超聲微泡可用于腦膠質(zhì)瘤靶向藥物遞送,神經(jīng)病學(xué)論文

超聲微泡可用于腦膠質(zhì)瘤靶向藥物遞送,神經(jīng)病學(xué)論文血腦屏障〔bloodbrainbarrier,BBB〕對(duì)腦組織產(chǎn)生屏蔽作用，減少或消除血液中有害物質(zhì)〔如毒素、病毒〕對(duì)腦組織可能產(chǎn)生的損害，但同時(shí)阻礙了藥物進(jìn)入腦組織，給腦部疾病治療帶來障礙[1].怎樣通過藥物載體或藥物遞送技術(shù)將藥物有效穿透BBB到達(dá)靶區(qū)，成為藥劑學(xué)研究和腦部疾病藥物治療的關(guān)注重點(diǎn)。近期，無創(chuàng)和有限開放BBB的研究遭到關(guān)注，如低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡造影劑可開放BBB[2,3],并且超聲微泡已得到臨床應(yīng)用，其安全性和有效性已被證實(shí)，如已上市的微泡產(chǎn)品Definity、Optison、Imagent和全氟顯。超聲破碎微泡可產(chǎn)生空化效應(yīng)。雖有研究證明低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡可開放BBB,但要做到高水平、無創(chuàng)可逆、靶向開放BBB,必須在大量實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上針對(duì)詳細(xì)微泡和超聲條件，討論最適宜實(shí)驗(yàn)參數(shù)，包括超聲頻率、功率、輻照時(shí)長(zhǎng)和微泡劑量。低頻〔1MHz〕超聲可有效發(fā)揮微泡的空化效應(yīng)[4,5],不僅能將大量微泡推送至對(duì)側(cè)管壁，而且很少對(duì)微泡產(chǎn)生聚集作用[6,7].本文通過固定超聲頻率、功率和微泡濃度劑量，改變輻照時(shí)長(zhǎng)，確定無創(chuàng)可逆開放腦膠質(zhì)瘤部位BBB的理想實(shí)驗(yàn)參數(shù)，并證明超聲微泡可用于腦膠質(zhì)瘤靶向藥物遞送。材料與方式方法材料脂質(zhì)微泡根據(jù)文獻(xiàn)[8]處方和工藝，在超聲實(shí)驗(yàn)前制備。取大豆磷脂、吐溫80、聚乙二醇1500〔4∶10∶100,w/w〕混合，參加10倍量的叔丁醇溶解，加熱至65℃混勻，冷凍枯燥24h,得到脂質(zhì)微泡凍干粉，充入全氟丙烷飽和，臨用前參加注射用水2mL,輕搖構(gòu)成微泡混懸液。微泡大小均一，平均粒徑約3.26m,生理鹽水稀釋后的濃度為5.8108~6.7108/mL,大鼠給藥劑量為3mLkg?1.伊文思藍(lán)〔Evansblue,EB,Sigma公司〕；4%多聚甲醛〔重慶市北碚化學(xué)試劑廠〕。大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。荷瘤雄性SD〔Sprague-Dawley〕大鼠，體重為280~320g,無特定病原體〔SpecificpathogenFree,SPF〕級(jí)，溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。儀器WDT-V型腦立體定向儀，小型顱鉆，ST-III型三維手動(dòng)推進(jìn)儀〔西安西北光電醫(yī)療器械廠〕；Signa3.0T磁共振成像儀〔GE公司〕；大鼠掃描專用線圈〔上海晨光公司〕；低功率聚焦超聲治療儀〔溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院〕；UV300分光光度計(jì)〔上海元析儀器有限公司〕；BT01-100型恒流灌注泵〔保定蘭格恒流泵有限公司〕；BMJ-Ⅲ型病理組織包埋機(jī)〔常州中威電子儀器有限公司〕；旋轉(zhuǎn)型石蠟切片機(jī)〔英國(guó)珊頓公司〕；PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀〔常州中威醫(yī)療儀器有限公司〕；IX71倒置研究型顯微鏡〔日本Olympus公司〕；ACASULTMA312型激光共聚焦顯微鏡〔美國(guó)Meridian公司〕。