二維凝膠電泳和質(zhì)譜技術

雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術劉東TEL:68771960E-mail:liudong@163.com全軍免疫學研究所主要內(nèi)容雙向凝膠電泳的原理雙向凝膠電泳的流程雙向凝膠電泳的局限性和進展雙向凝膠電泳的應用質(zhì)譜的定義離子源（ESI和MADLI）質(zhì)量分析器（四級桿，離子阱，TOF,FT-ICR)質(zhì)譜圖的意義和解析導課HumanProteomeOrganization,HUPO蛋白質(zhì)組：闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式，其內(nèi)容包括鑒定蛋白質(zhì)的存在方式（修飾形式），研究其結(jié)構(gòu)、功能、定量和相互作用等蛋白質(zhì)組研究策略蛋白質(zhì)1蛋白質(zhì)2蛋白質(zhì)3。。。組織、細胞等蛋白質(zhì)分離雙向凝膠電泳分離色譜分離切取蛋白條帶或蛋白點蛋白混合物多肽混合物MS/MS數(shù)據(jù)庫比對酶解質(zhì)譜鑒定目前唯一能分離上千種蛋白的技術蛋白質(zhì)分離首選技術：

雙向凝膠電泳技術小鼠肝細胞細胞系K562人腎臟細胞ExtractionofproteinIsoelectricfocusing(1Dgel)Ettan?IPGphor?stainingSpotexcision;TrypsindigestionSDSMALDI-TOF雙向電泳研究流程圖1.1.1電泳的基本知識電泳的定義：帶電粒子在直流電場中向著所帶電性相反的電極移動的現(xiàn)象。影響電泳的因素：1．帶電粒子的帶電狀態(tài)（電量和電性）。2．帶電粒子的分子量大小和分子形狀。3．電場強度。4．緩沖液的PH值，組成成分及離子強度。5．支持介質(zhì)的吸附和電滲作用。蛋白質(zhì)電泳的原理一：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)：在不同的pH條件下，所帶電荷不同。當?shù)鞍踪|(zhì)各種帶電離子所帶正電荷數(shù)與負電荷數(shù)相等時,此時溶液的pH就是這種蛋白質(zhì)的等電點(pI).

不同蛋白質(zhì)等電點不同，在同一緩沖液中所帶電性及電量不同，電泳時遷移的方向和速率不同。

1.1.2蛋白質(zhì)電泳的基本知識陰極陽極pH=pIpH<pIpH>pI帶正電荷帶負電荷凈電荷為零電泳分離蛋白質(zhì)電泳的原理二：不同蛋白質(zhì)分子量大小和分子形狀不同，故遷移率不同。1.2.1等電聚焦定義等電聚焦（IEF)：利用一種特殊的緩沖液（兩性電解質(zhì)）在聚丙烯酰胺凝膠上制造一個pH梯度，電泳時，蛋白遷移到其等電點就不帶電荷而停止電泳，通過該方法分離蛋白的方法。+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH101.2.2固相pH梯度等電聚焦

（IEFwithIPG）

IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團，它們構(gòu)成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。通過這種方式生成的IPG不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進行特別穩(wěn)定的IEF分離達到真正的平衡狀態(tài)。

1.3.1二維SDS同普通SDS類似。但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠

1.3.2SDS的基本原理樣品介質(zhì)和聚丙烯酰胺中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，而電荷因素可以被忽略。如何實現(xiàn)從蛋白質(zhì)分子量大小來分離蛋白?SDS：陰離子去污劑變性劑助溶性試劑作用:斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)強還原劑:

巰基乙醇

DTT作用:

破壞半胱氨酸之間的二硫鍵分子被解聚成組成它們的多肽鍵側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異。膠束在SDS系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。

蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點:形狀像一個長橢圓棒;短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的;長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比SDS2.二維電泳基本操作流程樣品準備等電聚焦（IEF,第一維）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS,第二維)染色圖像分析質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)庫分析，鑒定蛋白裂解液:8M尿素4%CHAPS50mM

