組織培養(yǎng)基本技術(shù)

第三章

細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實(shí)驗(yàn)室，若實(shí)驗(yàn)者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會(huì)導(dǎo)致污染。為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊和完全可靠?；静僮骷夹g(shù)和要求培養(yǎng)室的無菌操作：培養(yǎng)前準(zhǔn)備：培養(yǎng)室和超凈臺(tái)的消毒：洗手和著裝：無菌培養(yǎng)操作：

培養(yǎng)前準(zhǔn)備

在開始實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)消毒。這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)?；静僮骷夹g(shù)和要求培養(yǎng)室和超凈臺(tái)的消毒

無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min.

超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。—些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外線消毒。洗手和著裝

原則上和外科手術(shù)相同。開始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果實(shí)驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進(jìn)行原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。

培養(yǎng)過程中的無菌操作

在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。

進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

第一節(jié)

培養(yǎng)細(xì)胞的取材與分離一、培養(yǎng)細(xì)胞的取材：1、原代取材的基本要求：無菌取材取材器械要鋒利及時(shí)培養(yǎng)剔除與培養(yǎng)細(xì)胞無關(guān)的成分營養(yǎng)要豐富采用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)注意保存原代組織的相關(guān)材料及信息2、取材的基本器材和用品眼科組織彎剪、彎鑷、手術(shù)刀裝有無血清培養(yǎng)基或Hank’s液的小瓶小燒杯、培養(yǎng)皿3、不同組織的取材①皮膚和粘膜的取材取材目的：獲取上皮細(xì)胞（主），成纖維細(xì)胞取材方法：手術(shù)過程切除的部分組織；如有特殊需要可單獨(dú)取材（2～3mm2）注意事項(xiàng)：嚴(yán)格消毒；不用碘酒消毒；要獲取上皮細(xì)胞，取材時(shí)不要切取太厚，如欲培養(yǎng)成纖維細(xì)胞則反之。②內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材取材目的：獲取各臟器細(xì)胞及瘤細(xì)胞取材方法：明確和熟悉所需的組織類型和部位，去除不需要的部分如血管、神經(jīng)和結(jié)締組織；盡可能取腫瘤細(xì)胞分布較多的部分，避開壞死液化部分。注意事項(xiàng)：③血細(xì)胞的取材取材目的：白細(xì)胞----用于染色體分析、淋巴細(xì)胞體外激活進(jìn)行免疫治療等。取材方法：靜脈取血（微量時(shí)，指尖或耳垂）注意事項(xiàng)：加入肝素抗凝（量適宜，過大導(dǎo)致溶血）抽血要嚴(yán)格無菌。④鼠胚組織的取材取材目的：取材方便，易于培養(yǎng)，與人類相近，是較常用的培養(yǎng)材料。取材方法：斷頸處死，75%酒精消毒5min，固定，解剖取材注意事項(xiàng)：保證無菌消毒浸入75%酒精時(shí)間不能太長，以免酒精入口消毒后的操作應(yīng)在超凈臺(tái)或無菌環(huán)境中進(jìn)行⑤雞胚組織取材取材目的：用于分離培養(yǎng)禽類病毒以進(jìn)行疫苗的生產(chǎn)取材方法：選用9～12d的雞胚，無菌條件下剪開氣室端蛋殼，切開蛋膜，用小鑷子挑起雞胚，放到無菌培養(yǎng)皿中取材。注意事項(xiàng)：在無菌條件下操作。二、組織材料的分離目前分散組織的方法有機(jī)械法和化學(xué)法兩種。1、細(xì)胞懸液的分離方法：培養(yǎng)材料為血液、羊水、胸水和腹水等細(xì)胞懸液時(shí)，500～1000r/min低速離心5～10min。2、組織塊的分離方法：機(jī)械分散法：對一些纖維成分很少的組織，如腦組織、部分胚胎組織以及一些腫瘤組織。剪切分離法：組織塊移植培養(yǎng)。消化分離法：獲得細(xì)胞懸液直接培養(yǎng)。①機(jī)械分散法的步驟：先用Hank’s液或無血清培養(yǎng)液漂洗組織，剪成5～10mm3的小塊，置80目孔徑的篩網(wǎng)，用注射器針芯輕壓組織，使之壓碎并通過紗網(wǎng)。吸管吸出組織懸液，置150目篩中，步驟同上。鏡檢計(jì)數(shù)，接種。（組織過大，用400目篩）。②剪切分離法的步驟：沖洗的組織塊放在小燒杯中，用眼科剪反復(fù)剪至糊狀。加入Hank’s液或無血清培養(yǎng)液，反復(fù)輕輕吹打。低速離心去上清液，剩下組織小塊即可培養(yǎng)。③消化分離法消化法是結(jié)合生化和化學(xué)手段把已剪切成較小體積的組織進(jìn)一步分散的方法。消化后組織松散、細(xì)胞分開，細(xì)胞容易生長，成活率高。常用的方法：胰蛋白酶消化法膠原酶消化法A、胰蛋白酶消化法：細(xì)胞間質(zhì)少的軟組織組織剪成1～2mm3的小塊或糊狀，吸到三角燒瓶或培養(yǎng)瓶，加入預(yù)溫到37℃的胰蛋白酶。（也可在4℃冰箱中冷消化12～24h），放入37℃水浴或溫箱中20～60min。消化好后用Hanks液漂洗，去除胰蛋白酶，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)、接種。B、膠原酶消化法：將漂洗修剪干凈的組織剪成1～2mm3的小塊，放到三角燒瓶，加入3～5倍體積的膠原酶，密封燒瓶，放入37℃水浴或溫箱（恒溫振蕩水浴箱）中4～48h，收集消化液，1000r/min離心5min，棄上清液，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)、接種。第二節(jié)

