第13章基因課件

第十三章

基因工程和分子生物學(xué)常用技術(shù)GeneticEngineeringand

ThePopularTechnologyInMolecularBiology第1節(jié)基因工程與基因重組GeneticEngineeringandrecombination一、基因工程的概念基因工程是將各種來源（內(nèi)、外）的原核、真核、天然或人工方法獲得目的基因，在體外與載體基因重組后，導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，DNA重組體隨著細胞增殖而擴增，再通過基因表達得到大量目的基因片段（分子克隆，clone）的技術(shù)?；蚬こ碳夹g(shù)是把不同來源的目的基因和載體DNA分子重新組合，故亦稱為重組DNA技術(shù)?；蚬こ趟囊?.目的基因2.工具酶3.載體4.受體細胞重要的工具酶

（1）限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）發(fā)現(xiàn)：

1968年，沃納·阿爾伯博士在研究噬菌體的遺傳現(xiàn)象時碰到一個奇怪的現(xiàn)象，當(dāng)新的大腸菌感染了噬菌體時，有的噬菌體開始繁殖，有的卻根本不繁殖。他決定先研究這種“限制性噬菌體感染現(xiàn)象”，第一次從大腸桿菌中提取出了限制性內(nèi)切酶，為此獲1978年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎。限制酶能在DNA上尋找特定的切點，將DNA分子的雙鏈交錯地切斷。因此限制性內(nèi)切酶又稱為“分子剪刀”，可以完整地切下個別基因。目前人們已經(jīng)分離提取了400多種“分子剪刀”，可以隨心所欲地進行DNA分子長鏈的切割。

沃納·阿爾伯博士1.限制性核酸內(nèi)切酶概念、特點識別DNA的特異序列并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸水解酶。是基因工程“分子刀”。特點：*切割DNA多聚核苷酸鏈中磷酸二酯鍵*具有回文結(jié)構(gòu)特征5′???GAATTC???3′3′???CTTAAG???5′2.限制性核酸內(nèi)切酶識別序列與切割產(chǎn)物限制性核酸內(nèi)切酶識別序列及切割位點切割產(chǎn)物形成末端EcoRⅠ3’黏性末端PstⅠ5’黏性末端NruⅠ平末端5’…G↓AATTC…3’5’…GAATTC…3’3’…CTTAA↑G…5’3’…CTTAAG…5’5’…CTGCA↓G…3’5’…CTGGAG…3’3’…G↑ACGTC…5’3’…GACGTC…5’5’…AG↓CT…3’5’…AGCT…3’3’…TC↑GA…5’3’…TCGA…5’注：具有黏性末端的DNA分子更容易結(jié)合進載體DNA分子中。（2）DNA聚合酶（DNApolymerase）以DNA為模板，dNTP為原料，RNA作引物，從引物的3’-末端或切口3’-末端沿5’→3’方向延長核苷酸鏈。該酶具有3’→5’或5’→3’核酸外切酶活性?；蚬こ讨饕獞?yīng)用E.coliDNA聚合酶Ⅰ、T4DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶等。（3）DNA連接酶（DNAligase）

1976年，科學(xué)家在5個實驗室里幾乎同時發(fā)現(xiàn)并提取出一種酶，這種酶可以將兩個DNA片段連接來，修復(fù)好DNA鏈的斷裂口。這種酶叫作DNA連接酶，是名符其實的“縫合”基因的“分子針線”。只要在用同一種“分子剪刀”剪切的兩種

DNA碎片中加上“分子針線”，就會把兩種DNA片段重新連接起來。慢病毒環(huán)繞雙鏈DNA的DNA連接酶（彩色部分）載體

能夠攜帶外源DNA片段進入受體細胞進行擴增和表達的運載工具。其化學(xué)本質(zhì)是DNA。易進入宿主細胞，并能在體內(nèi)繁殖。具有多克隆位點，易插入外源基因。有可供選擇的遺傳標記，能夠進行篩選。易從宿主細胞中分離純化。