DTT2%IPGbuffer40mMTrisbase2.1樣品準備細胞株或組織細胞裂解液振蕩裂解超聲破碎離心,去除沉淀上清蛋白定量2-DE樣品2.2IPG膠條的水化和上樣2-DEsample水化液水化液組成:8MUrea2%NP-40orCHAPS2%IPGbuffer(Ampholyte)0.28%DTTTraceBromophenolblueIPGstripholderPositiontheIPGstrip2.2IPG膠條的水化和上樣StripholderCathode(-)electrodeAnode(+)electrode30voltage12hr2.3第一向:等電聚焦1.Placeelectrodepads2.200Vstep-n-hold1.5hr3.500Vstep-n-hold1.5hr4.1000Vgradient1500vhr5.8000Vgradient36000vhrTimeVoltageHoldercoverIPGstripElectrodeElectrodepads2.4第二向:SDSSDS平衡SDSSDSequilibrationbuffer50mMTris-HCl6MUrea30%Glycerol2%SDSTraceBromophenolSDSSDSSDS0.5%agaroseinrunningbufferSDSMarkerinpaperIPGstrip2.5常用檢測蛋白的方法Colorimetricstaining(考馬斯藍染色,銀染)BlottingIsotopicmethods（同位素）Chemiluminescentmethods(化學發(fā)光）Fluorescentmethods（分子熒光）2.6凝膠的圖像處理分析和典型流程凝膠圖像的掃描圖像加工斑點檢測和定量凝膠配比數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)呈遞和解釋2-DE數(shù)據(jù)庫的建立2.7蛋白點獲取人工切膠自動切膠儀2.8蛋白鑒定蛋白斑點的酶解（將蛋白切成肽段）凝膠內(nèi)酶切電洗脫后在溶液中酶切電轉(zhuǎn)移到膜上在膜上酶切在印跡過程中酶切質(zhì)譜分析MADLI-TOFESI-MS-MS…...3.二維電泳存在問題低豐度蛋白點的檢測極酸或極堿性蛋白的分離高分子質(zhì)量區(qū)蛋白的分離膜蛋白的提取和有效分離重復性和靈敏度問題4.二維電泳研究進展虛擬二維電泳：IPG＋MADLI－TOFSDS+MS/MS二維/多維色譜技術2-DIGE（多熒光）EttanDIGEsystemEttanDIGEsystem-2如何鑒定二維電泳分離出來的蛋白點？質(zhì)譜與蛋白質(zhì)對于蛋白質(zhì)的“鑒定”，較早期的方法是利用Edman測序，但利用這些技術花費的時間較長；如Edman測序，一天只能鑒定出1-2個peptides對于研究蛋白質(zhì)組學的研究員來說，要用這些傳統(tǒng)的方法來解出自然界中成千上萬的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，實在是天方夜譚。

高通量鑒定蛋白的方法：質(zhì)譜什么是質(zhì)譜？質(zhì)譜的定義質(zhì)譜(MS)技術是利用離子化的帶電物體在磁場或電場中的行為確定其分子量，利用這些質(zhì)量信息對分子進行鑒定的技術。

質(zhì)譜鑒定蛋白的一般方法ArtificialspectrabuiltArtificiallytrypsinatedDatabaseofsequences(i.e.SwissProt)SpotremovedfromgelFragmentedusingtrypsinSpectrumoffragmentsgeneratedMATCHLibrary數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng)┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓進樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測接收器┗━━━━━╋━━━━━━┛

真空系統(tǒng)

質(zhì)譜儀包含了五個主要的系統(tǒng)：1、進樣系統(tǒng)(sampleintroduction)2、離子源系統(tǒng)(ionizationsource)3、質(zhì)量分析儀(massanalyzer)4、離子探測器(detector)5、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(datasystem)。質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)離子源電離：

質(zhì)譜進行分析時，首先要做的就是離子化，也就是將待測物處理過后產(chǎn)生氣相的離子，並帶有電荷。離子源:

使被分析樣品的原子或分子離化為帶電粒子(離子)的裝置,并對離子進行加速使其進入分析器，根據(jù)離子化方式的不同,分為硬電離和軟電離。常見的電離方式硬電離：

EI(ElectronImpactIonization):電子轟擊電離CI(ChemicalIonization):化學電離FD(FieldDesorption):場解吸FAB(FastAtomBombardment):快原子轟擊軟電離：

ESI(ElectrosprayIonization):電噴霧電離MALDI(MatrixAssistedLaserDesorption):基質(zhì)輔助激光解吸電離APCI(AtmosphericPressureChemicalIonization):大氣壓化學電離為什么不能使用硬電離方式分析蛋白分子？硬電離方式破壞化學鍵硬電離方式破壞蛋白質(zhì)，生成氨基酸、氨基酸碎片、多肽等復雜的組合物一個單一的蛋白質(zhì)，其硬電離質(zhì)譜會產(chǎn)生10,000種不同的峰--toocomplextoanalyze諾貝爾獎的提示對離子源的貢獻—軟電離方式目前有兩種做法能使得蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)離子而不會改變其結(jié)構(gòu)與形態(tài)。由JohnB.Fenn所發(fā)展的方法是運用一個很強的電場將試樣噴灑出去(ESI)，而產(chǎn)生一個個帶電荷並能自由飛翔的離子。運用一個強烈的激光脈沖，在適當?shù)臈l件下(視能量，與試樣的結(jié)構(gòu)和化學環(huán)境而定)運作，試樣可接受激光脈沖的能量而被釋放成為自由的離子(MALDI)，由KoichiTanaka最先提出的技術。軟電離方式337nmUVlaserMALDIcyano-hydroxycinnamicacidGoldtipneedleFluid(nosalt)ESI+_電噴霧電離質(zhì)譜術

