣品數(shù)據(jù)插入片段大小分布的分析使用picard軟件工具包由上圖可知插入片段長(zhǎng)度分布符合正態(tài)分布說明數(shù)據(jù)文庫(kù)構(gòu)建無(wú)異常深度分布統(tǒng)Reads定位到參考組后可以統(tǒng)計(jì)參考組上堿基的覆蓋情況參考組上被reads覆蓋到的堿基數(shù)占組的百分比稱為組覆蓋度；堿基上覆蓋的組覆蓋度可以反映參考組上變異檢測(cè)的完整性，覆蓋到的區(qū)域越多，可以檢測(cè)到的變異位點(diǎn)也越多。覆蓋度主要受深度以及樣品與參考組親緣序列區(qū)），變異檢測(cè)的準(zhǔn)確性也越高。另外，若組上堿基的覆蓋深度分布較均勻，也說明隨機(jī)性較好。注：上圖反映了深度分布的基本情況，橫坐標(biāo)為深度，左縱坐標(biāo)為該深度對(duì)應(yīng)的堿基所占百分比，對(duì)各樣品的平均覆蓋深度和各深度對(duì)應(yīng)的組覆蓋比例如下表所示BMKW注：BMKID：百邁客對(duì)項(xiàng)目樣品的統(tǒng)一編號(hào)；Ave-depth：樣品平均覆蓋深度；Cov_ratio：覆蓋深度在給定深度及以上的堿基數(shù)占參考組總堿基數(shù)的比例。由上表可知，此項(xiàng)目組平均覆蓋深度約為55.5X，組覆蓋度約為根據(jù)各位點(diǎn)的覆蓋深度情況進(jìn)行作圖，若覆蓋深度在上的分布比較均勻，則可以認(rèn)為隨機(jī)性比較好。樣品的 樣品W覆蓋深度分布由上圖可以看出組被覆蓋的較均勻，說明隨機(jī)性較好。圖上深度不均一的地方可能是由于重復(fù)序列、PCR偏引起的。SNP檢測(cè)與注樣品與參考組間SNP的檢SNP的檢測(cè)主要使用GATK[3]軟件工具包實(shí)現(xiàn)根據(jù)CleanReads在參考組的Realignment)、堿基質(zhì)量值校正（BaseRecalibration）等預(yù)處理，以保證檢測(cè)得到的SNP準(zhǔn)確性，再使用GATK進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism，對(duì)于BWA比對(duì)得到的結(jié)果，使用Picard的MarkDuplicate工具去除重復(fù)，屏使用GATK進(jìn)行變異檢測(cè)（variantcalling），主要包括SNP和InDel對(duì)SNP進(jìn)行嚴(yán)格過濾：snpcluster（5bp內(nèi)如果有2個(gè)SNP則過濾掉IndelQUALFILTE .GA [ANNOTATIONS]GT:AD:DP:GQ:PL0.AG [ANNOTATIONS]GT:AD:DP:GQ:PL0.CT [ANNOTATIONS]GT:AD:DP:GQ:PL0.AG [ANNOTATIONS]GT:AD:DP:GQ:PL0 參考序列的名23.4G5A67過濾狀89樣品的型信vcfSNPreads支持?jǐn)?shù)目累積圖，右邊為相鄰SNP之間SNP類型的變異分為轉(zhuǎn)換和顛換兩種，同種類型堿基之間突變稱為轉(zhuǎn)換于二倍體或者多倍體物種，若同源上的某一SNP位點(diǎn)均為同一種堿基，則該SNP位點(diǎn)稱為純合SNP位點(diǎn)若同源上的SNP位點(diǎn)包含不同類型的堿基則該SNP位點(diǎn)稱為雜合SNP位點(diǎn)純合SNP數(shù)量越多則樣品與參考組之間差異越大，樣品之間SNP的檢根據(jù)樣品與參考組的比對(duì)結(jié)果，匯總樣品之間所有有差異的變異位點(diǎn)，各WCCTGGAAATCNTTNCCCTTTC 意 意 AC(aMino GC(Strong AT(Weak GTC(notA)(BcomesafterA) GAT(notC)(DcomesafterC) GA(puRine) ACT(notG)(HcomesafterG) TC GCA(notT,notU)comesafter GT AGCT樣品間SNPSNP結(jié)果注據(jù)變異位點(diǎn)在參考組上的位置以及參考組上的位置信息，可以得到變異位點(diǎn)在組發(fā)生的區(qū)域（間區(qū)、區(qū)或CDS區(qū)等），以及變異產(chǎn)生的影 Amino_Acid_Change|Amino_Acid_Length|Gene_Name|Gene_Coding|Transcript_ID|WARNINGS]|Genotype_Number[||||類 意 Effect 變異影響大?。℉igh,ModerateLowFunctionalClass 功能分類（NONE,SILENT,MISSENSE,NONSENSE） 編碼蛋白(CODING| Exon/Intron 變異的型位 以上的結(jié)果若無(wú)法得到，則其對(duì)應(yīng)列為空。具體說明可參見SnpEff。本項(xiàng)目各樣品及樣品間的SNPWWvs 110 間 非同義的起始子突 起始子丟 終止子獲 終止子丟 同義終止子突 SmallInDel檢測(cè)與注樣品與參考組間SmallInDel的檢根據(jù)樣品的CleanReads在參考組上的定位結(jié)果，檢測(cè)樣品與參考組之檢測(cè)。SmallInDel變異一般比SNP變異少，同樣反映了樣品與參考組之間的差異，并且編碼區(qū)的InDel會(huì)引起移碼突變，導(dǎo)致功能上的變化。