第八章環(huán)境毒理學(xué)常用研究方法

第八章環(huán)境毒理學(xué)常用研究方法毒理學(xué)研究方法體內(nèi)實驗invivotests體外實驗invitrotests(1)流行病調(diào)查/臨床觀察(2)動物實驗第一節(jié)實驗準(zhǔn)備1.1動物的準(zhǔn)備①選擇實驗動物②編號與標(biāo)記③固定與麻醉（1）選擇實驗動物黏膜刺激高血壓1）種屬的選擇原則在機(jī)體反應(yīng)上與人體近似易獲得、易飼養(yǎng)、易管理敏感、合適－實驗資料大鼠－致癌豚鼠－過敏反應(yīng)常用動物介紹①貓氣體、蒸氣對黏膜的刺激②豚鼠或兔皮膚③豚鼠過敏性反應(yīng)④貓、狗、兔嘔吐⑤兔和貓體溫⑦狗、兔、大鼠血壓⑧大鼠和小鼠致癌⑨小鼠慢性中毒對臟器的損害2）個體選擇①年齡：幼年>成年，急性實驗－成年②性別：無特殊要求就雌雄各半③生理狀態(tài)：如懷孕、哺乳④健康狀態(tài)：檢查、預(yù)檢（2）實驗動物的標(biāo)記編號染色、烙印、號牌大動物：記錄外表和毛色（3）實驗動物的捕捉及固定做好防護(hù)戴厚手套用器具固定（4）實驗動物的隨機(jī)分組分2組：任意從隨機(jī)數(shù)字表的某一行某一數(shù)字開始抄錄14個數(shù)

再抄錄一個數(shù)字為78，因為歸入A組的小鼠有8只，故以8除，得余數(shù)6。于是把第6個A（即編寫為第12號的小鼠）劃給B組

分3組：再取一個隨機(jī)數(shù)除以6，看余數(shù)（5）實驗動物的麻醉動外科手術(shù)避免劇烈掙扎麻醉藥物：乙醚（1）全身麻醉a）吸入法：開放法、封閉法－揮發(fā)性b）腹腔和靜脈給藥麻醉法－非揮發(fā)性（2）局部麻醉a）貓：一般應(yīng)用0.5-1.0%鹽酸普魯卡因注射。粘膜表面麻醉宜用2%鹽酸可卡因b）兔在眼球手術(shù)時，可于結(jié)膜囊滴入0.02%鹽酸可卡因溶液，數(shù)秒鐘即可出現(xiàn)麻醉c）狗：用0.5-1%鹽酸普魯卡因注射。眼鼻、咽喉表面麻醉可用2%鹽酸可卡因麻醉注意事項（1）靜脈注射必須緩慢，同時觀察肌肉緊張性、角膜反射和對皮膚夾捏的反應(yīng)。當(dāng)這些活動明顯減弱或消失時，立即停止注射。配制的藥液濃度要適中。（2）麻醉時需注意保溫。麻醉期間，動物的體溫調(diào)節(jié)機(jī)能往往受到抑制，出現(xiàn)體溫下降。保溫的方法有：實驗桌內(nèi)裝燈，電褥，臺燈照射等。無論用哪種方法加溫都應(yīng)根據(jù)動物的肛門體溫而定。（3）慢性實驗時，在寒冷冬季，麻醉劑在注射前應(yīng)加熱至動物體溫水平。1.2毒物的準(zhǔn)備（1）了解毒物的物理常數(shù)

密度、溶解度、蒸汽壓、熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、油/水分配系數(shù)等（2）劑型：

毒性高、刺激性大－稀釋固態(tài)－溶液、軟膏（3）溶劑：①本身毒性很小或無毒②不與受檢毒物產(chǎn)生增毒或減毒作用③不影響毒物吸收④無特殊的刺激性或氣味1.3生物材料的采集和制備（1）血液的采集需求少刺破組織取毛細(xì)血管的血需求多靜脈采血、動脈注意：光線、溫度、器皿消毒、抗凝劑割（剪）尾取血眼眶靜脈叢采血斷頭取血頸動脈取血腹主動脈股動（靜）脈取血（2）尿液的收集連續(xù)收集在代謝籠下配置糞尿分離漏斗一次性尿液收集逼尿法、導(dǎo)尿法、輸尿管插管法剖腹采集尿液、提鼠采集尿液