ESI（Electrosprayionisation）RayleighLimitReached++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--Evaporation++ChargedDroplets試樣離子準分子離子AnalyteIonsSolventIonClustersSalts/IonpairsNeutrals++++++++--其他離子ESI電離機制陽離子或陰離子模式?如果樣品具有容易接收H+的功能團(例如氨基化合物、肽和蛋白質(zhì)上所帶的氨基)，那么使用正離子檢測法。如果樣品具有容易失去H+的功能團(例如羧酸、核酸和糖上所帶的羥基)，那么使用負離子檢測法。溶液pH值的高低，控制了樣品的官能基（functionalgroup）離子化的狀況。pH值高于5，C-terminal的部份才會離子化，pH值低于7的時候，N-terminal的氫才會游離，lysine和arginine的N端通常要低于pH3.5才會離子化，這表示在酸性溶液中（如pH3.5或更低）會使蛋白質(zhì)帶正電，在堿性環(huán)境中則讓蛋白質(zhì)帶負電，ESI一般都在酸性環(huán)境下分析帶正電的peptideion。蛋白質(zhì)分子帶電荷電噴霧電離毛細管直徑0.1~0.2mm。

噴霧電壓：毛細管尖端與離子引入口之間，3~8kV。

殼氣(Sheathgas),從毛細管端與噴霧反向加熱后流出。離子通過取樣錐(Skimmer)和毛細管(Capillary)傳送至光學聚焦系統(tǒng)。電噴霧電離的基本過程ReproducedfromKebarle,P.J.MassSpectrom.2000,35,804-817.

電場下的噴霧帶電霧滴殼氣的作用下溶劑的蒸發(fā)電荷的庫侖作用帶電霧滴的解體

Rayleigh極限表面張力和庫侖斥力的平衡點電噴霧電離產(chǎn)生多電荷離子：可以用質(zhì)譜儀的小的質(zhì)量范圍測定大的生物分子，相當于將質(zhì)譜儀的質(zhì)量范圍放大的n倍。多電荷離子的有關計算對于蛋白質(zhì)，產(chǎn)生的多電荷離子為：[M+nH]n+，系列離子假設某一質(zhì)譜峰(m/z)1對應的離子為[M+nH]n+,另一相鄰質(zhì)譜峰(m/z)2對應的離子為[M+(n+1)H](n+1)+,且兩個峰均為同一蛋白質(zhì)產(chǎn)生，則可通過建設聯(lián)立方程組來得到M和n的具體數(shù)值:解方程組得到M和n?？梢跃幹瞥绦?qū)⑺邢嚓P的峰進行計算并取平均值，則可得到較精確的分子量信息。這一過程稱作解卷積(Deconvolution)。肌紅蛋白電噴霧質(zhì)譜圖帶10~30個電荷的系列分子離子影響ESI因素：樣品的pKa和溶液的pH。在低pH值條件下有利于樣品分子質(zhì)子化，提高pH導致靈敏度和分子所帶電荷的數(shù)目減少。在正離子檢測中，溶液pH通常至少低于樣品的pKa2個單位。在負離子檢測中，溶液pH比樣品pKa高2個單位。溶劑的性質(zhì)。溶劑應具有較低的汽化點，有較低的黏度和表面張力。去溶劑時干燥氣體的溫度和流速。應保持較高的溫度及流速以利于去溶劑。但也應注意過高的溫度可能導致樣品分解。不能使用不揮發(fā)的無機鹽緩沖液作為ESI的溶劑。ESI小結(jié)：樣品引入方式：a).流動注射.b).LC/MS接口c).流速一般小于1mL/min優(yōu)點：a).離子性,極性化合物;b).[M+nH]n+或[M-nH]n-c).m/z小于4000;d).低化學噪音;e).容易獲的碎片離子信息f).MS/MS缺點:a).不能分析非極性化合物;b).金屬離子干擾,Na,Kc).離子源結(jié)構(gòu)復雜,質(zhì)量范圍:分子量可達1000,000Da基質(zhì)輔助激光解吸電離技術MALDI

(Matrix-assistedlaserdesorption/ionization)

基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)試樣溶解或懸浮于基質(zhì)中，激光束輻射到基質(zhì)和試樣分子上?；|(zhì)吸收激光束能量后汽化，部分試樣分子伴隨基質(zhì)的汽化而解吸。基質(zhì)吸收大部分激光能量，減少了試樣分子被激光能量破壞及過度電離成碎片離子。激光：固體氮激光，紫外光波長：337nm

