轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后加工

transcriptionandpost-transcriptionalprocessing

(轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工)

陳熙C4005

xi.chen@主要內(nèi)容轉(zhuǎn)錄概述原核生物RNA聚合酶原核生物轉(zhuǎn)錄過程真核生物轉(zhuǎn)錄特點真核生物基因的啟動子及轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝主要內(nèi)容轉(zhuǎn)錄后加工rRNA前體的加工tRNA前體的加工mRNA前體的加工RNA的自我剪接真核mRNA前體的剪接真核mRNA前體的選擇性剪接RNA的編輯transcription（一）概述以DNA為模板合成RNA的過程。轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制的區(qū)別Template(模板)模板鏈(templatestrand)：反義鏈(anti-sensestrand)非模板鏈(non-templatestrand):編碼鏈(codingstrand),有意義鏈(sensestrand)

differentgenesmayusedifferentstrandsastemplate（二）原核生物RNA聚合酶E.coliRNA聚合酶全酶(holoenzyme)：

α2ββ’ωσ核心酶(coreenzyme)：

α2ββ’ωDNA指導(dǎo)的RNA聚合酶DNAdependentRNApolymerase(DDRP)β’αα

ωσcoreenzyme細(xì)菌中單一類型的RNA聚合酶負(fù)責(zé)合成所有的RNA。利用SDS從E.coliRNA聚合酶中分離各個亞基亞基基因分子量(kD)數(shù)目功能αrpoA402酶的裝配，與啟動子上游元件及活化因子結(jié)合βrpoB1501結(jié)合底物，催化磷酸二脂鍵形成β’rpoC1601結(jié)合DNA模板σrpoD32-901識別啟動子，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始ω9未知σ因子的結(jié)構(gòu)σ70因子的一級結(jié)構(gòu)σ因子與啟動子的特異性相互作用E.coli與枯草桿菌各的σ因子同源區(qū)結(jié)合核心酶后（三）轉(zhuǎn)錄過程promoterterminatorStartpoint+10+20downstream+1upstream-35-10–1transcribedregion1.templaterecognition（模板的識別）2.Initiation(起始)3.elongation(延伸)4.termination（終止）原核生物轉(zhuǎn)錄過程啟動子（promoter）：RNA聚合酶識別，結(jié)合并開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。模板的識別轉(zhuǎn)錄起始位點-35序列-10序列TTGACATATAAT五種不同啟動子的共同順序箭頭表示突變，向上表示增加轉(zhuǎn)錄水平，向下表示降低轉(zhuǎn)錄水平提供RNA聚合酶識別信號有助于DNA局部雙鏈解開σ因子對RNA聚合酶與DNA結(jié)合的影響σ因子使RNApol特異性的識別啟動子σ因子的更替可控制轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄的起始RNA鏈的合成方向5′→3′轉(zhuǎn)錄的延伸σ循環(huán):RNA聚合酶與啟動子結(jié)合,使DNA局部熔解,當(dāng)轉(zhuǎn)錄延伸時,σ因子與核心酶分離,與其它新的核心酶結(jié)合,起始新的轉(zhuǎn)錄事件.轉(zhuǎn)錄的終止終止子（terminator）：提供終止信號的DNA序列。E.coli有兩類不依賴ρ因子的終止子:

依賴于ρ因子的終止子不依賴ρ因子的終止子:簡單終止子，又稱內(nèi)在終止子（Intrinsicterminator）轉(zhuǎn)錄終止不依賴任何輔助因子。而依靠轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成特殊的莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，富含GC莖環(huán)結(jié)構(gòu)后有寡聚尿苷依賴ρ因子的終止子（rho-dependentterminators）窮追(Hotpursuit)模型通讀(read-through)：某些因子可使酶越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄?？菇K止因子(anti-terminationfactor)：引起抗終止作用的蛋白質(zhì)。常見于某些噬菌體的時序控制通讀典型的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是單順反子mRNA（四）真核生物轉(zhuǎn)錄特點真核DNAPAPBPC轉(zhuǎn)錄mRNAABC原核DNAABCP轉(zhuǎn)錄mRNAABC真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯在時間上和空間上都是分開的，轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核，翻譯在細(xì)胞質(zhì)。

真核細(xì)胞RNApol高度分工啟動子更復(fù)雜和更多樣性，不同的RNA聚合酶有不同的啟動子真核生物轉(zhuǎn)錄需要許多轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF）的參與。真核基因DNA的順式作用元件比原核復(fù)雜得多真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以正調(diào)控為主。轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactors）Definition:

轉(zhuǎn)錄起始所需要的，而非RNA聚合酶本身組分的任何蛋白質(zhì)Functions:BindingtoDNARecognizinganotherfactorRecognizingRNAPolIncorporatingintoinitiationcomplex轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactors）轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactors）Classification：普遍性轉(zhuǎn)錄因子：使RNA聚合酶結(jié)合到啟動子上，形成前起始復(fù)合物。其作用相對較弱，

僅在本底水平上支持轉(zhuǎn)錄并實施最小程

度的調(diào)控。又稱通用因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子：通過與啟動子及增強子等調(diào)控元件結(jié)合而調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性的蛋白因子包括上游因子和可誘導(dǎo)因子是在所有啟動子的RNA合成中都是必需的。是能夠識別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始位點上游的特異性短序列的DNA結(jié)合蛋白。普遍存在，且活性不被調(diào)控。在特定的時間或特定的組織被激活或合成，能控制轉(zhuǎn)錄在特定的時間和地點進(jìn)行的一類因子。通用因子(Generalfactor)上游因子(Upstreamfactor)可誘導(dǎo)因子(Induciblefactor)轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactors）順式作用元件（Cis-actingelements）Definition:

指與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)、能夠被調(diào)控蛋白特異性識別和結(jié)合的特異DNA序列。包括啟動子、增強子，負(fù)調(diào)控元件等反式作用因子(Trans-actingfactors)Definition:

指真核細(xì)胞內(nèi)通過與順式作用元件相互作用而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子。

S1核酸酶圖譜技術(shù)引物延伸法測定轉(zhuǎn)錄起點的方法（五）真核生物基因轉(zhuǎn)錄起始的幾種研究方法1.S1核酸酶圖譜技術(shù)5’mRNA3’3’5’S1探針5’3’3’5’S1核酸內(nèi)切酶水解變性電泳5’mRNA3’3’5’S1探針5’mRNA3’3’5’逆轉(zhuǎn)錄延伸引物變性電泳2.引物延伸法1.5’端缺失系列分析法:常用于測定哺乳動物基因調(diào)控區(qū)的上游邊界研究順式作用元件結(jié)構(gòu)的方法5’端缺失系列分析法AB切割位點AB核酸外切酶CAB連接接頭ABCAB切割位點B和C報告基因連接報告基因載體轉(zhuǎn)化E.coli分離質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞通過報告基因產(chǎn)物的活性，以檢測基因活化與上游調(diào)控區(qū)片段的關(guān)系2.接頭掃描突變法可以找出存在于基因轉(zhuǎn)錄起始位點和5’端邊界之間的所有調(diào)控元件方法的基礎(chǔ)是構(gòu)建一系列序列重疊的調(diào)控區(qū)突變體，每個突變體內(nèi)各有一個短序列的核苷酸序列被打亂，然后分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，或微量注入爪蟾卵母細(xì)胞，并分析它們對報告基因的影響接頭掃描突變法機制皰疹病毒胸苷激酶基因啟動子的連接掃描突變（六）真核生物RNA聚合酶對α-鵝膏蕈堿的敏感性

酶的種類

中等敏感

RNA聚合酶III

敏感

RNA聚合酶II

不敏感

RNA聚合酶I

1.真核細(xì)胞的三類RNA聚合酶α-鵝膏蕈堿的結(jié)構(gòu)鬼筆鵝膏菌是一種能產(chǎn)生α-鵝膏蕈堿的毒磨RNA聚合酶對α-鵝膏蕈堿的敏感性（核仁）（核質(zhì)）U6snRNA,7SLRNA,7SKRNA老鼠肝臟細(xì)胞三類RNA聚合酶在離子交換層析中的分離RNA聚合酶I定位于核仁RNA聚合酶II和III定位于核質(zhì)

EukaryoticRNApolIIhas>10subunits2.RNA聚合酶II酵母RNA聚合酶II有12個亞基核心亞基：Rpb1、Rpb2和Rpb3共同亞基：

Rpb5、6、8、12存在于所有三類RNA聚合酶中非必要亞基：Rpb4、7RNA聚合酶II最大亞基的異質(zhì)性CTD:

carboxylterminaldomain（C末端結(jié)構(gòu)域）Aminoacidsequence:

—Tyr—Ser—Pro—Thr—Ser—Pro—Ser—TargetforkinaseFunction:triggerinitiation老鼠漿細(xì)胞RNApolII部分亞基結(jié)構(gòu)o、a、b是最大亞基的三種形式與酵母的RNApolII的Rpb1相對應(yīng)c是與酵母的Rpb2相對應(yīng)RNApolII最大亞基不同形式間的相互關(guān)系IIa是CTD未被磷酸化的形式，主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的起始IIo是CTD被磷酸化的形式，主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的延伸IIb是被蛋白酶消化而失去CTD的形式thecrystalstructureofRNApolymeraseIIfromyeast（七）真核生物基因的啟動子及轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝類型I啟動子類型II啟動子類型III啟動子類型II啟動子基本啟動子(basalpromotor)轉(zhuǎn)錄起始位點(initiationsite,Inr)上游元件(upstreamelements)下游元件(downstreamelements)核心啟動子(corepromotor)啟動子近側(cè)序列元件上游元件下游元件序列名稱位置序列反式作用因子TATA-box

-25~–30TATAAAA

TBP作用是確定精確的轉(zhuǎn)錄起始位點，而不起調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄效率的功能基本啟動子(basalpromotor)序列名稱位置序列

反式作用因子CCAAT-box

-75~-80GGCCAATCT

CTFC/EBPGC-box

-90GGGCGG

sp1上游元件(upstreamelements)常表現(xiàn)出細(xì)胞類型特異性，功能主要是提高轉(zhuǎn)錄的效率和特異性類型II啟動子在轉(zhuǎn)錄起始位點周圍有保守的序列，是最適表達(dá)所需要的。共同序列為PyPyANT（Py為嘧啶，N為任意堿基）轉(zhuǎn)錄起始位點(initiationsite,Inr)FunctionsofTFⅡXTBP：特異性地結(jié)合TATAboxTAFⅡ：多亞基，是各種轉(zhuǎn)錄因子的靶位點TFⅡDTBP(TATA-bindingprotein)（TATA框結(jié)合蛋白）TAFⅡ(TBP-associatedfactors)(TBP偶聯(lián)因子)(8-10)X=A,B,D,E,F,H…formationofplatformFunctionsofTFⅡXTFⅡA:

激活TBP，促進(jìn)TFⅡD結(jié)合于TATAboxTFⅡB:結(jié)合于TFⅡD-DNA上，確定轉(zhuǎn)錄起始位點，在TFⅡF協(xié)同下募集RNApolⅡTFⅡF:與RNApolⅡ結(jié)合，抑制RNApolⅡ與DNA的非特異性結(jié)合TFⅡH：ATPase,helicase，kinaseTFⅡE：促進(jìn)TFⅡH的激酶活性Assemblyofpre-initiationcomplex(PIC)轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物DABPolF復(fù)合物形成的模型聚合酶是結(jié)合在TFⅡD，A和B結(jié)合位點（TATAbox）下游的DNA上RNAPolⅡisactivatedbyCTDphosphorylationCTD磷酸化后，使CTD中羥基電荷和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響它與TBP結(jié)合的穩(wěn)定性，使聚合酶從啟動子上脫離TFⅡDTFⅡFRNAPolⅡTFⅡHPiDNARNATFⅡBTFⅡA通用轉(zhuǎn)錄因子參與轉(zhuǎn)錄起始、啟動子清除、延伸的模型a.TBP或TFⅡD，同B、F及聚合酶II形成最基本的起始復(fù)合物添加TFⅡE和H，水解ATP使DNA在起始區(qū)解鏈，CTD部分磷酸化，產(chǎn)生流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄物，很快停止。b.隨著ATP提供能量，TFⅡH使DNA進(jìn)一步解螺旋并使啟動子清空c.CTD進(jìn)一步磷酸化,NTP不斷添加,延伸復(fù)合物不斷進(jìn)行RNA的延伸TBP和TFⅡDB仍留在啟動子上，延伸不需要TFⅡE和H，從延伸復(fù)合物解離下來FunctionsofTAFTFIID中包括至少8種TBP偶聯(lián)因子,分子量為30—250kD,分別命名為TAFⅡ-30～250TAFⅡ150