常用載體：質(zhì)粒、噬菌體、黏粒、病毒。理想載體的選擇標準1.質(zhì)粒(plasmid)基因工程中最常見的載體。是細菌中獨立于染色質(zhì)以外的、能自主復(fù)制的環(huán)狀雙鏈DNA。通常質(zhì)粒的大小為2～300kb。一般只能容納10kb的外源DNA片斷。外源DNA片斷越長，越難插入和穩(wěn)定。2.噬菌體(bacteriophage，phage)寄生于細菌體內(nèi)，并能溶解細菌細胞。具有溶菌性和溶原性兩種不同的繁殖方式。λ噬菌體兩種生長途徑（示意圖）3.黏粒(cosmid)黏粒是將λ噬菌體的cos區(qū)與質(zhì)粒組合的裝配型載體。黏粒本身約4～6kb，可克隆DNA大片段，可用作建立真核基因組文庫的載體。4.病毒病毒載體更多地用于真核表達系統(tǒng)，如腺病毒、痘病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和猴空泡病毒。重組DNA技術(shù)的原理和工程DNA重組包括下列五個過程。1.制備目的基因2.目的基因與載體的連接3.將外源DNA或重組體導(dǎo)入受體細胞。4.目的基因的篩選和鑒定。5.克隆基因的表達。 1.目的基因的制備1）制備基因組DNA文庫

使用相同載體的一組基因的克隆。所有被克隆的DNA分子能表示整個生物的基因組。

有質(zhì)粒文庫、黏粒文庫、噬菌體文庫、酵母人造染色體文庫。2）制備cDNA文庫（3）聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等條件下，體外經(jīng)94℃變性、54℃退火及72℃延伸3個步驟的反復(fù)多次循環(huán)（2530次），擴增目的基因。（4）化學(xué)合成基因2、目的基因與載體的連接——基因工程的核心（主要有以下4種連接方式）1)粘性末端連接2）平頭末端連接3）人工接頭法4）同源多聚尾連接法3、重組DNA導(dǎo)入宿主細胞轉(zhuǎn)化：以質(zhì)粒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細胞的過程；感染：以病毒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細胞的過程4.重組DNA的篩選與鑒定：遺傳學(xué)、免疫學(xué)、分子雜交等5.克隆基因的表達基因工程的最終目的是通過載體將外源基因?qū)牒线m的宿主細胞中高效表達，產(chǎn)生有重要價值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品?；蚬こ痰闹饕襟E二、基因診斷和基因治療（一）基因診斷（DNAdiagnosis）基因診斷是采用分子生物學(xué)的技術(shù)方法直接檢測與分析基因的結(jié)構(gòu)（DNA）及其表達水平（RNA）是否正常，從而對疾病做出診斷的方法。

1.基因診斷特點：特異性強靈敏度高（選用特定基因序列作為探針，單拷貝基因采用高度擴增PCR技術(shù)）診斷范圍廣（可檢測正在生長的病原體或潛在病原體）。能對疾病早期進行診斷直接對表型疾病作出診斷，還可能發(fā)現(xiàn)潛在的致病因素，如:確定有遺傳病家族史的人攜帶致病基因。2.基因診斷的應(yīng)用1）病原微生物的侵入：病原體：病毒、支原體、細菌、寄生蟲。當(dāng)無抗體時，基因診斷成為唯一手段。2）先天性遺傳疾?。哼z傳性疾病。發(fā)病原因為特定基因突變。3）惡性腫瘤研究：個別細胞基因突變而引起的細胞無限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3.基因診斷的基本原理與方法

基因診斷的原理：用已知的核苷酸序列測定未知的核苷酸序列?；蛟\斷主要方法：核酸分子雜交、PCR技術(shù)、DNA序列測定、幾種技術(shù)手段聯(lián)合應(yīng)用等α-地中海型貧血癥（病例）

