現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)之 DNA、RNA的分析及轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析技術(shù)

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)

DNA、RNA的分析及轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析技術(shù)

斑點(diǎn)雜交

Southern印跡雜交一核酸雜交Northern印跡雜交

基因芯片等

變性梯度凝膠電泳(DGGE)二突變篩查技術(shù)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)

變性高效液相色譜（DHPLC）化學(xué)切割錯(cuò)配（CCM）蛋白質(zhì)短截檢測(cè)（PPT）等三DNA測(cè)序

四轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析一、核酸雜交

用標(biāo)記的核酸探針鑒定復(fù)雜核酸分子中密切相關(guān)的DNA、RNA的方法。

主要涉及技術(shù)：斑點(diǎn)雜交：

Southern印跡雜交

Northern印跡雜交原位雜交

DNA微陣列技術(shù)

1核酸雜交的概念和基本原理將標(biāo)記的核酸探針變性，與變性后的靶DNA/RNA通過(guò)鹼基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，形成雜種分子的過(guò)程。其目的是鑒定分析復(fù)雜的靶DNA/RNA中與探針同源的核酸片段。

2核酸探針（nucleicacidprobe）1）概念:核酸探針：是指與目的基因或DNA/RNA特異互補(bǔ)的一段核酸片段。探針可是單鏈或雙鏈，但工作的探針必須為單鏈。2）種類：

DNA探針

cDNA探針

RNA探針

3）探針標(biāo)記：將探針標(biāo)記上一種標(biāo)識(shí)物以便于雜交后檢測(cè)。

（1)常用的標(biāo)識(shí)物及檢測(cè)：同位素：32P

,35S

,3H-dNTP等；檢測(cè)方法：放射自顯影優(yōu)點(diǎn)：靈敏度較高不足：放射性物質(zhì)容易衰變；且易導(dǎo)致放射污染

非同位素：標(biāo)記物：地高辛-dUTP，生物素-dUTP。檢測(cè)方法:非同位素標(biāo)記的探針經(jīng)顯色或化學(xué)發(fā)光法等檢測(cè)優(yōu)點(diǎn):無(wú)放射污染,保存時(shí)間較長(zhǎng)缺點(diǎn):

靈敏度較低10①

缺口平移法（NickTranslation）原理及過(guò)程：反應(yīng)體系中DNA酶I隨機(jī)在探針DNA上打開(kāi)缺口；DNA聚合酶I具有5′→3′外切酶活性，在缺口處按5′→3′方向切除單核苷酸；DNA聚合酶I還具有5′→3′聚合酶活性，在缺口處3′端加入底物中單核苷酸，彌補(bǔ)缺口處核苷酸鏈。隨反應(yīng)進(jìn)行，底物中被標(biāo)記單核苷酸隨機(jī)摻入。DNA聚合酶I兩種作用交替進(jìn)行，探針即被標(biāo)記。（2）探針標(biāo)記主要方法

NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP12②.隨機(jī)引物法（六核苷酸引物標(biāo)記法）

原理及過(guò)程：利用E.coliDNA聚合酶I的Klenow亞單位，合成含有標(biāo)記核苷酸的DNA鏈。Klenow具有5′→3′聚合酶活性。待標(biāo)記DNA（探針）變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在Klenow酶催化下，按5′→3′方向合成DNA新鏈。反應(yīng)體系中含有標(biāo)記的dNTP,隨機(jī)摻入新合成DNA鏈中，探針被標(biāo)記。③

應(yīng)用多聚核苷酸激酶進(jìn)行DNA末端標(biāo)記：常用于寡核苷酸探針的標(biāo)記。根據(jù)已知基因序列合成一段長(zhǎng)約15-50個(gè)bp的核苷酸探針。

多聚核苷酸激酶能將dATPγ位的同位素32P置換DNA5′端的P。。④其他：

填充末端標(biāo)記法等1）

斑點(diǎn)雜交：獲取靶DNA（如人類全基因組DNA）的溶液，點(diǎn)樣于一硝酸纖維素膜或尼龍膜上，干燥、固定、雜交。

靶DNA序列的變性：點(diǎn)樣前熱處理或點(diǎn)樣后堿溶液處理。

3核酸雜交的主要方法

等位基因特異性寡核苷酸探針雜交（allele-specific-oligonucleotide,ASO）

適用于基因突變部位和性質(zhì)已完全明確的突變檢測(cè)。合成ASO探針，大小20bp左右，標(biāo)記后用于雜交檢測(cè)。檢測(cè)點(diǎn)突變時(shí)一般需合成兩種探針：設(shè)計(jì)：正常探針：只與正?；蛐蛄须s交形成穩(wěn)定雜交體突變探針：只與突變基因序列雜交穩(wěn)定雜交體