原代培養(yǎng)技術(shù)原代培養(yǎng)概念：是從供體取得組織細(xì)胞后在體內(nèi)進(jìn)行的首次培養(yǎng)。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步，是培養(yǎng)工作人員應(yīng)熟悉和掌握的最基本的技術(shù)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，適合做藥物測試、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。原代培養(yǎng)的方法：組織塊培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法一、組織塊培養(yǎng)法概念：是將組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。（組織量少的原代培養(yǎng)）特點(diǎn)：簡便易行，成功率較高。操作：取材修剪沖洗剪切成1mm3小塊；移入培養(yǎng)瓶；分布組織小塊間距5mm；翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并加培養(yǎng)液37℃靜置2～4h；翻正培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)；觀察原代細(xì)胞生長。二、消化培養(yǎng)法概念：組織通過消化分散法制成細(xì)胞懸液，接種、培養(yǎng)。（適合培養(yǎng)大量組織）優(yōu)點(diǎn)：較短時(shí)間可獲得大量活細(xì)胞。缺點(diǎn)：步驟多，易污染，成本高。操作：按消化分離法獲取細(xì)胞；鏡下觀察見組織已分散，終止消化；200目篩網(wǎng)濾過組織塊；收集的消化液800～1000r/min離心5min；去上清，加含血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液；計(jì)數(shù)，接種于培養(yǎng)瓶。.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程第三節(jié)

細(xì)胞傳代培養(yǎng)技術(shù)一、原代培養(yǎng)的首次傳代傳代：細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程，稱為傳代。注意：首次傳代非常重要。細(xì)胞生長到足以覆蓋瓶底大部分表面后再傳代。傳代時(shí)不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間，注意觀察，及時(shí)處理。首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多；隨消化分離而脫落的組織塊也一并傳入新的培養(yǎng)瓶。二、細(xì)胞傳代方法傳代方法：貼壁細(xì)胞：消化傳代法。半懸浮生長細(xì)胞：吹打傳代。懸浮細(xì)胞：直接吹打或離心沉淀后再分離傳代。二、細(xì)胞傳代方法貼壁細(xì)胞傳代步驟：吸棄或倒掉瓶內(nèi)陳舊培養(yǎng)基；加適量消化液，輕晃培養(yǎng)瓶，是消化液流遍所有細(xì)胞表面；消化2～5min，鏡下觀察見細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，終止消化；加少許含血清培養(yǎng)基，用吸管吹打；計(jì)數(shù)，接種到新的培養(yǎng)瓶。二、細(xì)胞傳代方法懸浮細(xì)胞傳代步驟：直接傳代：細(xì)胞沉淀、吸掉多半上清液、吹打、傳代。離心傳代：（常用此法）細(xì)胞及培養(yǎng)液吸到離心管內(nèi)；800～1000r/min離心5min，棄上清液；加新的培養(yǎng)基，吸管吹打，然后傳代接種。半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。三、細(xì)胞系的維持細(xì)胞系的維持：就是通過換液、傳代、再換液、再傳代和細(xì)胞凍存來實(shí)現(xiàn)。注意：做好細(xì)胞系的檔案記錄工作；遵從細(xì)胞生長的規(guī)律；多種細(xì)胞系維持傳代，要嚴(yán)格操作程序，防止細(xì)胞間交叉污染；及時(shí)凍存。四、培養(yǎng)細(xì)胞的純化細(xì)胞的純化方法：自然純化和人工純化。自然純化：利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢，而排擠其他細(xì)胞生長，靠自然的增殖潛力最后留下生長優(yōu)勢細(xì)胞，去除其他細(xì)胞，達(dá)到細(xì)胞純化。不能人為選擇細(xì)胞。三、培養(yǎng)細(xì)胞的純化細(xì)胞的純化方法：人工純化：利用人為手段造成對某一種細(xì)胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其他細(xì)胞的生長，從而達(dá)到細(xì)胞純化。方法有酶消化法、機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、克隆法、培養(yǎng)基限定法、流式細(xì)胞儀分離法。第四節(jié)