一對夫妻第一胎生一男孩，經(jīng)診斷為重型α-地中海型貧血癥，即HbHart’s胎兒水腫綜合癥。為常染色體隱性遺傳病。妻子又懷孕，夫妻想知道胎兒是否正常發(fā)育，欲做產(chǎn)前診斷。專家運用限制性內(nèi)切酶BamHI和BglⅡ分別酶切孕婦的外周血和胎兒絨毛組織DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，進行Southern印跡轉(zhuǎn)移后，再用32P標記的α-珠蛋白基因探針進行雜交。分析所得酶譜，檢測結(jié)果該胎兒為α-地中海貧血。（二）基因治療（genetherapuy)狹義的基因治療是指用完整的基因進行基因替代治療，是對缺陷的基因進行修復(fù)、矯正，或以正常功能的基因置換或增補缺陷基因的方法。治療途徑屬于體外（exvivo）基因治療。廣義的基因治療是指利用基因藥物的治療，是一種基于導(dǎo)入遺傳物質(zhì)以改變患者細胞的基因表達，從而達到治療或預(yù)防疾病的新措施。治病途徑屬于體內(nèi)（invivo）基因治療。

基因治療總策略1.直接補替缺陷基因；2.抑制非正常基因產(chǎn)物表達；3.間接調(diào)節(jié)機體本身免疫系統(tǒng)的抗病能力；4.利用外源基因?qū)Σ∽兗毎斐商禺愋詺?/p>

基因治療方法：①基因矯正（genecorrection）：即對缺陷基因的異常序列進行精確原位修復(fù)。②基因置換（genereplacement）：以正常功能基因原位置換異?；颍簧婕盎蚪M的任何改變。③基因增補（geneaugmentation）：不去除異常基因，而是通過外源基因的導(dǎo)入，使其表達正常產(chǎn)物，從而補償缺陷基因的功能。④基因失活（geneinactivation）：有些基因異常過度表達，如癌基因或病毒基因可導(dǎo)致疾病，可用反義核酸技術(shù)、核酶或誘餌轉(zhuǎn)錄因子來封閉或消除這些有害基因的活性表達。基因療法最重要的問題：理想載體的選擇

安全無毒害；不引起免疫反應(yīng)；高濃度或高滴度；能高效轉(zhuǎn)移外源基因；持續(xù)有效表達外源基因；可靶向特定組織細胞；可調(diào)控；容納外源基因可大可小；可供體內(nèi)注射（包括全身性靜脈注射）；便于規(guī)模生產(chǎn)供臨床應(yīng)用。

基因工程技術(shù)在分子醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用：①發(fā)現(xiàn)疾病基因。確定克隆基因在分子遺傳病中的作用。②發(fā)展生物制藥。利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)有藥用價值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品。己經(jīng)或正投入市場的基因工程產(chǎn)品有胰島素、生長素、促紅細胞生成素等。③基因診斷。④基因治療。⑤遺傳病的防治。利用基因工程技術(shù)可進行產(chǎn)前診斷、攜帶者測試、癥候前診斷、遺傳病易感性診斷等。第2節(jié)分子生物學(xué)常用技術(shù)

（一）概念用已知堿基的核酸序列作探針，檢測待測樣品中是否存在與探針互補的同源核苷酸序列的方法。

一、核酸分子雜交技術(shù)（nucleicacidhybridization）分子雜交的雙方：1、特異標記的探針。2、待測的核苷酸序列。核酸探針的概念：是指用放射性核素、生物素等活性物質(zhì)標記的，能與特定核酸序列發(fā)生特異性互補的已知DNA或RNA片段。理想探針的選擇方案①必須為單鏈結(jié)構(gòu)；②高度特異性，只與靶核苷酸序列雜交；③高度靈敏性；④標記物與探針結(jié)合后，決不能影響其堿基配對，及探針分子的理化性質(zhì)；⑤一般探針越長，雜交作用越強，專一性越強。但小片段探針雜交速率快。⑥環(huán)境污染小，價格低。探針種類：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、及人工合成的寡核苷酸探針等。（二）核酸分子雜交方法DNA印跡雜交（Southernblot）RNA印跡雜交（Northernblot）斑點及狹縫印跡雜交（Dot-blot）原位雜交(situhybridization)1.Souhern印跡雜交將電泳分離的待測DNA片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固相支持物上，再用標記的DNA探針檢測待測DNA的方法。主要檢測經(jīng)凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到膜上的DNA分子。Southern印跡雜交的基本過程：①待測核酸樣品的制備；②待測DNA樣品的電泳分離；③凝膠中核酸的變性（堿變性)；④Southern印跡Southern印跡法可用于克隆基因的酶切圖譜分析，檢測特異的DNA序列片斷、基因定位、分子量測定等，在分子克隆、遺傳病診斷、腫瘤研究、器官移植等方面發(fā)揮作用。