PCR技術(shù)可結(jié)合ASO，即PCR-ASO技術(shù)，以ASO探針檢測(cè)擴(kuò)增后產(chǎn)物——突變基因檢測(cè)。2

）Southern和Northern印跡雜交

通過(guò)凝膠電泳按片段大小分離核酸,然后檢測(cè)：為核酸雜交的主要方法

（1)Southern印跡雜交

因EdwinM.Southern建立的技術(shù)而命名,用于鑒定DNA片段的分子雜交技術(shù)。1)原理：堿基互補(bǔ)2)步驟：

DNA提?。禾崛〗M織或細(xì)胞的基因組DNA

DNA分離：限制酶消化DNA，凝膠電泳分離大小不同的DNA片段Southern印跡雜交DNA變性：凝膠中的DNA在堿性溶液中變性轉(zhuǎn)膜：將變性的DNA片段從凝膠原位轉(zhuǎn)移印跡在硝酸纖維素膜或尼龍膜上。雜交：將標(biāo)記的探針變性，同固著的靶DNA片段雜交，與靶DNA中的互補(bǔ)DNA序列形成異源雙鏈。Southern印跡雜交洗膜：未結(jié)合的多余DNA探針以及非特異性結(jié)合的DNA探針通過(guò)洗膜去除放射自顯影：將雜交的膜進(jìn)行放射自顯影。結(jié)果分析：依雜交信號(hào)在膜上的位置判定DNA大小、信號(hào)強(qiáng)度推測(cè)DNA拷貝數(shù)22-+Southernblot探針

應(yīng)用：基因的定性及定量分析(2)基因突變分析:缺失、插入,影響到酶切位點(diǎn)的點(diǎn)突變

(3)RFLP連鎖分析（2）Northern印跡雜交是一種類似Southern印跡雜交用來(lái)鑒定特定mRNA的方法，可以獲得特異基因表達(dá)的信息?；驹砼cSouthern印跡雜交一致，只是靶核酸為RNA。步驟：RNA提?。簭拇郎y(cè)組織或細(xì)胞提取總RNA或mRNARNA分離：甲醛變性凝膠電泳按照分子量大小分離RNA轉(zhuǎn)膜：RNA從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上雜交：用標(biāo)記的特異基因探針檢測(cè)待測(cè)組織或細(xì)胞中該基因表達(dá)情況洗膜:去除未結(jié)合及非特異性結(jié)合的探針

應(yīng)用

（1）檢測(cè)mRNA分子大?。ㄒ离s交帶位置）（2）mRNA的含量，即基因表達(dá)水平高低（依雜交帶密度）

3)原位雜交

（1）染色體原位雜交：利用一個(gè)標(biāo)記的DNA探針與已經(jīng)原位變性的染色體DNA雜交。常用的技術(shù)為熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)基本原理：應(yīng)用地高辛或生物素標(biāo)記探針DNA，變性成單鏈后與變性后的染色體或細(xì)胞核靶DNA雜交。在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果應(yīng)用：①基因定位②檢測(cè)染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常,進(jìn)行遺傳病的診斷和產(chǎn)前診斷（2）組織原位雜交：利用一個(gè)標(biāo)記的探針與組織切片上的RNA雜交。組織切片可由石蠟包埋或冰凍切片（3）整裝原位雜交（wholemountinsitu）：在一個(gè)完整胚胎中研究基因表達(dá)

DNA微陣列(DNAmicroarrays)技術(shù):反向核酸雜交方法。

4)DNA微陣列基因芯片（又稱DNA芯片，DNA微陣列），在一固體支持物上集成了大量密集、有序排列的基因探針，也稱微陣列.與樣品中同源核酸分子通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行雜交，實(shí)現(xiàn)生物基因信息的高通量檢測(cè)。同步比較分析成千上萬(wàn)基因的信息，對(duì)揭示生命現(xiàn)象的規(guī)律具有重要作用。已成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。36基因芯片的應(yīng)用：1、基因表達(dá)分析2、基因變異篩查：

單核苷酸多態(tài)性（SNP）

突變檢測(cè)等二突變篩查技術(shù)1

變性梯度凝膠電泳

2

單鏈構(gòu)象多態(tài)性３變性高效液相色譜

4等位基因特異性PCR

５蛋白質(zhì)短截檢測(cè)６化學(xué)切割錯(cuò)配1變性梯度凝膠電泳（Denaturringgradientgelelectrophoresis,DGGE）：基本原理：不同DNA序列開(kāi)始變性時(shí)對(duì)變性劑濃度的要求不同，利用變性劑濃度呈梯度增加的凝膠來(lái)分離DNA片段的凝膠系統(tǒng)。

在變性劑梯度由低到高的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，對(duì)變性劑濃度要求較低的DNA片段先部分解鏈，電泳速度減慢；與后解鏈片段的電泳遷移速度產(chǎn)生差異，電泳帶位置不同，可將正常和突變DNA進(jìn)行分離

