等位基因特異性PCR原理和應(yīng)用-2015116-

等位基因特異性PCR的原理與應(yīng)用2015.1.16內(nèi)容概要基本原理實驗方法臨檢項目—KRAS、EGFR突變檢測科研應(yīng)用—BSG位點(diǎn)分型等位基因特異性PCR的基本原理單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測方法限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）變性高效液相色譜（DHPLC）異源雙鏈分析（HA）基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）動態(tài)等位基因特異性雜交（DASH）基因芯片法TaqMan探針技術(shù)焦磷酸測序法……？操作繁瑣耗時長產(chǎn)物污染靈敏度低儀器昂貴等位基因特異性PCR等位基因特異性PCR（AlleleSpecific-PCR，AS-PCR）又稱擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)PCR（AmplificationRefractoryMutationSystem-PCR，ARMS-PCR）PCR擴(kuò)增過程中，引物從3’末端開始延伸，要求3’端堿基與模板完全配對等位基因特異性PCR基本原理YouF.M.2008,BMCBioinformaticsTwoAllele-Specific(AS)primers,oneforeachalleleofaSNParedesigned.TheASprimerscontainoneoftwopolymorphicnucleotidesattheprimer3'end.Twosetsofprimers,eitherforwardorreverseprimerscanbedesigned.IfacommonreverseorforwardprimerisusedinaPCRreaction,thereactioniscalledallele-specificPCR(AS-PCR).四引物法ARMS-PCR單管反應(yīng)凝膠電泳耗時長開管操作易污染缺陷：使用熒光定量PCR檢測realtimePCR速度快閉管操作不易污染等位基因特異性PCR技術(shù)特點(diǎn)靈敏度高（0.1-1%）操作簡便周期短不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物污染適用樣本類型多（如FFPE）精確突變類型方法建立需時較長僅能檢測已知突變適用于臨床檢驗優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)測序法與等位基因特異性PCR法比較Sanger測序法焦磷酸測序ARMS敏感度10-20%5-10%1%FFPE標(biāo)本成功率低較高高商用試劑盒無有有流程與速度1-2天2-3天<1天數(shù)據(jù)分析要求高高低試劑成本低低略高儀器成本高高低等位基因特異性PCR的

實驗方法操作流程及數(shù)據(jù)解讀實驗操作收到樣本之后：試劑盒（以友芝友EGFR試劑盒為例）編號位點(diǎn)內(nèi)容規(guī)格1G719XPCR緩沖液、G719X引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl2S768IPCR緩沖液、S768I引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl3T790MPCR緩沖液、T790M引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl4L858RPCR緩沖液、L858R引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl5L861QPCR緩沖液、L861Q引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl6INSPCR緩沖液、Ins引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl7DELPCR緩沖液、Del引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl8質(zhì)控（外控）PCR緩沖液、質(zhì)控引物探針、內(nèi)標(biāo)、參比染料ROX23μl突變探針：FAM熒光標(biāo)記；內(nèi)標(biāo)探針：VIC熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增ABI7500開機(jī)，儀器自檢；將準(zhǔn)備好的8連管放置在儀器樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序；信號采集：EGFR基因：FAM通道；內(nèi)標(biāo)：VIC通道；PCR反應(yīng)條件：37℃：10分鐘95℃：5分鐘95℃：15秒60℃：60秒核酸擴(kuò)增區(qū)40循環(huán)陰性對照和陽性對照陰性對照（空白對照）

應(yīng)無FAM熒光信號產(chǎn)生，或Ct值≥38

陽性對照（弱陽性對照）FAM通道Ct值≤32，VIC通道Ct值<38，但可能會由于不同儀器的不同閾值設(shè)置而發(fā)生波動。無DNA污染驗證PCR有效性樣品的外控和內(nèi)控待測樣品的外控（8號管FAM信號曲線）應(yīng)有FAM信號以友芝友試劑盒為例：FAM通道23≤Ct值≤30；待測樣品的內(nèi)控（1-7號管的HEX/VIC/JOE信號曲線）應(yīng)有擴(kuò)增曲線以友芝友試劑盒為例：樣品檢測中VIC通道Ct值<38。Ct<23：DNA加入過量30<Ct<34：DNA加入量較低Ct≥34：需重新制備樣本結(jié)果判定反應(yīng)液突變類型陰性陰性陽性Ct值Ct值ΔCt值Ct值ΔCt值G719XPCR反應(yīng)液G719XCt>38或無Ct值Ct≤38≥9Ct≤38<9S768IPCR反應(yīng)液S768I