樣品之間SmallInDel檢根據(jù)樣品與參考組的SmallInDel檢測(cè)結(jié)果，提取樣品之間有差異的變異位點(diǎn)，即樣品之間的SmallInDel變異位點(diǎn)。部分結(jié)果如下表所示：WA1參考序列的名23C4組樣品間SmallInDelSmallInDel的注根據(jù)樣品檢測(cè)得到的SmallInDel位點(diǎn)在參考組上的位置信息，對(duì)比參考、因組的、CDS位置等信息(一般在gff文件中)，可以注釋InDel位點(diǎn)是否發(fā)生在基現(xiàn)。發(fā)生移碼突變的InDel可能會(huì)導(dǎo)致功能的改變，具體注釋結(jié)果見下表：、 Wvs 21 8 10注：Type：InDel所在區(qū)域或類型；W、Mut為各樣品相對(duì)于參考組存在的對(duì)應(yīng)類型的InDel數(shù)量，Wvs 間

非子邊界上的3的整數(shù)倍的刪除非子邊界上的3的整數(shù)倍的插 起始子丟 終止子獲 終止子丟 關(guān)聯(lián)分高質(zhì)量SNP篩SNPWMut1,809,865SNP位點(diǎn)，在關(guān)聯(lián)分析之前，首先對(duì)上述SNP位點(diǎn)進(jìn)行過濾，過濾標(biāo)準(zhǔn)如下：1、過濾掉不是EMS誘變方向的SNP位點(diǎn)（G-A或C-2、深度過濾，純合SNP4，雜合SNP5的SNPSNPTotal 高質(zhì)量Wvs 關(guān)聯(lián)分根據(jù)參考組信息，開發(fā)野生型親本的SNP位點(diǎn)，并將這些經(jīng)過過濾后的SNP位點(diǎn)替換回去形成新的參考組，根據(jù)新的參考組，開發(fā)并過濾突變型混池的SNPSNP的SNP-index值。SNP-index的一種通過混池間的型頻率差異進(jìn)行標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析的方法[7]。SNP-其中，Mut為子代的突變池，ρXρx分別為野生型親本以及突變體的等位基因在突變池中出現(xiàn)的reads數(shù)目。為了消除假陽(yáng)性的位點(diǎn)，利用標(biāo)記在組上的位置，可對(duì)同一條上標(biāo)記的SNP-index值進(jìn)行擬合[7]，本項(xiàng)目并采用DISTANCE方法對(duì)SNP-index進(jìn)行擬合SNP左右距離各2M的SNP的SNP-index為與性狀相關(guān)的區(qū)域。突變體混池的SNP-index的分布如下圖所示：樣品MutSNP-index關(guān)聯(lián)值在上的分注：橫坐標(biāo)為名稱，藍(lán)色的點(diǎn)代表計(jì)算出來的SNP-index值，紅色的線為擬合后的SNP-index值，黃色的線代表置信度為0.99的閾值線，綠色的線代表置信度為0.95的閾值線，其中紅色曲線高出閾值線的部分即0.95SNP位點(diǎn)共567個(gè)，候選102個(gè)。的定位區(qū)域，利用擬合后SNP-index99百分位數(shù)0.9293，最終得到候選SNP位點(diǎn)共567個(gè)，候選102個(gè)。SNPChromosomeC--注：ChromosomeID：編號(hào)；Pos：上的位置；Type：SNP突變類型；Gene：該SNP所在的基候選區(qū)域的SNP注SNPWvs473 34 注：Type：SNP所在區(qū)域或類型；WvsMut為兩個(gè)樣品間對(duì)應(yīng)類型的候選SNP據(jù)統(tǒng)計(jì)，野生型親本間和突變體混池間存在非同義突變的SNP共3個(gè)，這些SNP很有可能與性狀直接相關(guān)，這些SNP所在的我們稱之為非同義突變，3個(gè)，樣品間非同義突變SNP信息詳見下表：SNPWvsC-- 候選區(qū)域的注應(yīng)用BLAST[8]軟件對(duì)候選區(qū)間內(nèi)的編碼進(jìn)行多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（NR[9]、Swiss-。候選區(qū)域內(nèi)共注釋到39個(gè)，其中在野生型親本和突變體混池間存在非同義突變共注釋到XX個(gè)，注釋結(jié)果見下表：AnnotatedGeneNon_SynGene4Non_SynGeneNum：候選區(qū)域內(nèi)樣品間存在非同義突變的數(shù)候選的GO富集分GO數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)結(jié)構(gòu)化的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)注釋系統(tǒng)，建立了及其產(chǎn)物功能的代表的功能越具體。通過GO分析并按照Cellularcomponent、MolecularFunction、Biologicalprocess對(duì)進(jìn)行分類。候選GO分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果見下圖候選GO注釋聚類注：橫坐標(biāo)為GO各分類內(nèi)容，縱坐標(biāo)左邊為數(shù)目所占百分比，右邊為數(shù)目。