腦膠質(zhì)瘤模型的建立調(diào)整C6細(xì)胞數(shù)為1106/10L,用臺(tái)盼藍(lán)排擠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力95%.腹腔注射1%戊巴比妥鈉〔3mLkg?1〕麻醉大鼠，剪去頭頂部毛，在內(nèi)毗連線與頭部矢狀中線交匯處，縱向頭皮切口約1cm長(zhǎng)分離，暴露顱骨。將頭部固定在大鼠腦立體定位儀上，用碘酒、酒精順序消毒，鋪洞巾。選取大鼠右側(cè)腦尾狀核區(qū)為靶點(diǎn)，根據(jù)大鼠頭部立體定向解剖圖，確定對(duì)應(yīng)于右腦尾狀核的鉆孔位置。用牙科鉆鉆直徑約1mm孔，深達(dá)硬腦膜外表但不刺破硬腦膜。用微量注射器汲取10L細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)定位儀上的針尖使其觸及硬腦膜，進(jìn)針6mm,后退1mm,使針尖距硬腦膜為5mm,將細(xì)胞緩慢注入腦內(nèi)，注射速度約為2.5Lmin?1,注完后留針約5min,緩慢退針，用無菌骨蠟封閉骨孔，縫合皮膚，切口消毒。手術(shù)在無菌環(huán)境下操作。對(duì)照組大鼠以等體積的培養(yǎng)液替換細(xì)胞懸液。BBB開放性檢測(cè)EB靶點(diǎn)染色EB靜脈注射后可立即與血漿白蛋白結(jié)合，構(gòu)成EB白蛋白復(fù)合物。復(fù)合物分子量大，不能透過完好BBB;但BBB開放時(shí)復(fù)合物可浸透通過BBB,并且滲出量和BBB開放程度呈正相關(guān)。因而可根據(jù)腦本質(zhì)EB染色程度揣測(cè)BBB開放程度。大鼠超聲輻照后立即尾靜脈注射0.2%EB溶液，劑量為2mLkg?1,4h后打開左側(cè)胸腔，生理鹽水灌注，至右心房流出灌注液變澄清，再用磷酸鹽緩沖液〔pH7.4〕灌注至動(dòng)物出現(xiàn)肌肉抽搐后，再緩慢灌注30min,然后處死大鼠，斷頭，取端腦，用4%多聚甲醛溶液固定腦組織，72h后切片。熒光顯微鏡觀察腦組織冰凍切片，在顯微鏡下觀察超聲輻照區(qū)及周圍組織EB染色情況。腦中EB定量檢測(cè)大鼠超聲輻照后尾靜脈注射0.2%EB溶液，劑量為2mLkg?1,2h后用生理鹽水灌注，取腦，稱重。將局部染色的腦組織按10mLg?1濕重浸入甲酰胺中，在60℃水浴中放置24h,當(dāng)甲酰胺溶液呈藍(lán)色、腦組織呈無色透明狀時(shí)，取甲酰胺溶液測(cè)定620nm處的EB吸收度。EB的分光光度法測(cè)定線性范圍為0.039~10gmL?1.根據(jù)腦內(nèi)EB濃度計(jì)算BBB的EB通透率[g〔EB〕/g〔腦組織〕].磁共振常規(guī)及加強(qiáng)掃描磁共振〔magneticresonanceimaging,MRI〕檢查包括腦橫斷面及冠狀面T1加權(quán)像〔T1weightedimaging,T1WI〕、T2加權(quán)像〔T2weightedimaging,T2WI〕及加強(qiáng)T1WI檢查。加強(qiáng)檢查是通過鼠尾靜脈注射0.4mmolkg?1釓噴酸葡胺注射液〔gadolinium-diethylenetriaminepentaaceticacid,Gd-DTPA,廣州先靈藥業(yè)有限公司〕10min后進(jìn)行。掃描條件為T1WITR560ms,TE27ms,鼓勵(lì)次數(shù)〔NEX〕2,矩陣256256;T2WITR2300ms,TE110ms,NEX2,矩陣256256;掃描層厚2.4mm,層間距2.9mm,視野〔FOV〕56mm70mm.超聲參數(shù)設(shè)置超聲探頭前端有循環(huán)水囊，設(shè)置水溫25℃。將低頻聚焦超聲探頭連接信號(hào)發(fā)生器，調(diào)節(jié)相應(yīng)電壓參數(shù)，再連接信號(hào)放大器。參數(shù)設(shè)定為：頻率1.0MHz、焦距5cm、聲強(qiáng)4W/cm2和焦域2mm.在大鼠顱頂均勻涂抹超聲耦合劑，探頭中心對(duì)準(zhǔn)瘤體部位，眼耳連線中點(diǎn)交界處，建立從超聲探頭到鼠頭的連續(xù)性通路。