功率：106~108W/cm2

脈沖時間：10-6~10-9秒關于基質(zhì)：極性化合物溶解樣品芳環(huán)吸收激光易結(jié)晶均勻分散樣品分子

MALDI常用基質(zhì)基質(zhì)性狀適用波長應用煙酸固體266nm,2.94m,10.6m蛋白質(zhì)2,5-二羥基苯甲酸固體266nm,2.94m,10.6m蛋白質(zhì)芥子酸固體266nm,337nm,355nm,2.94m蛋白質(zhì)-氰基-4-羥基肉桂酸固體337nm,355nm蛋白質(zhì)3-羥基吡啶甲酸固體337nm,355nm核酸、配糖體2-(4-羥基苯偶氮)苯甲酸固體266nm,337nm蛋白質(zhì)、配糖體琥珀酸固體2.94m,10.6m蛋白質(zhì)、核酸間硝基芐醇液體266nm蛋白質(zhì)甘油液體2.94m,10.6m蛋白質(zhì)鄰硝苯基辛基醚液體266nm,337nm,355nm合成高分子能夠嵌入樣品分子間并能起到隔離樣品分子之間的相互作用(如形成共結(jié)晶);能溶解于可溶解樣品分子的溶劑;在真空狀態(tài)下是穩(wěn)定的;可吸收激光,既與激光形成共振吸收;可激發(fā)樣品分子離子化。MALDI基質(zhì)應具有的特性

樣品引入方式：a).直接進樣

優(yōu)點：a).快速獲得分子量的信息;b).快速獲得混合肽的肽譜.缺點:a).金屬離子干擾,Na,K；b).離子源結(jié)構(gòu)復雜,；c).沒有LC/MALDI接口；d).實現(xiàn)MS/MS困難e).需要基質(zhì)質(zhì)量范圍:分子量小于500,000DaMALDI小結(jié)：MALDIANDESIMALDI固相高能離子轟擊單電荷離子基質(zhì)離子易操作ESI液相強電場多電荷離子污染離子操作相對復雜質(zhì)量分析器Massanalysis質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的核心,它將離子源產(chǎn)生的離子按其質(zhì)荷比(m/z)的不同﹑在空間的位置﹑時間的先后或軌道的穩(wěn)定與否進行分離,以便得到按m/z大小順序排列而成的質(zhì)譜圖。兩組四極桿分別加上+(u+Vcont)和–(u+Vcont)，其中u直流電壓部分，Vcont為射頻電壓部分=2f,f為頻率。一、四極桿質(zhì)量分析器(QuadrupoleMassAnalyser)在場的中心和兩條對角線上的任何一點電位為零。通過直流和射頻電壓的改變來控制不同荷質(zhì)比的離子通過；可以允許單一荷質(zhì)比的離子通過；也可以進行荷質(zhì)比掃描massscanningmodem1m3m4m2m3m1m4m2singlemasstransmissionmodem2m2m2m2m3m1m4m2四級桿掃描模式離子在四級桿中的穩(wěn)定性三重四級桿離子阱質(zhì)譜由四極桿質(zhì)譜儀發(fā)展而來。四極桿變?yōu)榄h(huán)極，四極桿兩端加端帽。端帽和環(huán)極上均加有直流電壓U，射頻電壓(振幅為V，角頻率)。二、離子阱質(zhì)量分析器(IonTrapMassAnalyser,IT)二級質(zhì)譜：捕集(Trapping)，排除(Elimination)捕獲(Capture)，碰撞(Collision)掃描(Scanning)檢測(Detection)多級質(zhì)譜：上述步驟的重復過程。Trapping1Elimination2Capture3Collision4Scaning5離子阱的多級質(zhì)譜分析三、飛行時間質(zhì)量分析器(TimeOfFlightMassAnalyser,TOF)離子源中的離子經(jīng)加速電壓獲得的速度為：其中ze為電荷，V為加速電壓，m為質(zhì)量。飛行管長度L，到達檢測器的時間為：質(zhì)量越大，飛行時間越長，實現(xiàn)分離。m1和m2兩個離子：用已知樣品進行校正，得到未知離子的質(zhì)量。反射式或折射式：靠電場將飛行的離子反射回來，在反射端接有檢測器。好處：提高分辨力和靈敏度。對靈敏度的提高：中性分子也會在電離過程中產(chǎn)生，并飛向檢測器，但中性分子不能被反射，不能到達反射檢測器所在位置，減小本底噪音，提高靈敏度。對分辨率的提高：速度快的離子動能相對較大，克服電場阻力的能力大，打入