細(xì)胞凍存、復(fù)蘇和運(yùn)輸技術(shù)一、細(xì)胞的凍存凍存的意義：節(jié)省人力和物力、維持原代細(xì)胞的特性。在制備單克隆抗體時(shí)，為保證雜交瘤細(xì)胞不致因傳代污染或因變異而丟失，應(yīng)及時(shí)凍存。購買的細(xì)胞株，經(jīng)過1～2次穩(wěn)定傳代，及時(shí)凍存。凍存的原理：低溫冷凍（-196℃）為最大限度的保存細(xì)胞活力，細(xì)胞凍存及復(fù)蘇基本原則是慢凍快融。當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。如果冷凍速度過快，形成的結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。而緩慢冷凍可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。使用濃度范圍在5～15%之間。細(xì)胞凍存步驟：取生長狀態(tài)好的細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液離心洗滌加含有10%DMSO凍存液混勻，移到凍存管（或安瓿）封口，做好標(biāo)記，4℃40～60min，-20℃20～40min，

-70℃過夜第二天放在液氮管，記錄。二、細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇應(yīng)采用快速融化：快速融化使細(xì)胞順利通過最易受損的-5～0℃，保證細(xì)胞外結(jié)晶在短時(shí)間內(nèi)融化，避免緩慢融化時(shí)水分滲入細(xì)胞內(nèi)再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。復(fù)蘇失敗的原因：凍存細(xì)胞數(shù)量少或生長狀態(tài)差細(xì)胞污染液氮不足復(fù)蘇時(shí)，培養(yǎng)條件改變復(fù)蘇方法不當(dāng)二、細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇步驟：從液氮罐取出細(xì)胞，迅速放到37℃水浴中。融化后，取出凍存管，消毒開蓋液體移到離心管，添加培養(yǎng)液，1000r/min離心5min除去上清液，用培養(yǎng)液稀釋，計(jì)數(shù)、接種。三、細(xì)胞的運(yùn)輸細(xì)胞運(yùn)輸?shù)姆椒ǎ豪鋬鰞?chǔ)存運(yùn)輸：液氮凍存運(yùn)輸：充液法：長距離運(yùn)輸（幾天）：選擇生長好的細(xì)胞，充滿液體，封口，棉花包裹，到達(dá)目的地，吸去多余液體。短距離運(yùn)輸（幾小時(shí)）：細(xì)胞懸液空運(yùn)：第五節(jié)

培養(yǎng)細(xì)胞的觀察和檢測技術(shù)一、培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)觀察1、培養(yǎng)液：直接用肉眼觀察培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化。清亮透明，如出現(xiàn)混濁多為污染（懸浮細(xì)胞培養(yǎng)除外）。顏色變化：桃紅色，變黃表明代謝物增多，需要換液或傳代處理。培養(yǎng)液很快變黃：可能原因有細(xì)菌污染、培養(yǎng)器皿沒洗干凈，有殘留物、細(xì)胞接種密度較大。2、細(xì)胞生長情況：倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞均需要經(jīng)過一段適應(yīng)期或潛伏期（時(shí)間長短不同）才增殖。原代培養(yǎng)最先見從組織邊緣“長出”細(xì)胞傳代的細(xì)胞潛伏期短，開始生長后很快進(jìn)入指數(shù)生長期，長滿瓶底的80%，及時(shí)傳代。3、細(xì)胞形態(tài)變化：鏡下觀察到細(xì)胞透明度大、折光性強(qiáng)、輪廓不清，表明細(xì)胞生長狀態(tài)良好。用相差顯微鏡觀察細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。觀察到細(xì)胞折光性變?nèi)酰喞鰪?qiáng)，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴、顆粒樣物質(zhì)細(xì)胞間隙增大，變得不規(guī)則，表明細(xì)胞生長狀態(tài)不良。如果觀察到細(xì)胞從瓶壁脫落、崩解、漂浮，表明細(xì)胞生長狀態(tài)很差，要查明原因，采取措施。4、微生物污染：微生物污染包括細(xì)菌、霉菌、酵母菌、支原體等。細(xì)菌、霉菌、酵母菌污染最典型的表現(xiàn)為培養(yǎng)液渾濁，液體內(nèi)漂浮菌絲或細(xì)菌。傳代穩(wěn)定、生長規(guī)律的細(xì)胞系，如果培養(yǎng)條件不變而細(xì)胞生長明顯緩慢、胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，但培養(yǎng)基多不發(fā)生渾濁，考慮支原體污染。污染多發(fā)生在傳代、換液和加藥等操作之后。在這些操作之后的24～48h密切注意有無污染。二、細(xì)胞生長狀況的觀察1、細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞計(jì)數(shù)是細(xì)胞培養(yǎng)研究中的一項(xiàng)基本技術(shù)。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法和電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法。步驟：準(zhǔn)備計(jì)數(shù)板：95%酒精消毒，拭干制備細(xì)胞懸液加樣計(jì)數(shù)：10×物鏡、四角大方格中細(xì)胞計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/毫升數(shù)=（四大格細(xì)胞數(shù)之和/4）×1041、細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞密度換算：c1×v1=c2×v2配制10ml106個(gè)細(xì)胞/ml細(xì)胞懸液，現(xiàn)有108個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，如何稀釋？