超聲時(shí)長(zhǎng)的考察將接種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞16天的荷瘤鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和超聲微泡組。對(duì)照組〔n=5〕經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水；超聲微泡組經(jīng)尾靜脈注射脂質(zhì)微泡，劑量為3mLkg?1,然后用超聲經(jīng)顱輻照大鼠。超聲微泡組按超聲輻照時(shí)間分為10s組、30s組和60s組，每組10只。各組靜注EB溶液，解剖后觀察腦組織染色情況。同時(shí)通過蘇木精？伊紅〔hematoxylin-eosin,HE〕染色觀察有無組織出血壞死表現(xiàn)。接種時(shí)間和超聲機(jī)會(huì)的影響對(duì)接種腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞第9、16、23和30天的荷瘤鼠分組：非超聲靜注EB組；超聲微泡靜注EB組；先超聲微泡后靜注MR造影劑〔Gd-DTPA〕組；先靜注MR造影劑組后超聲微泡組。對(duì)各組進(jìn)行解剖后觀察或T1加權(quán)相加強(qiáng)掃描，測(cè)定各組腦瘤部位及腦瘤邊緣2mm內(nèi)的EB濃度。病理學(xué)觀察取腦組織冠狀切片，用常規(guī)石蠟包埋，HE染色，顯微鏡下觀察有無組織出血壞死表現(xiàn)。統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差〔xs〕表示，兩兩比擬采用方差齊性檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。多組間數(shù)據(jù)比擬采用方差分析，方差分析中兩組間均數(shù)比擬采用SNK法檢驗(yàn)。分析采用SPSS13.0軟件包，以P0.05〔差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〕表示。結(jié)果1超聲時(shí)長(zhǎng)對(duì)BBB開放的影響靜脈注射EB后，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組腦組織靶點(diǎn)〔瘤體〕外表呈極淡藍(lán)色〔圖1A〕，講明腦膠質(zhì)瘤可造成BBB微小開放。超聲微泡組輻照區(qū)腦組織明顯可見EB染色，隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)，染色程度也加強(qiáng)，華而不實(shí)60s組〔圖1D〕30s組〔圖1C〕〕10s組〔圖1B〕。HE染色圖中對(duì)照組、10s組、30s組顯微鏡下均未見明顯異常，神經(jīng)細(xì)胞包漿、核染色均勻，核仁清楚明晰，核膜完好，血管構(gòu)造尚完好，未見明顯紅細(xì)胞滲出，如30s組，結(jié)果見圖2A、B;但60s組見明顯異常，有明顯紅細(xì)胞滲出〔圖2C、D〕，即長(zhǎng)時(shí)間超聲可顯著造成局部腦組織損傷。因而，綜合BBB開放效果和組織損傷程度，確定超聲時(shí)長(zhǎng)為30s.對(duì)移植腦瘤細(xì)胞30天的荷瘤鼠靜注EB后超聲輻照，并進(jìn)行腦瘤組織切片，激光共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)對(duì)照組〔注射EB〕僅見稀疏點(diǎn)狀紅色熒光〔圖3A、B〕，而超聲微泡組〔30s〕輻照區(qū)可見大量紅色熒光〔圖3C、D〕，證明超聲微泡可促進(jìn)EB浸透穿過BBB進(jìn)入腦膠質(zhì)瘤組織。2腦瘤生長(zhǎng)期對(duì)BBB開放的影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植后的不同時(shí)期，BBB通透性有較大差異。單獨(dú)靜注EB染色，腦瘤部位染色效果很不明顯；但超聲微泡操作后，染色程度隨腦瘤生長(zhǎng)期延長(zhǎng)明顯加強(qiáng)〔圖4〕。在超聲條件下，靜脈注射加強(qiáng)顯影劑Gd-DTPA后，MR檢查也呈現(xiàn)靶點(diǎn)BBB開放〔用MRI信號(hào)強(qiáng)度表示〕，具有腦瘤生長(zhǎng)期依靠性。