為使DNA片段在變性梯度凝膠電泳中保持部分解鏈，避免完全解鏈所致的片段長(zhǎng)度決定遷移，常在引物5′端增加40bp的GC重復(fù)序列（即GC夾）。DGGE與PCR結(jié)合---PCR-DGGE特點(diǎn):檢測(cè)片斷范圍為100-500bp。檢出率高,無(wú)需放射標(biāo)記。需特殊的制膠設(shè)備；需合成帶GC夾的引物。應(yīng)用:DNA中單個(gè)堿基替代、微小缺失或插入檢測(cè)。突變篩查技術(shù)2單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SingleStrandConformationalPolymorphism，SSCP）原理：?jiǎn)捂淒NA由于堿基序列不同可引起構(gòu)象差異，該差異使相同或相近長(zhǎng)度的單鏈DNA電泳遷移率不同。與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，稱為PCR-SSCP技術(shù)檢測(cè)片斷長(zhǎng)度：最好小于300bp.

策略:在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺等變性，在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置差異，從而作出判斷。應(yīng)用：DNA中單個(gè)堿基替代，微小缺失或插入檢測(cè)。SSCP３.變性高效液相色譜(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography，DHPLC）：利用高效液相色譜原理，PCR擴(kuò)增后的DNA片斷經(jīng)DNA分離柱分離，經(jīng)流動(dòng)相洗脫的核酸片段通過(guò)紫外或熒光檢測(cè)器檢測(cè)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)中，進(jìn)行分析。

DNA柱分離原理:DNA在：非變性條件下按照片斷長(zhǎng)度分離雙鏈DNA,適合做片斷大小分析;部分變性條件下可檢測(cè)變異(突變或多態(tài));完全變性條件下用于分離、純化單鏈核酸片段DHPLC分析DNA變異的原理：工作溫度(柱溫)是決定DHPLC敏感性的最關(guān)鍵因素。在DNA部分變性條件下，變異型和野生型DNA可形成同源和異源雙鏈．其在色譜柱上保留時(shí)間存在差異，異源雙鏈因存在錯(cuò)配區(qū)而更易變性，在色譜柱保留時(shí)間短于同源雙鏈而先被洗脫下來(lái)，從而在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線，據(jù)此可以分辨出變異型DNA.在經(jīng)歷95℃變性再緩慢復(fù)性后,存在多態(tài)或突變位點(diǎn)的靶序列PCR產(chǎn)物會(huì)雜交形成雜合雙鏈(heteroduplex)和純合雙鏈(homoduplex)混合物

TEAA(三乙銨醋酸鹽)DHPLC的特點(diǎn)：靈敏，準(zhǔn)確；分析速度快，單個(gè)樣本的分析時(shí)間僅需幾分鐘；容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作；適用于較大樣本中基因突變的篩查檢測(cè)變異的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍最好在200～500bpDHPLC的應(yīng)用：

DNA片斷中突變的檢測(cè)和篩查；

多態(tài)的研究和基因型分析如SNP；甲基化分析；基因表達(dá)分析；寡核苷酸的純化與分析；

4等位基因特異性PCR（Amplificationrefractorymutationsystem,ARMS）--檢測(cè)已知突變的一種方法。５蛋白質(zhì)短截檢測(cè)（Proteintruncationtest，PPT）應(yīng)用:檢測(cè)因移碼突變、剪接位點(diǎn)突變或無(wú)義突變所致的蛋白質(zhì)截短。６化學(xué)切割錯(cuò)配（Chemicalcleavagemismatch，CCM）

三、DNA測(cè)序

是指測(cè)定DNA克隆片段的精確核苷酸序列。最常用的方法是Sanger方法，即雙脫氧鏈末端終止法。基本原理：

待測(cè)DNA為模板，應(yīng)用DNA聚合酶，在合成DNA新鏈的過(guò)程中，分別摻入四種2′3′-雙脫氧核苷酸(ddATP,ddGTP,ddCTP,dTTP)，摻入的ddNTP無(wú)法形成磷酸二酯鍵而終止DNA鏈的延伸；將產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA片段，在變性凝膠電泳中呈梯狀帶型，可以直接讀出DNA序列。Dideoxynucleotideblockschainelongationhttp://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/fig5_38.jpghttp://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/fig5_38.jpgDNA自動(dòng)測(cè)序（第一代測(cè)序）第二代測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序的革命性改變。一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，稱為高通量測(cè)序技術(shù)?？蓪?duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析，又稱深度測(cè)序(deepsequencing)。

Sanger測(cè)序法一次讀取1、2條序列

毛細(xì)管測(cè)序法一次讀取96條序列.