此圖展示的是關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)所有背景下GO各二級(jí)功能的分類情況。topGO有向無(wú)環(huán)圖能直觀展示關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)富集的GOterm及其層級(jí)關(guān)系。有向無(wú)環(huán)圖為關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)GO富集分析結(jié)果的圖形化展示方式，分支代表包含候選的Cellularcomponent的topGO有向無(wú)環(huán)圖如下候選的CellularcomponenttopGO有向無(wú)環(huán)圖分注：對(duì)每個(gè)GO節(jié)點(diǎn)進(jìn)行富集，最顯著的10個(gè)節(jié)點(diǎn)在圖中用方框表示，圖中還包含其各層對(duì)應(yīng)關(guān)系。每個(gè)方框（或橢圓）內(nèi)給出了該GO節(jié)點(diǎn)的內(nèi)容描述和富集顯著性值。不同顏色代表不同的富集顯著性，顏色越深，GO候選的topGO富集結(jié)果示意表 ATP 2.0e-L-ascorbicacid 42.5e-protein 3.2e-proteinspecific 0naringenin3-dioxygenase 4ligase 7isomerase 1methionine90注：GO.ID：GO節(jié)點(diǎn)的編號(hào)；Term：GO節(jié)點(diǎn)名稱；Annotated：所有注釋到該功能的數(shù)；Significant：DEG注釋到該功能的數(shù)；Expected：注釋到該功能DEG數(shù)目的期望值；KS：富集節(jié)點(diǎn)的顯著性統(tǒng)計(jì)，KS值越小，表明富集越顯著。候選的KEGG富集分在生物體內(nèi)，不同相互協(xié)調(diào)來行使生物學(xué)功能，不同的間相同的作用通路為一個(gè)Pathway，基于Pathway分析有助于進(jìn)一步解讀的功能。KEGG是關(guān)候選的KEGG注釋結(jié)果按照通路類型進(jìn)行分類，分類圖如下候選的通路分布注：橫坐標(biāo)為注釋到該通路下的個(gè)數(shù)及其個(gè)數(shù)占被注釋上的總數(shù)的，縱坐標(biāo)為KEGG代謝通路的名候選的代謝通路結(jié)果見下圖候選的代謝通路注：紅色框標(biāo)記的為關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)的，藍(lán)色框代表該通路所需要的所有的酶，說明對(duì)應(yīng)與此酶相關(guān)，而 出候選KEGG的富集分析結(jié)果見下表候選的KEGG富集部分結(jié)ProteinprocessinginendoplasmicFlavonoidPlant-pathogenLimoneneandpinenePorphyrinandchlorophyllTyrosinePyruvate注：Pathway：KEGG通路名稱；KO：KEGG通路編號(hào)；Enri 候選COG分類統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類。關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)COG分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果見候選COG注釋分類，注：橫坐標(biāo)為COG各分類內(nèi)容，縱坐標(biāo)為數(shù)目。在不同的功能類中所占比例多少反映對(duì)應(yīng)時(shí)期和環(huán)，結(jié)果可視：。親本間的結(jié)果可視化在上的分布見下圖數(shù)據(jù)上傳中有Readme.txt說明，詳細(xì)介紹了每個(gè)文件所代表的內(nèi)容。上傳的detailxlsEditplusUltraEdit【參考文獻(xiàn)SequencingProjectInternationalRiceGenome.Themap-basedsequenceofthericegenome.Nature436,793–800(2005).LiH,DurbinR.FastandaccurateshortreadalignmentwithBurrows-WheelerTransform.Bioinformatics,200925:1754-60McKennaA,HannaM,BanksE,SivachenkoA,etal.TheGenomeysisToolkit:aMapReduceframeworkforyzingnext-generationDNAsequencingdata.GenomeRes.201020:1297-303Picard:JokeReumers,PeterDeRijk,etal.Optimizedfilteringreducestheerrorrateindetectinggenomicvariantsbyshort-readsequencing.NatureBiotechnology30,61–CingolaniP,PlattsA,WangleL,etal.Aprogramforannotatingandpredictingtheeffe