核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)核酸分子雜交概念

核酸分子雜交是應(yīng)用DNA變性和復(fù)性的原理建立的一種經(jīng)典的分子生物學(xué)技術(shù)。

兩條不同來源的單鏈核酸，只要它們有相同的互補(bǔ)堿基順序，經(jīng)退火處理即可復(fù)性，形成新的異源核酸分子的雙鏈結(jié)構(gòu)。此即為核酸分子雜交此雜交過程是高度特異的，雜交的雙方是待測(cè)核酸及探針。

分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行。核酸探針（nucleicacidmolecularprobe）：指一已知的帶有標(biāo)記的核酸片段，能與互補(bǔ)核酸序列進(jìn)行退火雜交，可用于待測(cè)核酸樣品中特定基因序列的探測(cè)。核酸探針一、常見核酸探針的種類（一）基因組DNA探針

1.來源：這類探針來源于某種生物的基因組多為某一基因的全部或部分序列。

2.制備方法:

（1）基因克隆的方法（2）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

3.特點(diǎn):

（1）克隆在載體中的DNA片段，

可以無限繁殖，取之不盡。（2）PCR制備探針更加簡便和省時(shí)。（3）相對(duì)RNA而言，DNA探針不易降解，標(biāo)記方法也較成熟。（二）cDNA探針1.制備:cDNA(complementaryDNA)是指與mRNA互補(bǔ)的DNA分子。2.特點(diǎn):（1）不存在內(nèi)含子和高度重復(fù)序列，是一種較理想的核酸探針，尤其是用于基因表達(dá)的研究。（2）cDNA探針的制備受RNA酶的影響，但隨著反轉(zhuǎn)錄試劑盒的商品化，cDNA探針的制備現(xiàn)已成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。

（三）RNA探針

特性：大多以單鏈形式存在，幾乎不存在互補(bǔ)雙鏈的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，RNA探針與靶序列的雜交效率較高，穩(wěn)定性也高；

RNA分子中不存在高度重復(fù)序列，減少非特異性雜交，雜交后可用RNA酶將未雜交的探針分子水解去除，降低本底的干擾；但RNA探針有易降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點(diǎn)，限制了其廣泛應(yīng)用。（四）寡核苷酸探針

1.制備：人工合成

2.特點(diǎn):◆根據(jù)需要來合成相應(yīng)的核酸序列，避免天然探針的缺點(diǎn)◆大多數(shù)寡核苷酸探針長度一般為10~50bp◆寡核苷酸探針尤其適合點(diǎn)突變的檢測(cè)◆探針的長度較短，特異性較低，雜交信號(hào)較弱，但經(jīng)過精心設(shè)計(jì)仍可設(shè)計(jì)出非常特異的寡核苷酸探針

3.設(shè)計(jì)原則:

◆探針長度：一般要求在10～50bp

◆G／C含量為40％～60％◆探針分子中應(yīng)避免互補(bǔ)序列◆避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)，一般不能多于4個(gè)，如GGGG-或-CCCC-◆借助計(jì)算機(jī)相應(yīng)軟件與已知的各種基因序列進(jìn)行同源性比較，與非靶基因序列的同源性不能超過70％或8個(gè)以上連續(xù)的堿基二、核酸探針的標(biāo)記

一個(gè)理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具有以下特性：

◆靈敏度高

◆標(biāo)記物與探針結(jié)合后，應(yīng)不影響雜交反

應(yīng)，尤其是雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值

◆檢測(cè)方法要靈敏、特異、穩(wěn)定、簡便

◆標(biāo)記物對(duì)環(huán)境污染小，對(duì)人體無損傷，價(jià)格低廉

◆標(biāo)記物對(duì)檢測(cè)方法無干擾。（一）探針常見標(biāo)記物：

1、放射性同位素標(biāo)記物優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，＜1000個(gè)分子；特異性強(qiáng)缺點(diǎn)：放射性污染，有半衰期常用于標(biāo)記探針的同位素：32P、3H、35S、131I、125I

2、非放射性標(biāo)記物（1）生物素標(biāo)記核酸探針生物素-UTP的結(jié)構(gòu)示意圖

（2）光敏生物素標(biāo)記核酸探針光敏生物素結(jié)構(gòu)圖

（3）地高辛標(biāo)記核酸探針

（4）酶標(biāo)記核酸探針：ALP、HRP

（5）熒光素標(biāo)記核酸探針：異硫氰酸熒光素

（二）核酸探針的標(biāo)記方法1、酶促反應(yīng)標(biāo)記法：

將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在單核苷酸（NTP或dNTP）分子上，采用酶促反應(yīng)將標(biāo)記物摻入到核酸探針分子中。特點(diǎn)：靈敏度高，但標(biāo)記過程復(fù)雜、成本高2、化學(xué)修飾標(biāo)記法：利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與分子探針上的某些基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，將標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上。特點(diǎn)：方法簡單、成本低。（1）缺口平移法（nicktranslation）缺口平移標(biāo)記法示意圖

核酸探針的酶促標(biāo)記方法（2）隨機(jī)引物法(randompriming)