識別起始子(inr)序列TAF是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的輔助因子，為各種調(diào)控因子提供作用的靶位點它的作用是將上游調(diào)控區(qū)和遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與PIC聯(lián)系在一起，而介導(dǎo)各種反式作用因子對基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。來自克隆基因的產(chǎn)物的果蠅TFIID在體外整合的結(jié)構(gòu)圖果蠅、人和酵母TAFs之間的關(guān)系缺乏TATA框的啟動子含有其他元件包括Inr和下游元件。TAFII250和TAFII150能結(jié)合與這些元件，因而保證了TFIID結(jié)合與啟動子?；蛘咛禺愋哉{(diào)控因子結(jié)合與上游啟動子元件（UPE），這些特異性調(diào)控因子又同一個或數(shù)個TAFII相互作用，把TFIID錨定于啟動子上。對缺乏TATA框啟動子的起始TBP與含有TATA框或不含TATA框的啟動子的相互作用模型TAFII介導(dǎo)各種激活因子的作用許多激活因子通過與TAFII相互作用激活起始裝置NTF-1能結(jié)合于TAFII-150Sp1與TAFII-110結(jié)合真核生物基因轉(zhuǎn)錄受激活因子增強的模型a.最小的TBP/TAF復(fù)合物不能支持激活b.兩種不同的三聚體復(fù)合物支持Gal4-NTF1的激活作用，但不能支持Sp1的激活c.包含有TAFII-100的四聚體復(fù)合物能介導(dǎo)Sp1的激活作用d.完整的TFIID能支持各種激活因子的作用TAFII介導(dǎo)各種激活因子的作用類型I啟動子上游控制元件(Upstreamcontrolelement，UCE)核心啟動子CorepromoterPromotertranscribedregion+1-45+20CorepromoterUCE-180-107CorepromoterUCErRNA的兩個元件Tjian及其同事用接頭分區(qū)突變法研究人類rRNA基因，結(jié)果顯示UCE是最佳轉(zhuǎn)錄所必需的，但本底水平的轉(zhuǎn)錄不一定需要UCE的參與，而核心元件是轉(zhuǎn)錄所必需的Tjian及其同事用接頭分區(qū)突變法研究人類rRNA基因的UCE和核心元件間插入或缺失不同長度的DNA序列，證實兩個元件間的距離對轉(zhuǎn)錄起始也是非常重要的。兩者之間插入或缺失堿基對，啟動子強度將減弱，而且缺失比插入更敏感。rRNA的兩個元件間的距離對啟動子強度的影響UBFSL-1(Selectivityfactor1)Trans-factors(Upstreambindingfactor)UBF：能結(jié)合于UCE和CorepromoterSL-1:由TBP(TATA-bindingprotein)和3種TAFI組成SL-1本身不能結(jié)合于啟動子，但能同RNApol結(jié)合SL-1：使RNApolI正確的定位在起始位點RNA聚合酶I的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物UCECorepromoterUBFUBFRNAPOLTAFITAFITAFITBPRNA聚合酶I的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的裝配類型III啟動子基因內(nèi)啟動子：基因外啟動子:基因內(nèi)I型啟動子：由被中間元件分開的A盒和C盒組成5SrRNA基因基因內(nèi)II型啟動子：由被中間元件分開的A盒和B盒組成tRNA基因U6snRNA基因，7SKRNA基因類似類型II啟動子，有TATA框，能與含TBP的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合混合啟動子：海膽硒代半胱氨酸t(yī)RNA(ser)sec基因ThreetypesofpromotersforRNApolymeraseIIIBydeletionInternalpromoterof5srRNAgene:+55~+803’端序列缺失對5SrRNA基因轉(zhuǎn)錄的影響a.Brown及同事對爪蟾5SrRNA基因3’端序列進(jìn)行缺失，于體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。3’端序列缺失但沒越過啟動子序列，仍能轉(zhuǎn)錄，只是產(chǎn)物比全長rRNA短，轉(zhuǎn)錄事件的發(fā)生表明啟動子是完整的，3’端序列缺失到啟動子序列，轉(zhuǎn)錄終止b.只有當(dāng)3’端序列缺失延伸到＋80位時，才無轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的合成transcriptionfactorsforRNAPolⅢInitiationfactorsAssemblyfactorsTFⅢBTFⅢATFⅢCTBP