二代測(cè)序一次讀取幾百萬(wàn)條序列，是一次革命性變革?，F(xiàn)有的二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)主要包括454(GS-FLX),Solexa,SOLID,polonator

測(cè)序原理：合成法測(cè)序連接法測(cè)序第二代測(cè)序技術(shù)不僅保持高準(zhǔn)確度，而且大大降低測(cè)序成本、極大提高測(cè)序速度。其測(cè)序結(jié)果長(zhǎng)度較短，比較適合于對(duì)已知序列的基因組進(jìn)行重新測(cè)序，在對(duì)全新的基因組進(jìn)行測(cè)序時(shí)還需要結(jié)合第一代測(cè)序技術(shù)。第三代測(cè)序的技術(shù)平臺(tái)之一，

納米孔單分子技術(shù)提高讀取長(zhǎng)度，減少測(cè)序后的拼接工作量，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知基因組進(jìn)行測(cè)序。

將基因組DNA打碎成小片段，制成液滴分散于納米孔，孔底部錨定DNA聚合酶。當(dāng)熒光標(biāo)記的dNTP與測(cè)序模板結(jié)合，熒光被激發(fā)和檢測(cè)，然后DNA聚合酶將熒光標(biāo)記切割、釋放，DNA聚合酶轉(zhuǎn)入下一位置四、轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控是細(xì)胞對(duì)內(nèi)、外刺激發(fā)生應(yīng)答的方式，涉及到基因組DNA和一系列結(jié)合蛋白的相互作用。為深入研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制，須研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用，弄清楚特定基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域與哪種/些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生了特異性結(jié)合。并需檢測(cè)相關(guān)基因啟動(dòng)子的活性。1）DNA與蛋白質(zhì)相互作用的研究，生物信息學(xué)：預(yù)測(cè)DNA上可與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的保守序列。電泳泳動(dòng)遷移檢測(cè)(ElectrophoretjcMobilityShiftAssay，EMSA)染色質(zhì)免疫沉淀（ChromatinImmuno-precipitation，ChIP)DNasel足紋（跡）法酵母單雜交等；2）報(bào)告基因檢測(cè)分析

1電泳泳動(dòng)遷移檢測(cè)(EMSA)EMSA：ElectrophoresisMobilityShiftAssayDNA片段與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其在凝膠中的遷移率明顯降低，據(jù)此可檢測(cè)DNA和蛋白質(zhì)的相互作用（invitro)。RegulatoryRegionCodingSequenceGeneRegulationbyTranscriptionFactorsTheProbeDoublestrandedoligonucleotides

containingatranscriptionfactorbindingsite5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’3’-TCAACTCCCCTCAAAGGGTCCG-5’Bindingmotif

主要步驟：

標(biāo)記探針同核蛋白反應(yīng)電泳放射自顯影EMSA:PrincipleR.Voll09/01Adouble-strandedoligonucleotidecontainigaNF-B-bindingsiteislabeled

witharadioactiveisotopeandincubatedwithanuclearextract.Duringgel-electrophoresis,NF-Bboundtotheoligonucleotidecausesashiftcomparedtothefreeprobe.NF-BFreeProbeRadioaktivelylabeledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)andboundNF-B

RadioactivelylabeledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)EMSA超泳動(dòng)supershift另外還需通過(guò)應(yīng)用核心序列突變的探針、以及未標(biāo)記探針與標(biāo)記探針的競(jìng)爭(zhēng)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)錄因子與探針的特異結(jié)合。2染色質(zhì)免疫沉淀(ChromatinImmunoprecipitation，ChlP)基本原理:在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，細(xì)胞內(nèi)存在的許多DNA與蛋白質(zhì)間的相互作用被保留下來(lái)。細(xì)胞裂解后,用超聲波或酶將染色質(zhì)隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍的小片段，再經(jīng)免疫學(xué)方法沉淀目的蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合體，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過(guò)對(duì)目的DNA片斷的純化與檢測(cè)，獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息(invivo)。應(yīng)用：ChIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。ChromatinImmuno-precipitation(ChIP)若ChIP技術(shù)與二代測(cè)序技術(shù)結(jié)合，稱為ChIP-Sequencing，可以分析某種特異DNA結(jié)合蛋白在全基因組范圍內(nèi)的DNA結(jié)合位點(diǎn)、組蛋白修飾、核小體定位等?？蓱?yīng)用到任何基因組序列已知的物種，可確切得到每一個(gè)片段的信息。是真核生物基因表達(dá)調(diào)控研究的常用方法報(bào)告基因(reportergene)是一種編碼易被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因。將報(bào)告基因編碼序列與待測(cè)基因的表達(dá)調(diào)控序列融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，利用其表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定待測(cè)基因的表達(dá)調(diào)控。3.報(bào)告基因檢測(cè)作為報(bào)告基因，應(yīng)具備以下幾個(gè)條件：(1)已被克隆和全序列已測(cè)定；(