1975年,Southern印跡雜交（Southernblot）由英國人埃德溫·邁勒·薩瑟（EdwinMellorSouthern）創(chuàng)建。

Southern印跡雜交顯色圖片2.Northern印跡雜交

原理

Northern印記雜交亦稱為Northernblot，用于鑒別RNA的雜交。雜交的受體是RNA，探針可用DNA或RNA片段。其基本原理是將待測的RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，再與標記的探針進行固-液相雜交。3.斑點及狹縫印跡雜交

斑點雜交直接將變性的DNA或RNA樣品點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上使之成為斑點，再與探針進行雜交。斑點印跡為圓形，狹縫印跡為線狀。4.原位雜交（insituhybridization）

核酸保持在細胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處理細胞或組織后，將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交的方法。二、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)（一）概念聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR），又稱無細胞克隆技術(shù)(freebacteriacloningtechnique)，是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的技術(shù)。通過PCR技術(shù)，可以簡便快速地從微量生物材料中，以體外擴增的方式獲得大量特定的核酸序列。（二）PCR的工作原理

PCR是體外酶促反應(yīng)，依據(jù)DNA復(fù)制為理論基礎(chǔ)。PCR反應(yīng)體系：1.耐熱DNA聚合酶

（taqDNA聚合酶）常用從嗜熱水生菌分離出來的taqDNA聚合酶，在95℃高溫下依然有活性，最適溫度為70℃～80℃，不會在熱變性中失活，具有5’→3’聚合酶活性，5’→3’外切酶活性。2.DNA模板

微量待擴增的DNA片段，由組織細胞提取、mRNA反轉(zhuǎn)錄及人工合成。3.寡聚核苷酸引物根據(jù)被擴增的DNA兩側(cè)序列而人工合成，通常為20個堿基對左右。4.dNTP原料。即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，PCR操作時，4種dNTP必須以等摩爾配制，以降低出錯機率。5.含Mg2+的緩沖液

Mg2+是DNA聚合酶活性所必須的激活劑。PCR的基本步驟：1.高溫變性

高溫95℃，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板。變性時間30s。2.低溫退火

將反應(yīng)液溫度迅速降至低溫（37～55℃），兩條人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板鏈互補結(jié)合，形成部分雙鏈。退火時間30s。3.適溫延伸在最適溫度（72℃）下，TaqDNA聚合酶以引物3’-OH末端為合成的起點，催化4種dNTP沿模板5’→3’方向合成DNA新鏈。延伸時間約1.5min。所合成的DNA片段又可作為下一輪熱變性的模板。經(jīng)過25～30個循環(huán)后，理論上可使基因擴增109倍以上。聚合酶鏈反應(yīng)的基本步驟PCR技術(shù)具有簡單快捷、高度靈敏性和特異性，在病原體檢測與治療、遺傳及優(yōu)生優(yōu)育、腫瘤基因檢測、免疫檢測、司法鑒定等領(lǐng)域有重要應(yīng)用。三、DNA芯片技術(shù)

DNA芯片（DNAchip）技術(shù)隸屬于生物芯片技術(shù)。DNA芯片通過微加工技術(shù)，將數(shù)以百萬計特定序列的DNA片段（基因探針）有規(guī)律地排列，固定于2cm2的硅片、玻片等固相支