2prRNApolⅢ的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的裝配tRNA基因內(nèi)啟動子BetweenSL1、TFⅢBandTFⅡDFactorComponentsFunctionsRNAPolSL1TBP&3pr本身不結(jié)合DNA，使RNApol正確定位于起始位點ⅠTFⅢBTBP&2prⅢTFⅡDTBP&10-12pr特異性地結(jié)合TATAboxⅡ1.轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物的裝配都是由能識別啟動子內(nèi)特異性位點的裝配因子開始的。在DNA序列上，它吸納、招募PIC的其他組分。轉(zhuǎn)錄起始的一般規(guī)律3種聚合酶對不含TATAbox的啟動子起始前復(fù)合物的識別模型在I,II,III類啟動子上，最先結(jié)合的組裝因子分別是UBF，SP1，TFIIIC，隨后結(jié)合含TBP的另一因子分別是SL1，TFIID和TFIIIB。對I,III類啟動子而言足以結(jié)合聚合酶起始轉(zhuǎn)錄，但I(xiàn)I類啟動子還需要更多的通用因子參與轉(zhuǎn)錄。2.TBP在所有各種已知類型的真核啟動子中起組織作用3.TBP的特異性由與它偶聯(lián)的TAFs控制。TBP攜帶有某一套TAF，它就會在形形色色啟動子中結(jié)合于某一個啟動子位點post-transcriptionalprocessing主要內(nèi)容rRNA前體的加工(自學(xué))tRNA前體的加工(自學(xué))mRNA前體的加工RNA的自我剪接真核mRNA前體的剪接真核mRNA前體的選擇性剪接RNA的編輯（一）rRNA前體的加工原核細(xì)胞有3種rRNA：16S、23S和5SrRNA真核細(xì)胞有4種rRNA：28S、18S、5.8S和5SrRNA三種rRNA是一個轉(zhuǎn)錄單位，一起轉(zhuǎn)錄的原核生物RNaseⅢⅢⅢⅢEE三種rRNA是一個轉(zhuǎn)錄單位，一起轉(zhuǎn)錄的真核生物4種rRNA，是兩個轉(zhuǎn)錄單位，18S、5.8S和28SrRNA的前體是45S，是一個轉(zhuǎn)錄單位，5SrRNA是單獨的一個轉(zhuǎn)錄單位。核仁是其轉(zhuǎn)錄、加工和裝配成核糖體的場所40S亞基60S亞基核酸內(nèi)切酶在兩端切斷，E.coliRNAaseP是5’成熟酶核酸外切酶:RNAaseD從3’端逐個切去附加的順序3’端加上-CCA-OH核苷酸的修飾（二）tRNA前體的加工原核生物tRNA核苷酰轉(zhuǎn)移酶CTP、ATP3’端加上-CCA-OH（1）甲基化如：AAm核苷酸的修飾（1）（1）（3）（2）（4）（2）還原反應(yīng)如：UDHU（3）核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)如：Uψ（4）脫氨反應(yīng)如：AI第一步:核酸內(nèi)切酶切除插入序列，不需ATP；第二步:RNA連接酶連接，需要ATP。核tRNA的酶促拼接由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄，加工與原核相似，但3’端的CCA都是后加的，還有2’-O-甲基核糖。真核生物（三）mRNA前體的加工細(xì)菌多數(shù)不用加工，轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的。也有少數(shù)多順反子信使RNA必須由內(nèi)切酶切成較小的單位，然后翻譯。原核生物初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：hnRNAs（heterogeneousnuclearRNAs，核內(nèi)不均一RNA），是mRNA的前體（pre-mRNA）hnRNA的物理結(jié)構(gòu)是核糖核蛋白

(hnRNP

heterogeneousnuclearribonucleoproteins)真核生物mRNA前體的剪接信號內(nèi)含子相同的開頭和結(jié)尾5’GU…..AG3’內(nèi)部有個保守的A參與形成分支剪接中間物3’剪接位點AG前有一個嘧啶復(fù)含區(qū)（PPT）雞卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工雞卵清蛋白基因5’端加帽子3’端加尾剪接（splicing）成熟的mRNA（四）RNA的自我剪接(Self-splicing)Ⅰ型內(nèi)含子（groupⅠ

intron）的自我剪接Ⅱ型內(nèi)含子（groupⅡ

intron）的自我剪接Ⅰ型內(nèi)含子的自我剪接GroupⅠThestructureofgroupⅠintronsⅡ型內(nèi)含子的自我剪接OP5’POH3’OPHOA2’外顯子I外顯子IIPOAOHOH5’POH3’OPPOAO5’POH3’P活性中心Ⅱ型內(nèi)含子的二級結(jié)構(gòu)及活性中心SplicingreleasesmitochondrialgroupIIintronsintheformoflariats(套索結(jié)構(gòu)).Definition:

泛指具有催化功能的RNA的分子核酶（ribozyme）（五）真核mRNA前體的剪接Splicingmechanism:similartogroupⅡintronStructureofsnRNAs:similartogroupⅡintronSplicesome（剪接體）snRNAsproteinssnRNA:smallnuclearRNA(核內(nèi)小分子RNA)snRNP:

smallnuclearribonucleoprotein(小分子核內(nèi)核糖核蛋白):U1、U2、U4、U5、U6snRNAsnRNPshnRNAsOtherproteinsSpliceosomesareellipsoidal(橢圓形)

particleswithseveraldiscreteregions.Pre-mRNAGroupⅡMechanismofspl