MRI結(jié)果表示清楚，先超聲再給造影劑后MRI腦瘤顯影效果明顯弱于先給造影劑再超聲的情況〔圖4〕，講明超聲在造影劑到達(dá)靶部位外表時(shí)進(jìn)行開放BBB效果最佳。超聲機(jī)會(huì)和藥物注射需進(jìn)行適宜的配合才能獲得最強(qiáng)的BBB浸透。結(jié)果同時(shí)講明超聲不會(huì)造成BBB長(zhǎng)期損傷，超聲停止后，BBB迅速恢復(fù)。EB染色后在不同組織中濃度差異可定量判定BBB浸透性。在各時(shí)間點(diǎn)〔9、16、23和30天〕，超聲微泡組腦瘤中EB一直維持較高濃度〔圖5〕，并且與超聲微泡組瘤體邊緣、對(duì)照組瘤體及瘤體邊緣中EB濃度相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔P0.01〕。超聲微泡組瘤體邊緣、對(duì)照組瘤體EB濃度一直保持接近，講明超聲微泡可使BBB開放，促進(jìn)EB進(jìn)入腦瘤邊緣；而腦瘤本身也能造成BBB有限開放，但開放程度遠(yuǎn)小于超聲微泡效應(yīng)，并且EB很難進(jìn)入腦瘤邊緣部位。討論檢測(cè)無創(chuàng)性BBB開放的方式方法包括EB染色法、透射電鏡檢查法和影像學(xué)檢查〔加強(qiáng)CT、加強(qiáng)MRI〕，最簡(jiǎn)便常用的是EB染料法[9].本文充分利用EB染色的特點(diǎn)，從外觀、紅色熒光、定量檢測(cè)方面系統(tǒng)考察了超聲和腦膠質(zhì)瘤對(duì)BBB開放的影響，準(zhǔn)確判定出腦瘤、超聲微泡、腦瘤附近神經(jīng)組織中EB浸透情況和BBB開放程度。Gd-DTPA是水溶性分子，不能通過BBB,但BBB開放后可通過加強(qiáng)MR影像學(xué)，靈敏地顯示BBB開放，并且可重復(fù)操作，沒有毀壞性。本文通過MRI檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)聚焦超聲開放BBB的速度非常快，幾乎是即時(shí)開放，并且呈可逆性。這與超聲照射5min后電鏡下觀察毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)密連接被打開的結(jié)論相符[10].微泡在腦內(nèi)血液循環(huán)時(shí)，超聲使微泡破裂產(chǎn)生空化效應(yīng)，但僅限于對(duì)腦微血管壁產(chǎn)生影響，打開嚴(yán)密連接，促進(jìn)局部BBB開放。超聲微泡的作用與單純低頻聚焦超聲比擬，前者比后者的超聲功率降低幾個(gè)數(shù)量級(jí)后，仍能開放BBB,操作容易，大大降低了安全性風(fēng)險(xiǎn)，未發(fā)生脈管損傷所致的遲發(fā)性腦缺血和細(xì)胞凋亡[11].低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡在低聲壓水平開放BBB時(shí)，僅僅使靶區(qū)溫度升高0.025℃，對(duì)周圍組織沒有任何影響[12].低頻低聲壓下超聲輻射力并不破碎微泡，而使大量微泡由管腔向管壁發(fā)生數(shù)微米至數(shù)百微米的移位，并在管壁外表聚集成微泡團(tuán)，使靶向黏附率增加20~80倍，有利于BBB靶向性開放，提高基因或藥物定點(diǎn)釋放的準(zhǔn)確性和高效性[13,14].本文也證明了超聲微泡對(duì)BBB開放影響的可逆性。因而該技術(shù)在一定參數(shù)下是安全的。低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡開放BBB的技術(shù)參數(shù)包括超聲功率、頻率、輻照時(shí)長(zhǎng)和微泡濃度劑量。微泡組分、直徑和濃度不同，則相應(yīng)的超聲頻率和功率不同，空化效應(yīng)也有差異。微泡的生物學(xué)效應(yīng)受超聲頻率影響較大，超聲頻率越低，開放BBB需要的超聲功率值越低[15?17].固定超聲頻率、功率、輻照時(shí)長(zhǎng)，微泡數(shù)量增加時(shí)，無創(chuàng)可逆開放BBB的