隨機(jī)引物標(biāo)記法示意圖

（3）DNA探針的末端標(biāo)記

1）Klenow大片段的末端標(biāo)記法

利用KlenowDNA聚合酶標(biāo)記3’-端DNA探針

2）T4噬菌體多核苷酸激酶標(biāo)記法

（polynucleofidekinase，PNK)T4噬菌體多核苷酸激酶標(biāo)記法示意圖（4）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）標(biāo)記DNA探針

（5）同位素標(biāo)記RNA探針

1）SP6RNA聚合酶體系

2）成對(duì)啟動(dòng)子系列

RNA探針標(biāo)記

三、標(biāo)記探針的純化

（一）凝膠過濾層析法

（二）乙醇沉淀法四、探針的檢測(cè)（一）放射性同位素標(biāo)記探針的檢測(cè)

1.放射自顯影

2.γ計(jì)數(shù)器

（二）非放射性標(biāo)記探針的檢測(cè)

1．偶聯(lián)反應(yīng)

非放射性探針檢測(cè)示意圖

2．顯色反應(yīng)

(1)酶促顯色法

①堿性磷酸酶(ALP)顯色體系

②辣根過氧化物酶(HRP)顯色體系

(2)熒光法

(3)化學(xué)發(fā)光法標(biāo)記物性質(zhì)標(biāo)記分子標(biāo)記方法檢測(cè)方法放射性分子[α32P]dNTPNT、PCR、RP放射自顯影或計(jì)數(shù)[γ32P]dNTPTL放射自顯影或計(jì)數(shù)35SNT放射自顯影或計(jì)數(shù)

3HNT放射自顯影或計(jì)數(shù)非放射性分子生物素Bio-11-dUTPNT、PCR、RP酶標(biāo)親和素或酶標(biāo)光敏生物素600W可見光照抗生物素抗體顯色生物素化補(bǔ)骨脂素365紫外線照抗生物素抗體顯色酶過氧化物酶化學(xué)合成法或直接法直接底物顯色或用酶抗體+底物顯色堿性磷酸酶化學(xué)合成法或直接法直接底物顯色或用酶抗體+底物顯色熒光素羅丹明和FITC合成法熒光顯微鏡觀察或酶標(biāo)抗體+底物顯色半抗原地高辛RP、NT酶標(biāo)抗體+底物顯色常用核酸探針的標(biāo)記和檢測(cè)注：NT：缺口平移；PCR：聚合酶鏈反應(yīng)；RP：隨機(jī)引物；TL：末端標(biāo)記

核酸分子雜交技術(shù)

按反應(yīng)支持物可分為固相雜交和液相雜交兩種固相雜交應(yīng)用較廣，包括Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、菌落雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交等。雜交類型檢測(cè)目的及范圍Southern印跡雜交檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的DNA分子Northern印跡雜交檢測(cè)經(jīng)凝膠電泳分離且轉(zhuǎn)移至膜上的RNA分子菌落雜交檢測(cè)固定在膜上，經(jīng)裂解從細(xì)菌體釋放的DNA分子斑點(diǎn)雜交檢測(cè)固定在膜上的DNA或RNA分子原位雜交檢測(cè)細(xì)胞或組織中的DNA或RNA分子各種固相雜交方法的適用范圍一、Southern印跡雜交[原理]

Sourthern印跡雜交是分析DNA的一種方法，從細(xì)胞或組織中提取高分子量的DNA，用一種或多種限制性內(nèi)切酶消化，通過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離所得片段，從凝膠中按原來位置和順序吸印轉(zhuǎn)移到固相支持膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，然后再與同位素或非同位素標(biāo)記探針雜交，最后經(jīng)放射自顯影或顯色反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。Southern雜交示意圖

（一）DNA的變性：將瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA限制性酶切片段進(jìn)行變性（二）中和（三）Southern印跡1．毛細(xì)管轉(zhuǎn)移2．電轉(zhuǎn)移法3．真空轉(zhuǎn)移法（四）預(yù)雜交（五）雜交（六）洗膜（七）雜交信號(hào)的檢測(cè)[步驟]

毛細(xì)管轉(zhuǎn)移示意圖電轉(zhuǎn)移示意圖

二、Northern印跡雜交（一）基本步驟

Northern印跡雜交流程圖

（二）與Southern印跡雜交比較

◆RNA提取過程中需特別注意RNA酶的污染。

◆所用的器材最好與Southern印跡實(shí)驗(yàn)的分開

使用。

◆RNA變性的方法與DNA不同，它是在變性

劑(甲醛或聚乙二醛、甲基氫氧化汞)的存在

下進(jìn)行電泳,其作用是防止RNA分子形成發(fā)夾

式的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以保持其單鏈線形狀態(tài)。

◆印跡前將含甲醛(變性劑)的凝膠用水沖洗掉，

再印跡、雜交。

◆如果測(cè)定RNA片段大小，可在同一塊膠上加

分子量標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物切

下、上色、照像，樣品膠則進(jìn)行Northern

轉(zhuǎn)印。

三、斑點(diǎn)雜交與狹縫雜交斑點(diǎn)雜交示意圖

斑點(diǎn)雜交不需電泳和轉(zhuǎn)膜過程，整個(gè)操作過程簡便、快速。但結(jié)果無法判斷核酸片段的大小，也無法判斷樣品溶液中是否存在著不同的靶序列，多用作核酸定性或半定量分析，而且便于雜交條件的摸索。