尿液收集注意事項實驗期間膳食一致，特定時間完成收集防止尿液的污染標(biāo)本迅速測定或冷凍保存避免器皿污染灌喂水或青菜滿足尿量需求（3）糞便的收集代謝籠、糞尿分離器外觀形態(tài)新鮮、完整，分析時取內(nèi)層糞便器皿干凈（4）呼出氣的收集研究毒物的吸收代謝和對肺功能的影響動物需固定（5）組織勻漿的制備酶：取樣－洗凈－研磨－離心－測定用于毒物的測定1.4預(yù)備試驗（1）選擇合適的實驗動物（2）設(shè)計染毒劑量及其分組（3）操作技術(shù)的檢驗和訓(xùn)練（4）發(fā)現(xiàn)新線索、新指標(biāo)第二節(jié)常用染毒技術(shù)2.常用染毒途徑吸入染毒、經(jīng)皮膚染毒－最重要的灌胃氣管注入注射（腹腔、靜脈、肌內(nèi)、皮下）根據(jù)實驗?zāi)康倪M(jìn)行選擇，同時考慮：（1）人群接觸環(huán)境毒物的實際情況生產(chǎn)車間－呼吸道（2）毒物的理化性質(zhì)固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)（3）受檢毒物的來源消耗量的大小2.1吸入染毒法－大氣污染物1）動式吸入染毒法優(yōu)點(diǎn)：①柜內(nèi)毒物濃度相對穩(wěn)定②受試環(huán)境具有持久的穩(wěn)定性缺點(diǎn)：①毒物消耗量大2）靜式吸入染毒法－急性在具有一定氣體容積的密閉容器中或在密封染毒柜內(nèi)進(jìn)行優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單，操作方便缺點(diǎn)：要經(jīng)過一段時間才能達(dá)到實驗濃度要求3）面罩染毒法優(yōu)點(diǎn)：避免皮膚吸收注意檢查面罩的密封性4）吸入染塵法顆粒污染物<5μm2.2氣管注入法經(jīng)喉插入法氣管穿刺法暴露氣管穿刺法①適用于顆粒物染毒。②顆粒物可制備成生理鹽水混懸液，也可將顆粒物中的有害成分提取，再用提取物進(jìn)行染毒。③此法需在動物麻醉下進(jìn)行，難度較大，適宜急性試驗

2.3經(jīng)口染毒法不揮發(fā)性液體和固體毒物灌胃法－液體或制劑喂飼法－混在食物中經(jīng)口滴入－淀粉糊劑吞咽－膠囊2.4注射染毒法毒物對局部損害不能太大①腹腔注射②肌內(nèi)注射

不溶于水但溶于油或其他溶劑③靜脈注射④皮下注射⑤皮內(nèi)注射2.5經(jīng)皮染毒法家兔和豚鼠斑貼法兔耳法結(jié)膜囊染毒第三節(jié)毒理學(xué)實驗的設(shè)計方法3.1實驗設(shè)計明確實驗?zāi)康?、了解毒物、預(yù)備實驗實驗類型（急性、慢性）、實驗動物染毒方式、濃度分組、對照組（平行、自身）3.2動物分組隨機(jī)化第四節(jié)急性毒性實驗4.1急性毒性實驗的內(nèi)容①急性毒性測定－LD50/LC50②皮膚染毒實驗－經(jīng)皮膚進(jìn)入③局部作用實驗－有無刺激腐蝕④中毒癥狀的觀察－作用程度、部位⑤功能及病理組織學(xué)檢查－部位、程度4.2哺乳動物的急性毒性實驗一、半致死劑量的測定（途徑？）（1）動物準(zhǔn)備(小動物、預(yù)觀察)（2）劑量選擇（3）藥液配置及染毒－等容量法（4）癥狀觀察（5）病理學(xué)檢查及其他指標(biāo)觀察（6）結(jié)果評價－LD50、毒性級別劑量的選擇①預(yù)實驗測定：最大無作用劑量、100％死亡劑量②按等比級數(shù)（<2.2,一般1.2~1.5）間距設(shè)計濃度系列，系列濃度中有一個的死亡率為40～60％為最佳二、急性閾劑量的測定關(guān)鍵：選定適當(dāng)?shù)挠^測指標(biāo)機(jī)理—肝腎、有機(jī)磷農(nóng)藥—膽堿酯酶新化學(xué)物質(zhì)—整體狀態(tài)、非特異性指標(biāo)實驗方法游泳試驗、刺激閾試驗三、局部作用試驗皮膚和黏膜癥狀（豚鼠、家兔）急性皮膚刺激/腐蝕試驗急性眼刺激/腐蝕試驗