108×v1=106×10mlv1=0.1ml

吸取0.1ml108個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，補(bǔ)加9.9ml培養(yǎng)基即可。注意事項(xiàng)：取樣計(jì)數(shù)前充分混勻計(jì)數(shù)時(shí)，如見2個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，記為一個(gè)，細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明消化不充分四大格的數(shù)目相差8個(gè)以上，表示細(xì)胞分布不均。2、細(xì)胞生長曲線：測定細(xì)胞生長曲線是觀察細(xì)胞生長基本規(guī)律的重要方法。在細(xì)胞系細(xì)胞和非建系細(xì)胞的生長特性觀察中，其為最基本的指標(biāo)。方法：取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)，調(diào)整密度接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶（30個(gè)）或24孔培養(yǎng)板（2塊）每天取3瓶（孔）細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值，10d培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，匯出曲線。2、細(xì)胞生長曲線：結(jié)果分析：標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞生長曲線近似“S”形。細(xì)胞倍增時(shí)間是在生長曲線上細(xì)胞數(shù)量增加1倍的時(shí)間。細(xì)胞群體倍增時(shí)間：作圖法和公式法

DT=t×lg2/lgnt-lgn0說明：接種細(xì)胞數(shù)不能過少也不能過多反映數(shù)值不夠精確，可有20～30%的誤差通過對生長曲線的繪制，了解細(xì)胞適合生長的培養(yǎng)基3、細(xì)胞分裂指數(shù)：分裂細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例，用來表示細(xì)胞增殖旺盛程度。一般計(jì)算1000個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞分裂相數(shù)方法：消化，計(jì)數(shù)，調(diào)整密度接種到放置有小蓋玻片的培養(yǎng)瓶內(nèi)每24h取出一個(gè)蓋玻片，按常規(guī)方法95%酒精固定，吉姆薩或HE染色、封片鏡下計(jì)數(shù)（細(xì)胞密度多、中、少三個(gè)區(qū)域）連續(xù)計(jì)數(shù)，可繪制細(xì)胞分裂指數(shù)曲線圖三、細(xì)胞培養(yǎng)的污染檢測和排除培養(yǎng)細(xì)胞的污染：包括微生物污染以及所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物污染。污染種類：微生物：真菌、細(xì)菌、病毒和支原體化學(xué)物質(zhì)：細(xì)胞：非同一種細(xì)胞1、微生物污染：①污染途徑：空氣：最主要途徑。工作時(shí)減少空氣流動(dòng)是防止污染的重要環(huán)節(jié)。器材：清洗消毒不徹底操作：無菌觀念不強(qiáng)，動(dòng)作不準(zhǔn)確，操作不規(guī)范等血清：生產(chǎn)時(shí)已污染組織樣本：原代培養(yǎng)的污染②污染對細(xì)胞影響：③污染檢測和排除：A、真菌污染和排除：種類很多：煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、酵母菌、白念珠菌肉眼見培養(yǎng)液形成白色或黃色漂浮物鏡下可見細(xì)胞之間有交錯(cuò)的絲狀、管狀及樹枝狀的菌絲采用制霉菌素25μg/ml或酮康唑10μg/ml白色念珠菌污染B、細(xì)菌污染和排除：常見的污染菌有：大腸桿菌、白色葡萄球菌、假單胞菌等肉眼見培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，明顯渾濁鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球形顆粒漂浮，必要時(shí)，可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查采用聯(lián)合抗生素細(xì)菌污染C、支原體污染和排除：支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間并獨(dú)立生活的微生物。無細(xì)胞壁，形態(tài)高度多形性，可為圓形、絲狀或梨形。支原體污染的檢測：相差顯微鏡：直接觀察和低滲溶脹處理地衣紅染色觀察熒光染色法：Hoechst33258電鏡觀察DNA分子雜交檢查或支原體培養(yǎng)支原體污染C、支原體污染和排除：支原體污染的排除：抗生素處理：四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類：高熱處理：41℃作用5～10h：巨噬細(xì)胞和抗生素聯(lián)合處理：鼠的傳代處理：血清處理：2、細(xì)胞交叉污染及排除：防止交叉污染的措施：①實(shí)驗(yàn)器材如吸管不能混用②培養(yǎng)用液公用時(shí)，細(xì)胞吸管和細(xì)胞用液管要分開，以防將細(xì)胞帶到培養(yǎng)用液中。③實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞要及時(shí)凍存。3、化學(xué)物質(zhì)污染及排除：化學(xué)污染物質(zhì)包括：①殘存洗滌劑；②細(xì)胞殘余；③解體的微生物等。防止化學(xué)物質(zhì)污染的措施：實(shí)驗(yàn)所有器材都要嚴(yán)格清洗和滅菌消毒，并正確掌握器材操作要領(lǐng)。四、干細(xì)胞