Ct>38或無Ct值Ct≤38≥8Ct≤38<8T790MPCR反應(yīng)液T790MCt>38或無Ct值Ct≤38≥8Ct≤38<8L858RPCR反應(yīng)液L858RCt>38或無Ct值Ct≤38≥7Ct≤38<7L861QPCR反應(yīng)液L861QCt>38或無Ct值Ct≤38≥7Ct≤38<7InsPCR反應(yīng)液插入Ct>38或無Ct值Ct≤38≥7Ct≤38<7DelPCR反應(yīng)液缺失Ct>38或無Ct值Ct≤38≥7Ct≤38<7ΔCt=突變檢測Ct–內(nèi)控檢測Ct以友芝友EGFR試劑盒為例臨檢項目—KRASKRAS背景KRAS是一種原癌基因，長約35kb，位于12號染色體，是RAS基因家族成員之一，編碼的蛋白主要參與PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信號通路的調(diào)控；EGFR在通路中位于KRAS上游，配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致KRAS的活化和通路中信號傳導(dǎo)；KRAS是許多惡性腫瘤的常見突變基因：胰腺癌（65%-90%）、結(jié)直腸癌（40%）、肺癌（20%）、卵巢癌（15%）。KRAS基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效KRAS基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從EGF抗體（西妥昔單抗、帕尼單抗）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；KRAS突變型患者對西妥昔單抗無應(yīng)答，其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者KarapetisCS,2008,NEngJMed結(jié)直腸癌患者檢測KRAS突變相關(guān)指南歐洲藥品評估局（EMEA，2008）指出：KRAS野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。美國臨床腫瘤學(xué)會（ASCO，2009）推薦：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測KRAS突變，如有KRAS12、13位突變，則不應(yīng)進(jìn)行EGFR單克隆抗體治療；美國FDA指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前必須檢測KRAS基因的基因型；2012年7月6日批準(zhǔn)第一個用于結(jié)直腸癌的基因檢測（Qiagen），以判斷西妥昔單抗是否有效；美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2014）指南說：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行RAS突變檢測（KRAS和NRAS），至少應(yīng)檢測KRAS第二外顯子的突變情況。KRAS或NRAS突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。中國衛(wèi)生部于2010年10月14日發(fā)表了《結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010版）》。明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受西妥昔單抗、帕尼單抗時，必須檢測腫瘤組織的K-ras基因狀態(tài)。在晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測腫瘤K-ras基因狀態(tài)，EGFR不推薦作為常規(guī)檢查項目。KRAS突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效KRAS基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易發(fā)生抵抗。KRAS突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示）AndersonSM,2011,ExpertRev.Mol.DiagnEberhardDA,2005,JClinOncol非小細(xì)胞肺癌患者檢測KRAS突變相關(guān)指南美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2009）指出，KRAS突變與非小細(xì)胞肺癌患者TKI抵抗有關(guān)，KRAS基因測序有助于確定哪些病人適合TKI治療。當(dāng)KRAS基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)行分子靶向治療。KRAS主要突變位點(diǎn)在結(jié)直腸癌中，KRAS突變主要發(fā)生于codon12(80%)、codon13(15-20%)、codon61和146(<5%)；在肺癌中，約97%的KRAS突變發(fā)生于codon12、13，其余位于codon61和146。突變密碼子堿基變化CosmicIDGly12Asp12GGT＞GAT521Gly12Val12GGT＞GTT520Gly12Ala12GGT＞GCT522Gly12Ser12GGT＞AGT517Gly12Cys12GGT＞TGT516Gly12Arg12GGT＞CGT518Gly13Asp13GGC＞GAC532擬開發(fā)產(chǎn)品特異性引物：7條

