細(xì)菌內(nèi)毒素定量分析

細(xì)菌內(nèi)毒素光度測定法試驗(yàn)講義講解董光宴

1、光度測定法概述

2、試劑和儀器3、標(biāo)準(zhǔn)曲線

4、干擾試驗(yàn)5、檢查法

湛江博康海洋生物有限公司2/1/20231博康一、光度測定法概述1、定量法的概念2、定量法的分類3、定量法的原理2/1/20232博康1定量法的概念

光度測定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法：濁度法系利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動態(tài)濁度法。動態(tài)濁度法是檢測反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時(shí)間，或是檢測濁度增加速度的方法。

2/1/20233博康2定量法分類2/1/20234博康3定量法的原理（1）動力學(xué)曲線：細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)過程中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，混合物會逐漸變混濁，內(nèi)毒素濃度越高濁度變化越快，濁度變化符合反應(yīng)動力學(xué)曲線。2/1/20235博康（2）細(xì)菌內(nèi)毒素含量與時(shí)間的關(guān)系：細(xì)菌內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)時(shí)間分別取對數(shù)后，將兩組數(shù)據(jù)用最小二乘法統(tǒng)計(jì)，可以得到直線：LgT=a+bLgC

我們將這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。2/1/20236博康（3）、數(shù)學(xué)原理原理：OD=-Lg（It/Io）

0.02=-Lg（It/Io）

It=95%Io2/1/20237博康二試劑和儀器光度測定法鱟試劑（生產(chǎn)單位：湛江博康海洋生物有限公司，批號：0907104，檢測限：0.015EU/ml；規(guī)格為1.25ml/支）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（生產(chǎn)單位：湛江博康海洋生物有限公司，批號：0908030，規(guī)格：2ml/支）2/1/20238博康細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（200966，120EU/支，中國藥品生物制品檢定所提供）氯化鉀注射液（規(guī)格：1g/10ml批號：0911211，生產(chǎn)廠家：河北某制藥廠）細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測儀（生產(chǎn)單位：天大天發(fā)科技有限，型號：BET-72）2/1/20239博康三標(biāo)準(zhǔn)曲線1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作4、標(biāo)準(zhǔn)曲線有效的條件5、結(jié)果分析2/1/202310博康1制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能會影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素配成溶液，并制成至少3個(gè)濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測限。2/1/202311博康2標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇

制做標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)毒素濃度可選擇10倍、5倍、4倍和2倍稀釋的等比系列點(diǎn)，也可選擇非等比系列點(diǎn)。一般情況下，我們不推薦10倍和2倍等比系列點(diǎn)，10倍等比系列點(diǎn)（如10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml和0.01EU/ml）跨度大，其相關(guān)系數(shù)R和準(zhǔn)確性都受到一定限制；2/1/202312博康2倍等比系列點(diǎn)（如0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml）跨度太小，其相關(guān)系數(shù)R和準(zhǔn)確性都較好，但很不實(shí)用。我們推薦選用4倍等比系列點(diǎn)（如2EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml）跨度適中，其相關(guān)系數(shù)R和準(zhǔn)確性都較好，而且非常實(shí)用。2/1/202313博康3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作3.1內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的溶解稀釋首先將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1ml溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制備成2EU/ml、1EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml備用。2/1/202314博康200EU/ml20EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.03EU/ml0.125EU/ml0.3ml0.3ml2.7ml2.7ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml0.5ml0.5ml圖示2/1/202315博康3.2定量法鱟試劑的溶解分裝

將復(fù)溶好的光度測定法鱟試劑分裝到14支定量分析專用試管中，每管分裝0.1ml。定量法鱟試劑定量試管每管0.1ml2/1/202316博康3.3加樣

將內(nèi)毒素加入定量分析專用試管中，每個(gè)濃度做3支平行管，剩下兩管加入BET水作為陰性對照，每管加樣量均為0.2ml。2EU/ml0.5EU/ml0.125EU/ml0.03EU/mlBET水2/1/202317博康注：產(chǎn)品名稱：有機(jī)玻璃試管架用

途：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查定量法中用于擺放小試管。特

點(diǎn)：有機(jī)玻璃材料可保護(hù)定量法小試管，避免定量法小試管被磨花而影響試驗(yàn)結(jié)果。2/1/202318博康3.4檢測

加樣完畢后用封口膜密封試管，將每支試管在旋渦混合器上點(diǎn)1-3秒，然后將試管對應(yīng)插入已恒溫的定量檢測儀（37℃），儀器開始自動采集數(shù)據(jù)。注：封口膜的優(yōu)點(diǎn)規(guī)

