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菠菜actin基因片段的克隆植物基因組DNA提取DNA的PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物回收DNA與載體的連接和轉(zhuǎn)化是基因工程中最基本的操作技術(shù)主要包括以下實(shí)驗(yàn)技術(shù):基因工程狹義:人工創(chuàng)造DNA分子新組合的技術(shù)(即重組DNA技術(shù))廣義:重組DNA技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)和應(yīng)用,包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大部分。上游技術(shù)是指重組DNA技術(shù);下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或基因工程細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化,動(dòng)、植物轉(zhuǎn)基因等DNA重組微生物發(fā)酵分離、提純產(chǎn)品生物反應(yīng)器狹義轉(zhuǎn)基因廣義+提取DNA篩選文庫/PCR連接載體細(xì)胞DNA載體重組載體宿主擴(kuò)增(基因)酶切基因基因轉(zhuǎn)化+上游技術(shù)下游為基因測(cè)序和其它研究和應(yīng)用準(zhǔn)備高質(zhì)量的基因片段。YourTextYourTextYourTextPCR及檢測(cè)連接轉(zhuǎn)化篩選實(shí)驗(yàn)流程及原理YourText回收鑒定YourText測(cè)序DNA提取及檢測(cè)產(chǎn)物回收等引物…………….....……………………..……5’-3’--3’-5’

引物設(shè)計(jì)正向引物(Forward)→←反向引物(Reverse)正向引物:TCATTCTCTGATCCGTGCAG1.對(duì)引物的一般要求

(1)長(zhǎng)度一般為18-27nt(2)GC含量為40-60%(3)引物在模板內(nèi)沒有其它高度相似的序列

(4)引物間和引物內(nèi)不形成二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)

(5)引物之間的Tm值應(yīng)基本相同(

Tm估計(jì)值與計(jì)算方法有關(guān))

(6)3’端避免出現(xiàn)3個(gè)及以上連續(xù)的相同堿基反向引物:AGGCAAGCTTTTCCTTCACA3.引物設(shè)計(jì)工具(1)引物設(shè)計(jì)軟件

Oligo6.44

PrimerPremier

5.0

Dnastar(2)網(wǎng)上引物設(shè)計(jì)工具

Primer3

/primer3/input.htm2.

DNA序列的來源

(1)查詢序列數(shù)據(jù)庫(2)查閱科技文獻(xiàn)(3)測(cè)序TheNationalCenterforBiotechnologyInformation(http://www.ncbi.)例1:查詢Spinaciaoleraceaactingene序列2023/2/1/primer3/input.htm例2:利用Primer3設(shè)計(jì)引物①復(fù)制和粘貼DNA序列①②②③②勾選所需的引物③獲取引物

連接Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個(gè)非模板依賴的A;

T載體是一種帶有3’T突出端的載體;在連接酶作用下,可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)(MCS)中。

高效克隆PCR產(chǎn)物(TACloning)的專用載體

轉(zhuǎn)化細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法如電擊法,化學(xué)試劑法(CaCl2)等的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。3、鑒定--

α-互補(bǔ)質(zhì)粒載體帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS),它并不破壞讀框,但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能。宿主細(xì)胞存在可編碼β-半乳糖苷酶C端部分的序列。它們同時(shí)存在時(shí),能恢復(fù)lacZ酶的活性,稱為α-互補(bǔ)。在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落,因而易于識(shí)別。當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后,幾乎不可避免地導(dǎo)致無α-互補(bǔ)能力的氨基端片段,使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。Yo

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