四、菌落雜交菌落雜交示意圖

五、原位雜交

原位雜交（Insituhybridization）是以特定標(biāo)記的已知序列的核酸分子作為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交并對(duì)其檢測(cè)的方法。

（一）基本方法1．細(xì)胞或組織切片的處理（1）玻片清洗（2）組織和細(xì)胞的固定應(yīng)用和選擇固定劑上需考慮以下因素:◆保持細(xì)胞形態(tài)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平◆探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織◆不影響核酸與探針的雜交

2.增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性

組織細(xì)胞中的核酸都以核蛋白復(fù)合體的形式存在于細(xì)胞漿或細(xì)胞核中，經(jīng)過固定過程后，胞漿或胞核內(nèi)生物大分子交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，影響探針的穿透和雜交體的形成。因此需要使用去污劑和蛋白酶對(duì)組織細(xì)胞蛋白進(jìn)行水解以去除核酸表面蛋白。

常用的去污劑：TritonX-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）常用的蛋白酶：蛋白酶K、胰蛋白酶、膠原蛋白酶等。去蛋白作用：可增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號(hào)，但同時(shí)也會(huì)減低RNA的量和影響組織細(xì)胞的形態(tài)，在實(shí)驗(yàn)過程中須根據(jù)組織種類、切片的厚度等因素經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定其適宜的濃度和消化時(shí)間，否則將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

3.預(yù)雜交（Prehybridization）

預(yù)雜交的目的與其它固相雜交相同，

將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非

特異性雜交位點(diǎn)的作用，從而降低背景染

色。

4.雜交（Hybridization）原位雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。雜交液的成分和預(yù)雜交液基本相同，其不同的是前者加入了標(biāo)記的核酸探針和硫酸葡聚糖。硫酸葡聚糖是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強(qiáng)的水合作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度，提高雜交率。

雜交過程中須注意的問題：

（1）探針的濃度

（2）探針的長度：50～100bp

（3）雜交的溫度和時(shí)間：Tm-25℃，3h

5.雜交后處理洗滌的條件包括鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時(shí)間，一般遵循的原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。值得注意的是在漂洗的過程中，切勿使切片干燥，否則反而會(huì)增強(qiáng)背景染色。

6.結(jié)果檢測(cè)根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類來選擇相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)。細(xì)胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進(jìn)行半定量的測(cè)定。

放射自顯影：可利用人工或計(jì)算機(jī)輔助的圖象分析檢測(cè)儀檢測(cè)銀粒的數(shù)量和分布的差異。

非放射性核酸探針雜交：可利用相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)顯色，然后利用圖像分析儀對(duì)不同類型和數(shù)量的核酸的顯色強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。需要注意的是：做半定量測(cè)定必須注意嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)的一致性。六、熒光原位雜交

熒光原位雜交

（fluorescencein-situhybridization,FISH）

是一種利用非放射性的熒光信號(hào)對(duì)原位雜交樣本進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。

（一）熒光素標(biāo)記檢測(cè)系統(tǒng)

1．生物素標(biāo)記探針與熒光素標(biāo)記的抗生物素或抗生物素抗體

2．地高辛標(biāo)記的抗體與熒光素標(biāo)記的抗地高辛抗體

3．氨乙酰基熒光（aminoacetylfluroence,AAF）-改良探針與抗AAF抗血清等。上述的檢測(cè)系統(tǒng)有直接法和間接法兩種，后者靈敏度更高

七、液相核酸分子雜交

原理是將待測(cè)核酸分子和核酸探針都游離在溶液中，在一定條件下進(jìn)行雜交。

（一）羥基磷灰石吸附雜交（二）親和吸附雜交（三）磁珠吸附雜交核酸分子雜交技術(shù)的應(yīng)用1、分子生物學(xué)研究領(lǐng)域：克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定位等。2、臨床疾病診斷方面：遺傳疾病的基因診斷、惡性腫瘤的基因分析、傳染病病原體的檢測(cè)、優(yōu)生優(yōu)育等。THANKS!CotanalysisofDNAreassociation不同物種DNA的Cot曲線什么是核酸分子雜交？

核酸分子雜交是利用DNA具有變性和復(fù)性的特性而建立起來的一種分子生物學(xué)技術(shù).其原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下根據(jù)堿基互補(bǔ)的原則可以形成雙鏈.

使具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度和離子強(qiáng)度等），按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則形成雙鏈雜交體的一類技術(shù)就稱為核酸分子雜交技術(shù)。用于定性或定量檢測(cè)特異RNA或DNA片段。從以下幾方面了解核酸雜交：第一節(jié)核酸分子雜交基本原理：核酸變性、復(fù)性及雜交概念第二節(jié)核酸探針：探針的設(shè)計(jì)、標(biāo)記、純化及檢測(cè)第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)：Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、斑點(diǎn)雜交、菌落雜交、原位雜交