格：4IN×35FT（4英寸×35英尺）特

點(diǎn)：進(jìn)口代銷，比較適合用于定量法專用試管的封口，清洗時(shí)不留任何殘留物。

2/1/202319博康4標(biāo)準(zhǔn)曲線有效的條件當(dāng)陰性對照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）的絕對值應(yīng)該大于或等于0.980，試驗(yàn)方為有效。平行管的變異系數(shù)＜10%。2/1/202320博康5結(jié)果分析

內(nèi)毒素反應(yīng)時(shí)間變異系數(shù)實(shí)測內(nèi)毒素0>720000>72002.07900.36%2.01182.07940.511591.01%0.50220.511400.12516200.34%0.12170.12516340.0323980.04%0.03180.032381

標(biāo)準(zhǔn)曲線：LogT=2.9783-0.2621LogC，相關(guān)系數(shù)：=-0.9999,標(biāo)準(zhǔn)曲線符合規(guī)定。2/1/202321博康四干擾試驗(yàn)1、限值的確定2、干擾試驗(yàn)濃度的計(jì)算3、檢測濃度的選擇4、干擾試驗(yàn)溶液的制備5、供試品溶液的稀釋6、干擾試驗(yàn)的制備方法7、干擾試驗(yàn)加樣8、判斷的標(biāo)準(zhǔn)9、試驗(yàn)結(jié)果分析10、結(jié)論2/1/202322博康1限值的確定

2010版《中國藥典》二部正文1014頁【氯化鉀注射液】。L=0.12EU/mg2/1/202323博康2干擾試驗(yàn)濃度的計(jì)算

按照中國藥典2010年版提供的公式計(jì)算最大有效稀釋倍數(shù)（注：其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)λ為0.015EU/ml）。最大有效稀釋倍數(shù)：

MVD=CL/λ=100Х0.12/0.015=800倍2/1/202324博康3檢測濃度的選擇

樣品限值表達(dá)方式為EU/ml，直接選用其無干擾濃度并填寫相應(yīng)稀釋倍數(shù)即可；樣品限值表達(dá)方式為EU/mg，無論其干擾情況如何，我們推薦以1mg/ml為初始濃度，選用其以下的無干擾濃度并填寫從1mg/ml開始的相應(yīng)稀釋倍數(shù)，這樣檢測結(jié)果即為樣品每ml或mg中內(nèi)毒素的量。我們將檢測結(jié)果直接與限值比較即可。2/1/202325博康4干擾試驗(yàn)溶液的制備編號內(nèi)毒素濃度被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無1.0mg/ml或0.5mg/ml至少2B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)（或附近點(diǎn)）的0.5EU/ml（設(shè)為λm）1.0mg/ml或0.5mg/ml至少2C2.0EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml、0.03EU/ml四個(gè)濃度檢查用水每一濃度至少2D無檢查用水至少22/1/202326博康5供試品溶液的稀釋

用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將氯化鉀注射液稀釋到2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.5mg/ml備用。操作過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，保證無外源物質(zhì)的干擾。

2/1/202327博康

10.0mg/ml

2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.3ml2.7ml1.0ml1.0ml0.3ml4.0ml1.0ml0.3ml100mg/ml圖示2/1/202328博康6干擾試驗(yàn)的制備方法

取氯化鉀注射液的2.0mg/ml、1.0mg/ml稀釋液分別加入四支試管中，每管加0.3ml，然后分別吸取0.3ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為1.0EU/ml按下圖加入其中兩支試管中，另外吸取0.3ml的檢查用水加入其中另外兩支試管中。將這四支管混合均勻即可得到氯化鉀注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀釋液干擾試驗(yàn)所需樣品溶液。2/1/202329博康氯化鉀注射液內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0EU/ml0.3ml0.3ml0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)BET水0.3ml0.3ml圖示2/1/202330博康7干擾試驗(yàn)加樣

取分裝了0.1ml定量法鱟試劑的定量專用試管10支，每個(gè)濃度做2支平行管，氯化鉀注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀釋液干擾試驗(yàn)各4支；另做2支陰性對照，每管加樣量均為0.2ml。加樣完畢后密封試管，將每支試管在旋渦混合器上點(diǎn)1-3秒，然后對應(yīng)插入定量檢測儀，儀器開始采集數(shù)據(jù)。