結(jié)膜囊染毒四、急性聯(lián)合毒性的測定過篩試驗確定大概的作用類型1/2LD50

①死亡率>80%，增毒；30％～80％，相加；<30％，拮抗②實測死亡率（O）/預(yù)期死亡率（P）混合毒物L(fēng)D50的測定方法①分別測定各毒物的LD50②按等毒性比例混合測定混合毒物的LD50③評定作用類型K<0.4拮抗；0.4<K<2.5相加；K>2.5協(xié)同4.3水生動物毒性實驗一、魚類毒性實驗動物選擇—區(qū)域代表性實驗條件—水溫、溶氧、pH二、甲殼動物實驗水蚤幼蟲的準(zhǔn)備TLm的測定斑馬魚青鳉魚第五節(jié)毒物蓄積的研究方法蓄積毒性作用：物質(zhì)蓄積：環(huán)境污染物進(jìn)入>排出功能蓄積：結(jié)構(gòu)和功能變化的積累慢性、亞慢性實驗必須先評價蓄積性5.1物質(zhì)蓄積的研究方法生物蓄積的極限值與其在單位時間內(nèi)的吸收量成正比生物半衰期越短，達(dá)到極限所需時間就短A=a×T1/2×1.445.2功能蓄積的研究方法K=

ED50(n)

ED50(1)

①固定劑量連續(xù)染毒法；>5LD50，蓄積作用不明顯②劑量定期遞增染毒法（等比遞增）③20天蓄積實驗法－停藥7天內(nèi)死亡情況LD50K>5,輕度蓄積5.3蓄積率的測定方法蓄積率＝×100％預(yù)給劑量對照組LD50-預(yù)給組LD50蓄積量＝對照組LD50－預(yù)給組LD50第六節(jié)亞慢性和慢性毒性實驗必須先做蓄積實驗判斷可能性6.1亞慢性毒性實驗(1/30～1/20)①動物要求敏感、兩種（嚙齒類、非嚙齒類）

健康、年幼②劑量（高、中、低）一般取LD50的1/80～1/50，每天定時染毒，劑量相等③觀察指標(biāo)一般指標(biāo)、生化指標(biāo)、病理學(xué)檢查6.2慢性毒性實驗實驗時間一般要求1～2年或者終生染毒一般要求選用幾種動物，年齡要小設(shè)3～4個劑量組和一個對照組LD50的1/1000～1/20之間取3～4個劑量注意事項：指標(biāo)提前觀察、同步進(jìn)行、注意異常情況、延長飼養(yǎng)時間繼續(xù)觀察第七節(jié)致癌性實驗7.1長期動物實驗①實驗動物的選擇：抗病力強(qiáng)、容易飼養(yǎng)、腫瘤自發(fā)率低、壽命長、對受試物敏感。兩種或以上動物②動物數(shù)目：小型動物50只；大型減少③劑量分組與對照（陰性、陽性對照）：

高劑量（加速致癌）、低劑量（接近人類）④染毒途徑：口、皮膚、注射⑤實驗時間：動物生命期的1/3～1/2⑥指標(biāo)觀測：外表、行為、X射線、病理學(xué)檢查⑦結(jié)果評判：

潛伏期：第一例病理學(xué)檢查：惡性、良性、癌前期變陽性結(jié)果的判斷：腫瘤數(shù)、潛伏期短7.2短期篩檢方法Ames實驗：外源化學(xué)物致突變作用DNA修復(fù)測定：3H-Tdr哺乳動物細(xì)胞的體外惡性轉(zhuǎn)化Ames試驗組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株（His-）His-His+哺乳動物微粒體酶－前致癌物受試物組氨酸缺乏培養(yǎng)基S-9混合液致突變物DNA修復(fù)測定蔗糖密度梯度離心技術(shù)切除片段大小沉降速度放射自顯影技術(shù)直接定位損傷部位第八節(jié)致突變實驗一、哺乳動物細(xì)胞突變試驗正常細(xì)胞酶的缺失突變細(xì)胞能與有害物共存突變細(xì)胞不能與有害物共存回復(fù)突變正向突變正常細(xì)胞二、染色體畸變試驗哺乳動物體內(nèi)骨髓細(xì)胞遺傳學(xué)試驗人外周血淋巴細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(T、Bcell)觀察染色體的完整性未分裂，G0期加秋水仙素抑制有絲分裂，使染色體停滯在分裂中期三、微核試驗用于