果蠅唾液腺染色體觀察

二實(shí)驗(yàn)原理本世紀(jì)初，D.Kostoff用壓片法首先在果蠅（Drosophilamelanogaster）幼蟲的唾液腺細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)了特別巨大的染色體——唾液腺染色體（salivaryglandchromosomes）。由于它具有許多重要特點(diǎn)而成為細(xì)胞遺傳學(xué)、發(fā)生遺傳學(xué)、進(jìn)化遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)研究中不可多得的好材料。果蠅是雙翅目昆蟲，幼蟲期具有很大的唾腺細(xì)胞，其中的染色體是巨大的唾液腺染色體。唾液腺染色體不斷地進(jìn)行自我復(fù)制而不分開，經(jīng)過(guò)許多次的復(fù)制形成約1000～4000拷貝的染色體絲，合起來(lái)達(dá)5mm寬，400mm長(zhǎng)，比普通中期相染色體大得多（約100～150倍），所以又稱為多線染色體。唾液腺染色體具有許多重要特征，為遺傳學(xué)研究的許多方面，如染色體結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、基因差別表達(dá)等提供了獨(dú)特的研究材料。

果蠅種間或種內(nèi)不同品系與近緣種之間的遺傳差異常表現(xiàn)為唾液腺染色體不聯(lián)會(huì)，形成泡（puff）、縊痕（constrictions）、間帶區(qū)（interband）的伸縮性以及頂體（telomere）的形態(tài)等多方面的變異，特別重要的是可觀察是否產(chǎn)生了倒位、染色體的斷裂、融合或重排，據(jù)此研究其基因序列的差異。因此，無(wú)論從細(xì)胞遺傳學(xué)的角度研究基因與突變性狀之間的關(guān)系，還是從進(jìn)化遺傳學(xué)方面研究染色體的系統(tǒng)發(fā)育，探討近緣種間的遺傳差異和生殖隔離機(jī)制等，唾液腺染色體的分析研究都是十分重要的。果蠅唾液腺染色體已廣泛用于種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育和種間親緣關(guān)系的研究中。

普通果蠅（2n=2x=8）唾腺染色體的特點(diǎn)表現(xiàn)在：各染色體著絲點(diǎn)附近異染色質(zhì)區(qū)相互結(jié)合形成染色很深的染色中心，第Ⅱ、Ⅲ對(duì)染色體呈Ｖ形（中著絲粒），各有兩臂，Ｘ染色體呈棒狀，第Ⅳ對(duì)染色體呈粒狀，觀察時(shí)可見五條臂由染色中心向外蜿蜒伸展。三實(shí)驗(yàn)材料果蠅三齡幼蟲活體。四實(shí)驗(yàn)器具、藥品試劑顯微鏡，生化培養(yǎng)箱；果蠅培養(yǎng)瓶，鑷子，解剖針，載玻片，蓋玻片，吸水紙等。

0.7％氯化鈉（NaCl），1mol/LHCl；改良苯酚品紅染色液；果蠅培養(yǎng)基等。五實(shí)驗(yàn)方法1．培養(yǎng)果蠅三齡幼蟲將果蠅放在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中，15℃～18℃下飼養(yǎng)，幼蟲要生長(zhǎng)肥大，才能獲得較大的唾腺。培養(yǎng)要求：①飼料松軟，含水量較高，營(yíng)養(yǎng)豐富，發(fā)酵良好（建議配方：玉米粉10g，紅糖13g，瓊脂1g，酵母粉2g，丙酸3～4滴，加蒸餾水100～120ml）。②追加酵母液。在一齡幼蟲出現(xiàn)后，將成蟲移入另一培養(yǎng)瓶中，在飼料表面滴加低濃度的酵母液（2％～4.5％），每天滴加1～2滴；2齡～3齡幼蟲時(shí)期適當(dāng)增加酵母液的濃度（約10％左右）；滴加的量以覆蓋在飼料表面薄薄的一層為宜。③控制幼蟲的密度。一般情況下，半磅牛奶瓶中10對(duì)成蟲交配后在12h左右必須將成蟲轉(zhuǎn)移，一般要求每cm2培養(yǎng)基表面20～40只幼蟲左右。④低溫培養(yǎng)：稍低的溫度有利于幼蟲的充分生長(zhǎng)發(fā)育，一般15℃～18℃較為合適。2．取唾腺

挑選生長(zhǎng)肥大的三齡幼蟲放入表面皿中用0.7％的生理鹽水盡量洗去幼蟲體表所沾附的培養(yǎng)基，然后將幼蟲置載玻片上，滴１～2滴0.7％生理鹽水，找到具有口器的頭部（有一小黑點(diǎn)），一手用解剖針刺入（或壓?。╊^部，將蟲固定，一手用攝子夾緊幼蟲下半部（尾端1/3處），輕輕向兩端拉開，唾腺隨頭部拉出。唾腺是一對(duì)透明的棒狀腺體，外有白色的脂肪組織（不透明）。去除幼蟲其它組織部分，并把唾腺周圍的白色脂肪剝離干凈。唾液腺解剖針解剖針

在低倍顯微鏡下，調(diào)節(jié)好光亮度觀察，可見一對(duì)半透明、隱約可見細(xì)胞界限的囊狀物——唾腺。移去蟲體其余部份，用解剖針剔除附在唾腺一側(cè)深色泡沫狀的脂肪體，以保證制片質(zhì)量。若載片上雜質(zhì)較多，可用生理鹽水適當(dāng)沖洗，用吸水紙吸去多余的生理鹽水。注意：在整個(gè)剝離過(guò)程中，不能讓載片上的生理鹽水干涸，否則唾腺收縮而不易剝離；沖洗殘?jiān)臀ザ嘤嗨簳r(shí)，要避免唾腺被吸水紙吸走。3．解離

將剝好的唾腺移到載片中央，加一滴1mol/LHCl于腺體上，解離２～３min，使組織疏松，以便壓片時(shí)細(xì)胞分散，染色體展開。4．染色

用吸水紙吸去HCl，加1滴蒸餾水輕輕沖洗后，小心吸干。加1～2滴改良苯酚品紅或其它染液，染色10～15min。5．壓片

染色完成后，蓋上干凈的蓋片，并覆一層濾紙。將片子放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用大拇指均勻用力壓片。（注意不要使蓋片移動(dòng)。）

注意：壓片時(shí)適當(dāng)多加些染液有利于染色體臂的伸展，但要防止染液過(guò)多而造成材料隨染液而溢出。6．鏡檢在低倍鏡選擇唾腺細(xì)胞多且染色體分散好的視野，換高倍鏡仔細(xì)觀察唾腺染色體的染色中心、染色體臂和橫紋以及可能有的疏松區(qū)、裴氏環(huán)、或因易位而形成的十字形圖象和因倒位而形成的倒位環(huán)等各種結(jié)構(gòu)。六注意事項(xiàng)1.一定加生理鹽水，否則唾腺易干。2.將脂肪組織清除干凈。3.水不可太多，否則幼蟲會(huì)漂浮而且活躍。4.染色時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，否則背景也著色。5.壓片時(shí)要揉，用