2/1/202331博康0.1ml鱟試劑0.1ml鱟試劑0.1ml鱟試劑1mg/ml的加樣0.2ml0.2ml0.5mg/ml的加樣0.2ml陰性對照圖示2/1/202332博康8判斷的標(biāo)準(zhǔn)

按所得線性回歸方程分別計(jì)算供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs，再按下式計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率（R）。R=(CS-Ct)/λm×100%當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%-200%之間，則認(rèn)為在此該試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。2/1/202333博康圖示回收率：

R=(CS-Ct)/λm×100%=×100%2/1/202334博康9試驗(yàn)結(jié)果分析樣品氯化鉀注射液干擾試驗(yàn)結(jié)果2/1/202335博康回收率R：以樣品濃度C=1.0mg/ml（即稀釋倍數(shù)為1)以9、10、11和12管為例，計(jì)算該濃度下的回收率（R）。R=(CS-Ct)/λm×100%=（0.4654-0.0122）/0.5×100%=90%注：如果檢測結(jié)果小于檢測限，計(jì)算回收率時(shí)以0計(jì)。

2/1/202336博康10結(jié)論結(jié)論：依據(jù)<中國藥典>2010版附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，氯化鉀注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干擾試驗(yàn)1.0mg/ml和0.5mg/ml的稀釋液符合試驗(yàn)要求，對鱟試驗(yàn)沒有干擾。常規(guī)檢查選用其中任一濃度即可。

2/1/202337博康五檢查法1檢測濃度的選擇如樣品有干擾作用，選擇符合干擾試驗(yàn)要求的第二個(gè)濃度作為日常檢查的濃度。2/1/202338博康2試驗(yàn)有效條件試驗(yàn)必須符合以下三個(gè)條件方為有效：標(biāo)準(zhǔn)曲線要符合“可靠性試驗(yàn)”中的要求；計(jì)算出的內(nèi)毒素的回收率要在50%-200%的范圍內(nèi)；陰性對照的反應(yīng)時(shí)間應(yīng)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間。

2/1/202339博康

3結(jié)果判斷

若供試品溶液所有平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定。若大于或等于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品不符合規(guī)定。

2/1/202340博康六、光度測的特點(diǎn)1、定量儀器取值方法2、定量法的特點(diǎn)3、動態(tài)濁度法和凝膠法的比較2/1/202341博康1定量儀器取值方法2/1/202342博康1.1透光率反應(yīng)時(shí)間取值法T0.95

在鱟試驗(yàn)中，細(xì)菌內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)達(dá)到某一狀態(tài)的時(shí)刻有關(guān)，只要測出這一時(shí)間就可算出內(nèi)毒素的實(shí)際濃度，這一過程叫反應(yīng)時(shí)間取值方法。透光率反應(yīng)時(shí)間取值法使用透光率描述鱟試劑的濁度變化。日本的ET-201型儀器采用該方法，即t0.95法。但該法所描述的透光率反應(yīng)曲線與反應(yīng)產(chǎn)物的量呈非線性關(guān)系。2/1/202343博康1.2光密度反應(yīng)時(shí)間取值法T0.02

光密度限值法預(yù)設(shè)一個(gè)光密度OD值，當(dāng)反應(yīng)曲線從開始上升到預(yù)設(shè)值時(shí)經(jīng)理的時(shí)間作為反應(yīng)時(shí)間，此方法的優(yōu)點(diǎn)是時(shí)刻變化的OD值與反應(yīng)產(chǎn)物的數(shù)量成正比，也就是吸光度變化曲線與凝膠產(chǎn)物的產(chǎn)生關(guān)系呈線性，取OD值上升0.02作為預(yù)設(shè)點(diǎn)，該點(diǎn)在反應(yīng)曲線上的位置為濁度開始快速變化的時(shí)期，該取值能夠快速、穩(wěn)定的獲得反應(yīng)時(shí)間。2/1/202344博康1.3濁度反應(yīng)時(shí)間取值法T50

濁度-時(shí)間曲線法每一管的濁度總是從0-1，這就是所謂“歸一法”，這種動態(tài)濁度法必須求出濁度達(dá)到0.5的時(shí)間t50，t50與拐點(diǎn)極為接近，用該點(diǎn)代替拐點(diǎn)。T50法很有優(yōu)勢，但要求每次鱟試驗(yàn)必須達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，否則無法獲得終末透光強(qiáng)度，無法測得完整的濁度曲線，