（已驗證特異性）參照引物：1條

（已驗證特異性）下游引物：1條

（已驗證特異性）Taqman探針：1條

（已設(shè)計，待訂購）鎖核酸阻滯探針：1條（已設(shè)計，待訂購）陽性對照：包含7種突變的質(zhì)粒DNA模板（已制備并測序）Taq酶，最好為TaqGold（hotstartenzyme)qPCR混合反應(yīng)液項目進(jìn)展-KRAS第二批引物能較好區(qū)分質(zhì)粒DNA突變（SYBRgreen染料，ABI7500）模板引物Cт516516P24.03719517516PUndetermined518516PUndetermined520516PUndetermined521516P36.00975522516P38.87938532516P39.47913WT516PUndetermined陰參516PUndetermined模板引物Cт516517PUndetermined517517P23.0278518517PUndetermined520517PUndetermined521517PUndetermined522517PUndetermined532517PUndeterminedWT517PUndetermined陰參517PUndetermined516位突變517位突變項目進(jìn)展-KRAS模板引物Cт516532P36.52584517532P36.80177518532P36.39018520532P37.23503521532P36.97367522532P37.01616532532P16.01479WT532P31.0284陰參532PUndetermined模板引物Cт516CP19.89434517CP19.90041518CP19.23109520CP19.56911521CP18.96716522CP18.51238532CP18.76427WTCP19.11962陰參CPUndetermined532位突變參照引物臨檢項目—EGFR檢測EGFR突變背景EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor)基因位于染色體7p11.2，大小192kb，是上皮生長因子（EGF）細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體。研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變與吉非替尼、厄洛替尼的療效密切有關(guān)。其中EGFR突變的患者對吉非替尼、厄洛替尼治療敏感，有效率在80%以上；而EGFR野生型的患者的有效率在10%以下。EGFR酪氨酸激酶上外顯子18-21為最常見的基因突變位點(diǎn)，也是靶向藥物吉非替尼結(jié)合的位點(diǎn)，外顯子19缺失和外顯子21的L858R突變是最常見的與吉非替尼療效相關(guān)的敏感突變。EGFR突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效研究表明EGFR突變型患者使用吉非替尼的療效要優(yōu)于卡鉑與紫杉醇組合治療，而在野生型患者中則相反，使用吉非替尼的療效不如卡鉑與紫杉醇組合治療。MokT.S.2009,NEngJMedMaemondoM.2010,NEngJMedEGFR突變檢測相關(guān)指南美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)2011版的癌癥治療指南中明確指出：EGFR突變，尤其是外顯子19的缺失突變和外顯子21的L858R突變，與腫瘤對TKIs如吉非替尼治療敏感性有重要關(guān)系。而部分EGFR-TKI初始治療有效的患者后期會發(fā)生耐藥，與EGFR外顯子20突變密切相關(guān)。美國臨床腫瘤學(xué)會（ASCO）在JCO上發(fā)表報告：EGFR-TKI是攜帶EGFR突變型的非小細(xì)胞肺癌病人的一線治療藥物，有益于進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌患者的個體化治療。歐洲EMEA指出：易瑞沙（吉非替尼）僅對攜帶EGFR突變型的非小細(xì)胞肺癌患者有效，平均無進(jìn)展生存期延長3.5月。美國FDA（2013）批準(zhǔn)對擬采用阿法替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI治療的患者進(jìn)行EGFR突變檢測的試劑盒（therascreenEGFRRGQPCRKit和cobas?EGFRMutationTest）；我國《非小細(xì)胞肺癌臨床實踐指南》中也明確指出EGFR突變，尤其是19號外顯子缺失突變與腫瘤對酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)的敏感度有重要關(guān)系；對腺癌、大細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等肺癌組織學(xué)類型，EGFR檢測為一類推薦。EGFR突變位點(diǎn)（常規(guī)檢測29個）突變外顯子堿基變化CosmicIDG719A182156G>C6239G719S182155G>A6252G719C182155G>T6253E746-A750del(1)192235-2249del156223E746-A750del(2)192236-2250del156225L747-P753>S192240-2257del1812370E746-A750>I192235-2252>AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750>A192237-2251del1512678E746-S752>A192237-2254del1812367E746-S752>V192237-2250>T(complex)12384E746-S752>D192238-2255del186220L747-A750>P192238-2248>GC(complex)12422L747-T751>Q192238-2252>GCA(complex)12419L747-E749del192239-2247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750>P192239-2248TTAAGAGAAG>C12382L747-P753>Q192239-2258>CA(complex)12387L747-T751>S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369L747-T751>P192239-2251>C(complex)12383T790M202369C>T6240S768I202303G>T6241V769-D770insASV202307-2308insGCC