干細(xì)胞（stemcell）是具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體，即這些細(xì)胞可通過分裂維持自身細(xì)胞的特性和大小，又可進(jìn)一步分化為各種組織細(xì)胞，從而在組織修復(fù)等方面發(fā)揮積極作用。概念干細(xì)胞研究成為繼人類基因組大規(guī)模測序之后最具活力、最有影響和最有應(yīng)用前景的生命學(xué)科研究領(lǐng)域。

1999年干細(xì)胞研究被美國《科學(xué)》雜志評為1999年度世界十大科學(xué)之冠，2000年干細(xì)胞研究再次被《科學(xué)》雜志評為該年度世界十大科學(xué)成就之一。

組織工程是以干細(xì)胞研究為基礎(chǔ)發(fā)展起來，它有望解決臨床上急需的人工組織與器官問題，進(jìn)展極為迅速，已經(jīng)成為干細(xì)胞應(yīng)用的主要方向。（一）概述干細(xì)胞有幾個(gè)主要特征干細(xì)胞本身不是終末分化細(xì)胞；干細(xì)胞能無限增殖分裂；干細(xì)胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時(shí)間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)；干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞只能有兩種命運(yùn)——保持為干細(xì)胞或分化為特定細(xì)胞。干細(xì)胞的分類全能干細(xì)胞多能干細(xì)胞單能干細(xì)胞按分化潛能按發(fā)育狀態(tài)胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞根據(jù)干細(xì)胞組織發(fā)生的名稱進(jìn)行分類胎胎干細(xì)胞造血干細(xì)胞骨髓間質(zhì)干細(xì)胞肌肉干細(xì)胞成骨干細(xì)胞內(nèi)胚層干細(xì)胞視網(wǎng)膜干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞全能干細(xì)胞：具有形成完整個(gè)體的分化潛能。如胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）。多能干細(xì)胞：具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能。如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞。單能干細(xì)胞：只能向一種或兩種密切相關(guān)的細(xì)胞類型分化。如上皮組織基底層的干細(xì)胞，肌肉中的成肌細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞

ES細(xì)胞是一種高度未分化細(xì)胞。它具有發(fā)育的全能性，能分化出成體動(dòng)物的所有組織和器官，包括生殖細(xì)胞。研究和利用ES細(xì)胞是當(dāng)前生物工程領(lǐng)域的核心問題之一。在未來幾年，ES細(xì)胞移植和其它先進(jìn)生物技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用很可能在移植醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引發(fā)革命性進(jìn)步。成體干細(xì)胞

成年動(dòng)物的許多組織和器官，比如表皮和造血系統(tǒng)，具有修復(fù)和再生的能力。成體干細(xì)胞在其中起著關(guān)鍵的作用。在特定條件下，成體干細(xì)胞或者產(chǎn)生新的干細(xì)胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能細(xì)胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動(dòng)態(tài)平衡。

1981年Evans和Kaufrnan及Martin首次由小鼠中分離得到鼠的胚胎干細(xì)胞。至今已分離得到的胚胎干細(xì)胞物種有：金黃地鼠（1988）、貂（1993）、豬（1994，1997）、雞（1996）、恒河猴（1995）、絨猴（1996）。